Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Prozesses zur Funktionalisierung von Glasoberflächen ist es, das schonende Einfangen und Freisetzen von interessierenden Zellen zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Tumorangiogenese zu beantworten und ermöglicht das Screening von Zellbiomarkern, die auf eine Arzneimittelresistenz hinweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für praktisch jeden Zelltyp von Interesse vollständig anpassbar ist.

Solange ein für den Zelltyp spezifischer Antikörper vorhanden ist, kann die Oberfläche für dessen Einfang angepasst werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Angiogenese von Krebs geben kann, kann sie auch auf andere Krankheiten angewendet werden, da gereinigte Proben für die Entwicklung personalisierterer Behandlungsschemata erforderlich sind. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, einen reversiblen Freisetzungsmechanismus für das Einfangen von Zellen zu entwickeln, indem wir die Wechselwirkung zwischen Desthiobiotin und der Adivin-Familie nutzten.

Nach der Reinigung einer Glasoberfläche in einer Sauerstoffplasmamaschine für fünf Minuten gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie 2,5 Milliliter 2%iges rekonstituiertes 3-Aminopropyltriethoxysilan oder APTES-Lösung vor, indem Sie 50 Mikroliter APTES und 2,45 Milliliter Ethanol in einem konischen Röhrchen kombinieren. Pipettieren Sie die APTES-Lösung auf die Glasoberflächen, decken Sie die Oberflächen ab und legen Sie sie 50 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Plattformschüttler, um die APTES-Schicht gleichmäßig zu verteilen. In der Zwischenzeit den Backofen für die Acht- und 24-Well-Platten auf 55 Grad Celsius vorheizen, für die Glasformen auf 90 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Platten aus dem Shaker genommen haben, verwenden Sie Ethanol, um die Glasoberflächen gemäß dem Textprotokoll zu spülen. Mit 100%igem Stickstoffgas die Oberflächen trocknen. Dann stellen Sie die Acht- und 24-Well-Platten für zwei Stunden in den Ofen oder die Glasformen für eine Stunde in den Ofen.

Als nächstes bereiten Sie 2,5 Milliliter d-Desthiobiotin oder DSB-Lösung vor, indem Sie 1,5 Milligramm pro Milliliter DSB in 37,5 Mikroliter DMSO mischen und fünf Milligramm pro Milliliter EDC zu 2.462,5 Mikrolitern 0,1 molaren MES-Puffer, pH 6, hinzufügen. Kombinieren Sie dann die beiden Lösungen. Nach 15 Minuten fügen Sie einen Mikroliter BME hinzu, um die Reaktion zwischen DSB und EDC zu löschen.

Nehmen Sie die heißen APTES funktionalisierten Glasflächen aus dem Ofen und lassen Sie sie fünf bis 10 Minuten abkühlen. Geben Sie MES-Puffer auf die Glasoberflächen, um sie zu spülen, indem Sie die Pipette in einem 70-Grad-Winkel halten, so dass die Spitze nicht direkt auf die Oberfläche zeigt. Entleeren und ziehen Sie dann den Puffer von einem festen Punkt, z. B. der Ecke des Brunnens.

Verwenden Sie dann den MES-Puffer, um noch zwei Mal zu spülen. DSB-Lösung auf die Glasoberflächen auftragen. Lege sie auf ein feuchtes Papiertuch in einer Petrischale, decke die Schale ab und inkubiere sie 18 bis 24 Stunden lang im Kühlschrank.

Nach der Inkubation bei vier Grad Celsius spülen Sie mit PBS jede Glasoberfläche dreimal aus, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Verdünnen Sie dann Streptavidin oder SAV-Stammlösung auf 0,4 Milligramm pro Milliliter und tragen Sie es gleichmäßig auf die Glasoberflächen auf, so dass sich eine dünne Schicht bildet. Nachdem Sie das Glas 18 bis 24 Stunden lang inkubiert haben, verwenden Sie 150 Mikroliter PBS, um jede Oberfläche dreimal zu spülen.

Befeuchten Sie dann ein Papiertuch mit entionisiertem Wasser und legen Sie es flach in eine 14 Zentimeter große Petrischale, die die Platten umgibt, um die Feuchtigkeit in den Vertiefungen zu halten. Decken Sie die Petrischale mit den Glasflächen ab und stellen Sie sie bis zur Verwendung in einen Kühlschrank der Biosicherheitsstufe 1 mit vier Grad Celsius. Um die Zelleinfangung durchzuführen, wird das Medium aus T175-Zellkolben aspiriert.

Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen zu spülen und den Puffer abzusaugen. 10 Milliliter nicht-enzymatisches Auftriebsmittel, wie z. B. Zelldissoziationslösung, werden in den Kolben gegeben. Dann bei 37 Grad Celsius sechs Minuten lang inkubieren.

Fügen Sie nach sechs Minuten 10 Milliliter kaltes HBSS hinzu, um das Auftriebsmittel zu verdünnen. Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter der Zellen und verwenden Sie ein Hämozytometer, um sie zu zählen. Die Zellsuspension wird bei 500 x g bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugiert.

Und verwenden Sie HBSS, um die Zellen auf eins mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu resuspendieren. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen in Lösung zu resuspendieren und die Zellverklumpung zu reduzieren, die die Antikörperbindung verringern kann. Teilen Sie dann die zelluläre Suspension in separate Kontroll- und Versuchslösungen auf.

Geben Sie die biotinylierten Antikörper in die jeweiligen Zelllösungen und inkubieren Sie auf einem End-over-End-Mischer bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Verwenden Sie 150 Mikroliter HBSS, um das funktionalisierte Glas in Acht-Well-Platten dreimal zu waschen, wie weiter oben im Video gezeigt. Geben Sie die Zelllösung in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang auf Eis auf dem Shaker.

In der Zwischenzeit bereiten Sie eine 20 millimolare Lösung von Biotin in sterilem HBSS vor. Verwenden Sie dann nach der Inkubation vorsichtig 150 Mikroliter HBSS, um die Zelllösung aus dem Glas zu spülen. Nachdem Sie das Spülen noch zwei Mal wiederholt haben, geben Sie 150 Mikroliter der Biotinlösung in die jeweilige Freisetzungsvertiefung und inkubieren Sie 20 Minuten lang, damit die Reaktion fortgesetzt werden kann.

Sammeln Sie unspezifisch gebundene Zellen, indem Sie HBSS verwenden, um die Zellen zu waschen. Fahren Sie dann mit der Fluoreszenzbildgebung und -analyse gemäß dem Textprotokoll fort. Fügen Sie Bilder lebender Zellen in einen Kolben als Kontrolle ein.

In diesem Experiment wurden MCF7GFP Zellen der funktionalisierten Oberfläche ausgesetzt, wobei 60% der Zellen mit dem HLA-ABC-Antikörper eingefangen wurden. Bei Exposition gegenüber 20 millimolarem Biotin wurden 80 % der gefangenen Zellen freigesetzt.

Wie hier gezeigt, wurden beim Mischen der MCF7GFP Zellen mit RAW 264.7-Zellen 50 % der RAW-Makrophagen eingefangen, und die Zugabe von 20 mikromolaren Biotin setzte anschließend 80 % der gefangenen RAW-Zellen frei. Diese Abbildung zeigt, dass die Positivkontroll-RAW-Makrophagen keine Fluoreszenzaktivität aufweisen. Die Negativkontrolle MCF7GFP Zellen ist jedoch positiv für die GFP-Fluoreszenz.

Da überschüssiger Antikörper die Zelleinnahme verringern kann, wurde die Antikörperkonzentration durch Titration von null auf 10.000 Nanogramm pro Milliliter HLA-Antikörper optimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die ideale Antikörperkonzentration zwischen 100 und 1.000 Nanogramm pro Milliliter lag. Darüber hinaus wurde in Zelloptimierungsexperimenten festgestellt, dass die ideale Konzentration von Zellen, die gefangen werden können, zwischen eins mal 10 bis zur fünften und eins mal 10 bis zur sechsten zelle liegt, da Mengen unter dieser Anzahl niedriger sind als der Hintergrund.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, mit weniger als sechs Stunden Versuchszeit, die Inkubationen über Nacht nicht eingerechnet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellwaschungen während der Experimente zu sammeln, da sie wichtige Informationen über die Wirksamkeit der Oberfläche geben können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Rezeptorexpressionsniveaus die interessierenden Zellen haben könnten.

Nach ihrer Entwicklung hat die Oberflächenfunktionalisierung den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biomaterialien geebnet, um die biosichere Integration von Materialien, wie z. B. Implantaten bei Patienten für eine Vielzahl von Krankheiten und Verletzungen, zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Glasoberflächen oberflächenfunktionalisieren können, um interessante Zellen zu erfassen und freizusetzen, was eine nachgelagerte Analyse ermöglicht. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Zellen in Natriumazid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie angemessene Schulung, PSA und Entsorgung getroffen werden sollten.