Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens zur Funktionalisierung von Glasoberflächen besteht darin, eine schonende Anreicherung und Freisetzung der gewünschten Zellen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorangiogenese zu beantworten und die Untersuchung von zellulären Biomarkern zu ermöglichen, die auf eine Arzneimittelresistenz hinweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie vollständig an nahezu jeden gewünschten Zelltyp anpassbar ist.

Solange ein Antikörper vorhanden ist, der spezifisch für den Zelltyp ist, kann die Oberfläche an dessen Erfassung angepasst werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Tumorangiogenese ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Erkrankungen anwenden, da gereinigte Proben für die Entwicklung individualisierterer Therapieregime erforderlich sind. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir versuchten, einen reversiblen Freisetzungsmechanismus zur Zellerfassung zu entwickeln, unter Nutzung der Wechselwirkung zwischen Desthiobiotin und der Avidin-Familie.

Nach der Reinigung einer Glasoberfläche in einer Sauerstoff-Plasma-Anlage für fünf Minuten gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie 2,5 Milliliter einer 2 %igen rekonstituierten 3-Aminopropyl-triethoxysilan- oder APTES-Lösung vor, indem Sie 50 Mikroliter APTES und 2,45 Milliliter Ethanol in einem kegelförmigen Reaktionsgefäß mischen. Geben Sie die APTES-Lösung mittels Pipette auf die Glasoberflächen, decken Sie die Oberflächen ab und stellen Sie sie für 50 Minuten auf einen Plattenschüttler bei Raumtemperatur, um die APTES-Schicht gleichmäßig zu verteilen. In der Zwischenzeit heizen Sie den Ofen auf 55 Grad Celsius für die 8- und 24-Loch-Platten oder auf 90 Grad Celsius für die Glasgefäße vor.

Nachdem die Platten aus dem Schüttler entfernt wurden, spülen Sie die Glasoberflächen gemäß dem Textprotokoll mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Oberflächen mit 100 % Stickstoffgas. Anschließend stellen Sie die Acht- und 24-Loch-Platten zwei Stunden lang in den Ofen, oder die Glasgefäße eine Stunde lang.

Bereiten Sie anschließend 2,5 Milliliter D-Desthiobiotin- oder DSB-Lösung vor, indem Sie 1,5 Milligramm pro Milliliter DSB in 37,5 Mikrolitern DMSO mischen und fünf Milligramm pro Milliliter EDC zu 2.462,5 Mikrolitern 0,1-molarer MES-Pufferlösung, pH 6, geben. Anschließend werden die beiden Lösungen vereinigt. Nach 15 Minuten wird ein Mikroliter BME zugegeben, um die Reaktion zwischen DSB und EDC abzubrechen.

Entfernen Sie die heißen, mit APTES funktionalisierten Glasoberflächen aus dem Ofen und lassen Sie sie fünf bis zehn Minuten abkühlen. Geben Sie MES-Puffer zu den Glasoberflächen, um sie abzuspülen, wobei Sie die Pipette in einem Winkel von 70 Grad halten, sodass die Spitze nicht direkt auf die Oberfläche zeigt. Danach geben Sie den Puffer an einer festen Stelle, beispielsweise an der Ecke des Wells, aus und ziehen ihn erneut auf.

Anschließend den MES-Puffer verwenden, um die Oberflächen zwei weitere Male zu spülen. DSB-Lösung auf die Glasoberflächen auftragen. Diese in eine feuchte Papierserviette in einer Petrischale überführen, die Schale abdecken und 18 bis 24 Stunden im Kühlschrank inkubieren.

Nach der Inkubation bei vier Grad Celsius jede Glasoberfläche dreimal mit PBS spülen, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Anschließend Streptavidin oder die SAV-Stammlösung auf 0,4 Milligramm pro Milliliter verdünnen und gleichmäßig auf die Glasoberflächen auftragen, sodass sich eine dünne Schicht bildet. Nach einer Inkubation der Glasoberflächen für 18 bis 24 Stunden jede Oberfläche mit 150 Mikroliter PBS dreimal spülen.

Befeuchten Sie dann ein Papierhandtuch mit entionisiertem Wasser und legen Sie es flach in eine 14 cm große Petrischale, um die Feuchtigkeit in den Vertiefungen zu halten. Decken Sie die Petrischale mit den Glasoberflächen ab und stellen Sie sie bis zur Verwendung in einen Kühlschrank der Biosicherheitsstufe 1 bei vier Grad Celsius. Um die Zellaufnahme durchzuführen, aspirieren Sie das Medium aus T175-Flaschen mit Zellen.

