Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Generierung und Identifizierung von in vitro kultivierten Riesenphagozyten, die aus zirkulierenden humanen Neutrophilen gewonnen wurden, um ihre Rolle bei entzündlichen und entzündungshemmenden Immunantworten zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um eine neue Subpopulation von Riesenphagozyten zu gewinnen und zu identifizieren, die sich aus menschlichen Neutrophilen entwickeln, um langfristige Kulturbedingungen aufrechtzuerhalten. Diese Technik kann verwendet werden, um die Bedeutung und Funktionen von Riesenphagozyten weiter zu untersuchen und Schlüsselfragen zu ihrer Aktivierung und Plastizität zu beantworten.

Das Verfahren wird von Eva Leder, unserer wissenschaftlichen Mitarbeiterin, und Oksana Rogovoy, Postdoktorandin, beide aus meinem Labor, demonstriert. Verwenden Sie ein steriles Kopfhautvenen-Set, um mindestens 40 Milliliter venöses Blut von einem gesunden jungen Freiwilligen zu gewinnen. Mischen Sie dann das Blut vorsichtig in einer Biosicherheits-Laminal-Flow-Haube.

Verdünnen Sie 10 bis 12 Milliliter Aliquots der Vollblutprobe auf ein Endvolumen von 24 Millilitern mit vorgewärmtem IONEN-freiem PBS, das 2 % hitzeinaktiviertes FCS enthält. Geben Sie dann 12 % Milliliter Polysaccharose 1119 auf den Boden eines sterilen konischen Zentrifugenröhrchens aus 50 Millilitern Polypropylen pro Blutprobenaliquot, gefolgt von der sorgfältigen Schichtung von 12 Millilitern Polysaccharose 1077 auf der Polysaccharose 1119 Gradientenlösung. 24 Milliliter des verdünnten Blutes werden vorsichtig in einzelne Röhrchen der Dichtegradientenlösungen pipetiert und die Zellen durch Zentrifugation getrennt.

Es sollten zwei undurchsichtige Schichten beobachtet werden. Entsorgen Sie die Flüssigkeit bis zu 0,5 Zentimeter über der mononukleären Zellschicht in jedem Röhrchen. Übertragen Sie dann die mononukleären Zellen aus jeder Probe in ein einzelnes neues Röhrchen.

Entsorgen Sie anschließend die verbleibende Flüssigkeit bis zu 0,5 Zentimeter über der polymorphkernigen Zell- oder PMN-Schicht und überführen Sie die PMNs aus jeder Probe in ein anderes neues Röhrchen. Waschen Sie die PMNs in einem Endvolumen von 30 Millilitern PBS, das 2 % hitzeinaktiviertes FCS enthält, gefolgt von der Lyse der roten Blutkörperchen mit drei Millilitern sterilem, eiskaltem, hypotonischem 0,2 % Natriumchlorid. Stellen Sie nach 30 Sekunden auf Eis die Isotonie mit drei Millilitern sterilem, eiskaltem 1,6%igem Natriumchlorid wieder her.

Fügen Sie dann sechs Milliliter 37 Grad Celsius RPMI 1640 Medium hinzu, ergänzt mit hitzeinaktiviertem FCS, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern RPMI 1640, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS. Nach der Zählung wird die Konzentration auf 1,25 bis 1,5 mal 10 bis sechste PMN pro Milliliter Kulturmedium eingestellt und ein Milliliter Zellen pro Well in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte gefüllt.

Stellen Sie dann die Platte in einen befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und füttern Sie die Kulturen, indem Sie alle drei Tage die Hälfte des Mediums vorsichtig durch frisches RPMI 1640 Medium ersetzen, das mit 10% hitzeinaktiviertem FCS ergänzt wird. Die Neutrophilen differenzieren sich innerhalb von sieben Tagen nach der Kultur zu riesigen Fresszellen. Entfernen Sie am siebten Tag der Kultivierung vorsichtig die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung.

Pipettieren Sie dann das restliche Medium robust, um die leicht anhaftenden Riesenfresszellen zu entfernen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen aus zwei bis vier Vertiefungen jeder Behandlungsgruppe in einzelne konische 15-Millimeter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, wobei die Pellets in 100 bis 120 Mikrolitern Medium pro Röhrchen resuspendiert werden. Bestücken Sie anschließend zwei bis drei Halter pro Behandlungsgruppe mit Objektträgern, Filterkarten und Trichtern.