Spülen Sie die Zellen anschließend mit PBS und aspirieren Sie den Puffer. Geben Sie 10 Milliliter eines nicht-enzymatischen Löseagens, wie beispielsweise Cell Dissociation Solution, zum Kolben hinzu. Inkubieren Sie dann 6 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach sechs Minuten 10 Milliliter kaltes HBSS hinzufügen, um das Ablösemedium zu verdünnen. Anschließend 20 Mikroliter der Zellen abpipettieren und mit einem Hämozytometer zählen. Die Zellsuspension bei 500 × g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren.

Und resuspendieren Sie die Zellen in HBSS auf eine Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie die Zellen mehrmals auf und ab, um sie in Lösung zu resuspendieren und zelluläre Agglomerationen zu vermindern, die eine Antikörperbindung beeinträchtigen könnten. Anschließend teilen Sie die Zellsuspension in separate Kontroll- und Versuchslösungen auf.

Fügen Sie die biotinylierten Antikörper den jeweiligen Zellsuspensionen hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf einem End-over-End-Mischer bei vier Grad Celsius. Spülen Sie das funktionalisierte Glas in Acht-Well-Platten dreimal mit jeweils 150 Mikroliter HBSS, wie zuvor im Video gezeigt. Geben Sie die Zellsuspension in die Wells und inkubieren Sie 45 Minuten lang auf Eis im Schüttler.

Unterdessen eine 20 Millimolar starke Biotin-Lösung in sterilem HBSS herstellen. Danach nach der Inkubation vorsichtig 150 Mikroliter HBSS verwenden, um die Zelllösung vom Glas abzuspülen. Nachdem der Spülvorgang noch zweimal wiederholt wurde, jeweils 150 Mikroliter der Biotin-Lösung zu den entsprechenden Freisetzungs-Vertiefungen hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren, um die Reaktion ablaufen zu lassen.

Sammeln Sie unspezifisch gebundene Zellen durch Waschen der Zellen mit HBSS erneut ein. Fahren Sie anschließend gemäß dem Textprotokoll mit der Fluoreszenzbildgebung und -analyse fort. Schließen Sie Bilder lebender Zellen in einer Zellkulturschale als Kontrolle ein.

In diesem Experiment wurden MCF7GFP-Zellen einer funktionalisierten Oberfläche ausgesetzt. Mithilfe des HLA-ABC-Antikörpers wurden 60 % der Zellen eingefangen. Nach der Behandlung mit 20 Millimolar Biotin wurden 80 % der eingefangenen Zellen freigesetzt.

Wie hier gezeigt, wurden 50 % der RAW-Makrophagen erfasst, als die MCF7GFP-Zellen mit RAW 264,7-Zellen gemischt wurden, und die Zugabe von 20 Mikromolar Biotin setzte anschließend 80 % der erfassten RAW-Zellen frei. Diese Abbildung zeigt, dass die positiven Kontroll-Makrophagen RAW keine Fluoreszenzaktivität aufweisen. Die negativen Kontroll-MCF7GFP-Zellen hingegen sind positiv für GFP-Fluoreszenz.

Da ein Überschuss an Antikörpern die Zellbindung verringern kann, wurde die Antikörperkonzentration durch Titration von null bis 10.000 Nanogramm pro Milliliter HLA-Antikörper optimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die ideale Antikörperkonzentration zwischen 100 und 1.000 Nanogramm pro Milliliter liegt. Zusätzlich ergaben Zelloptimierungsversuche, dass die ideale Konzentration an gebundenen Zellen zwischen 1 × 10⁵ und 1 × 10⁶ Zellen liegt, da Mengen unterhalb dieser Zahl unterhalb des Hintergrunds liegen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden, wobei die experimentelle Arbeitszeit weniger als sechs Stunden beträgt, ohne die Übernach-Inkubationen einzubeziehen. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellwaschungen während der Experimente zu sammeln, da sie wichtige Informationen über die Wirksamkeit der Oberfläche liefern können. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, beispielsweise bezüglich der Expressionslevel bestimmter Rezeptoren in den Zellen von Interesse.

Nach ihrer Entwicklung hat die Oberflächenfunktionalisierung Forschern auf dem Gebiet der Biomaterialien den Weg geebnet, die biosichere Integration von Materialien wie Implantaten bei einer Vielzahl von Erkrankungen und Verletzungen zu erforschen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glasoberflächen oberflächenfunktionalisiert, um Zellen von Interesse zu binden und wieder freizusetzen, was eine anschließende Analyse ermöglicht. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Zellen in Natriumazid äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie eine angemessene Schulung, persönliche Schutzausrüstung und ordnungsgemäße Entsorgung stets beachtet werden müssen, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.