Geben Sie anschließend das gesamte Zellvolumen aus jedem Röhrchen in den entsprechenden Cytospin-Trichter. Laden Sie dann die Halterungen auf einen Cytospin und drehen Sie die Zellen auf die Objektträger. Trocknen Sie die gesponnenen Objektträger 10 Minuten lang.

Ziehen Sie dann mit einem wasserstabilen Marker eine hydrophobe Barriere um die Zellen und fixieren Sie die Proben mit 4%Paraformaldehyd unter einer chemischen Haube bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Objektträger nach 10 Minuten dreimal kurz mit ca. 100 Mikrolitern PBS pro Waschgang aus. Permeabilisieren Sie dann die Zellen mit 0,5 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von fünf PBS-Wäschen, wie gerade gezeigt.

Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 10 % normalem Ziegenserum in RPMI 1640 Medium für den entsprechenden Zeitraum, gefolgt von einer einmaligen PBS-Wäsche. Geben Sie nun eine kleine Menge Wasser in die Box, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und markieren Sie die Zellen dann über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten dunklen Kammer mit etwa 100 Mikrolitern des entsprechenden Primärantikörpers. Führen Sie anschließend eine einmalige PBS-Wäsche durch und fügen Sie dann den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörper hinzu.

Waschen Sie die Proben nach 40 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, um den überschüssigen Antikörper zu entfernen, und montieren Sie die Objektträger mit einem Tropfen Eindeckmedium pro Probe und einem Deckglas. Analysieren Sie die Objektträger durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie innerhalb von 30 bis 120 Minuten unter einem 40-fachen Immersionsölobjektiv. Berechnen Sie dann die Zellfläche, die Fluoreszenzintensität und die Co-Lokalisierung mit der entsprechenden Software.

Die Entwicklung von Neutrophilen zu riesigen Fresszellen innerhalb von sieben Tagen nach der Kultur ist auf diesen Bildern zu beobachten. Die Autophagozytose zeigt sich bereits 90 Minuten nach der Neutrophilenkultur mit fluoreszierenden Membranfärbungen mit einem stark vergrößerten Zelldurchmesser, der an den Tagen vier bis sieben sichtbar ist. Werden die Neutrophilenkulturen jedoch mit GM-CSF und IL-4 ergänzt, weisen die Zellen einen insgesamt geringeren Durchmesser und zytoplasmatische Projektionen auf, die dendritischen zellähnlichen Zellen ähneln.

Die Zeitraffermikroskopie der Riesenphagozyten an den Kulturtagen drei bis vier und vier und vier bis fünf zeigt keine oder nur leicht anhaftende Zellen mit eingeschränkter Bewegungskapazität, die die umliegenden neutrophilen Überreste und Trümmer aktiv aufnehmen. In dieser gemischten Monozyten-Neutrophilenkultur kann die Wanderung eines aktiv kriechenden Makrophagen mit der nahezu stationären Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Riesenphagozyten in der gleichen Kulturvertiefung verglichen werden. Der neutrophile Ursprung von Riesenphagozyten kann durch ihre positive Expression von no-neutrophilen Markern und ihre fehlende Expression von monozytären und dendritischen Zellmarkern verifiziert werden.

Riesenphagozyten erzeugen auch basale reaktive Sauerstoffspezies und reagieren auf Zymosan- und PMA-Stimulation mit oxidativem Burst. Im Gegensatz zu Monozyten oder Neutrophilen reagieren sie jedoch auch mit oxidativen Ausbrüchen auf oxidierte Lipoprotein-Stimulation niedriger Dichte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis sieben Tagen abgeschlossen werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Hälfte des Mediums vorsichtig auszutauschen, wenn die Neutrophilenkulturen gefüttert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Färbetechniken durchgeführt werden, um Fragen zu den zusätzlichen Funktionen dieser faszinierenden Zellen sowohl in vitro als auch in vivo zu beantworten. Diese Technik könnte Forschern auf dem Gebiet der Neutrophilenbiologie den Weg ebnen, die Aktivierung und Plastizität von Neutrophilen zu erforschen und diese Zellen in vivo unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen beim Menschen zu identifizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Riesenphagozyten in Kultur erhalten und identifizieren können. Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut potenziell infektiös sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Entsorgen aller Flüssigkeiten und die Verwendung von Einweggeräten in den entsprechenden Behältern für biologische Gefahrstoffe bei der Durchführung dieses Verfahrens ein Muss sind.