Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Diese Handschrift beschreibt eine einfache Methode, um die phagosomalen und pH-Bereich sowie die cytoplasmatische pH von menschlichen und Maus-Neutrophilen unter Verwendung des ratiometrischen Indikatoren seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, oder S-1 zu messen. Dies wird in lebenden Zellen konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse erreicht werden.

Das übergeordnete Ziel dieser konfokalen Mikroskopietechnik ist es, den pH-Wert und die Fläche der neutrophilen phagozytären Vakuole und des Zytoplasmas abzubilden. Diese Methode ermöglicht die Überwachung und Quantifizierung dynamischer Veränderungen des pH-Werts in der phagozytären Vakuole und im Zytoplasma sowie des Volumens der phagozytären Vakuole. Diese Messungen ändern sich mit der Aktivität der NADPH-Oxydase und können als Surrogatmarker für ihre Funktion und für Ionenflüsse durch die Membran der phagozytären Vakuole verwendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl das Phagosom als auch das Zytoplasma gleichzeitig mit einem Farbstoff abgebildet werden können, der einen weiten pH-Bereich aufweist. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein Aliquot von Carboxy-S-1-Succinimidylester vor, indem Sie 50 Mikrogramm davon in 100 Mikrolitern hochwertigem DMSO verdünnen. Strudel gut zum Mischen.

Bereiten Sie anschließend einen Milliliter von einmal 10 bis zur achten Hitze abgetötet oder HK Candida in 0,1 molaren Natriumbicarbonat in einer 15 Milliliter Tube zu. Geben Sie 100 Mikroliter Carboxy-S-1 tropfenweise in die HK Candida, während Sie auf einem Wirbel bei 2.000 U/min mischen. Wickeln Sie danach die Tube mit Alufolie ein und legen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine Rolle.

Waschen Sie den HKC-S-1 nach einer Stunde dreimal durch Zentrifugation bei 2, 250 mal g für jeweils 10 Minuten. Für die ersten beiden Wäschen resuspendieren Sie das Pellet in 15 Millilitern 0,1 molaren Natriumbicarbonat. Nach der dritten Wäsche suspendieren Sie es wieder in einem Milliliter BSS-Puffer.

Übertragen Sie die HKC-S-1-Suspension in die Röhrchen mit 100 Mikrolitern Aliquoten und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Um HKC-S-1 für humane Neutrophile zu opsonisieren, fügen Sie 100 Mikroliter humanes IGG-Serum zu 100 Mikrolitern aufgetautem HKC-S-1 hinzu. Mischen Sie es auf einem Hitzeschüttler bei 37 Grad Celsius und 1.1000 U/min für 60 bis 90 Minuten und dann auf einer Walze bei vier Grad Celsius für zwei Stunden.

Danach wird die Probe dreimal in BSS-Puffer durch Zentrifugation bei 17.000 g für jeweils eine Minute gewaschen. Anschließend wird die Probe in 100 Mikrolitern BSS-Puffer erneut suspendiert. Bei Neutrophilen aus dem peripheren Blut des Menschen entnehmen Sie einem gesunden Spender 15 Milliliter Blut durch Venenpunktion und überführen Sie es in eine 20-Milliliter-Spritze mit 90 Mikrolitern Heparinnatriumlösung zu 1.000 IE pro Milliliter.

Injizieren Sie mit einer Pipettenspitze 1,5 Milliliter 10%ige Dextranlösung in die Spritze. Drehen Sie es dreimal vorsichtig um und lassen Sie es dann 30 bis 60 Minuten lang aufrecht auf der Bank stehen. Nach 30 bis 60 Minuten sollte sich das Blut grob in zwei Hälften teilen, mit einer strohgelben oberen Buffy-Fellschicht und einer unteren Schicht mit Erythrozyten.

Schieben Sie die oberste Schicht vorsichtig durch eine Nadel heraus oder entfernen Sie sie mit einer Pipettenspitze, geben Sie sie dann in ein 15-Milliliter-Röhrchen und vermeiden Sie es, die rote Schicht herauszunehmen. Geben Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette drei bis vier Milliliter Dichtegradientenmedium auf den Boden des Röhrchens, unterhalb der Buffy-Coat-Schicht, um zwei unterschiedliche Schichten zu erhalten. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 900 mal g.

Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das rote Kügelchen zurück. Anschließend vorsichtig vortexen, um das Pellet zu stören. Geben Sie dann sieben Milliliter destilliertes autoklaviertes Wasser in das Pellet und drehen Sie es 20 Sekunden lang um, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Fügen Sie danach sieben Milliliter 2x Kochsalzlösung hinzu und invertieren Sie sie einige Male, um sie zu mischen, lysieren Sie die restlichen roten Blutkörperchen und zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 300-mal g. Gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Pellet wieder in BSS-Puffer auf etwa viermal 10 bis sechs pro Milliliter. Bei diesem Verfahren wird eine Mikroskopieplatte mit acht Vertiefungen mit 200 Mikrolitern Poly-L-Lysin in jeder Vertiefung 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur vorbehandelt, dann das Poly-L-Lysin entfernt und die Vertiefungen zweimal mit 200 Mikrolitern destilliertem Wasser gewaschen.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie danach ein Aliquot von S-1-AM-Ester vor, indem Sie 100 Mikroliter hochwertiges DMSO in ein Röhrchen geben und zum Mischen vortexen. In ein kleines Röhrchen 1,7 Milliliter BSS-Puffer und 20 Mikroliter S-1-AM geben und die Mischung vortexen.

Waschen Sie anschließend die Vertiefungen zweimal mit 200 Mikrolitern BSS-Puffer und ersetzen Sie den Puffer durch S-1-AM-Lösung. Achten Sie darauf, die am Boden der Vertiefung befestigte Zellmonoschicht nicht zu stören, indem Sie die Flüssigkeit vorsichtig an der Wand der Vertiefungen entlang pipettieren. Anschließend wird die Probe mindestens 25 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Waschen Sie die Vertiefungen anschließend zweimal mit 200 Mikrolitern BSS-Puffer. Um einen Inhibitor zu testen, stellen Sie einen Mastermix des entsprechenden Medikaments in BSS-Puffer zusammen und waschen Sie die Vertiefungen zweimal damit. Als nächstes beschallen Sie das opsonisierte HKC-S-1 etwa drei Sekunden lang bei fünf Mikrometern und fügen Sie 10 Mikroliter davon in jede Vertiefung hinzu, dann inkubieren Sie die Platte 15 bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, so dass die Zellen für Schnappschüsse der Phagozytose abgebildet werden können.

Stellen Sie mit einem konfokalen Mikroskop die Wellenlänge des Lasers so ein, dass die Zellen bei 555 Nanometern angeregt werden und die Emission von zwei Detektoren bei 560 bis 600 Nanometern und über 610 Nanometern detektiert wird. Betrachten Sie als Nächstes die Zellen mit einer 63-fachen Ölimmersionslinse. Verwenden Sie die Einstellung Kachel-Scan-Bild in fortlaufender Einstellung, um die mittlere Kachel anzuzeigen.

Passen Sie anhand der Fluoreszenzintensität und der Verstärkung der Detektorkanäle den Fokus und die Intensität des Lasers sowie die Verstärkung der beiden Kanäle an, um das Bild zu optimieren. Teilen Sie danach das Bild mit den Einstellungen, um beide Kanäle anzuzeigen. Prüfen Sie vor Beginn des Experiments, ob es keine Sättigung der Fluoreszenzintensität im Zytoplasma oder in den Vakuolen gibt, die als rote Punkte erscheinen würden.

Wenn ja, reduzieren Sie die Laserintensität so, dass eine minimale Anzahl von roten Punkten vorhanden ist, die Zellen und Phagosomen jedoch hell und klar genug sind, um sie zu sehen. Öffnen Sie in diesem Verfahren ImageJ und laden Sie die für die Analyse ausgewählte Bilddatei in die Symbolleiste. Um die beiden Kanäle zu kombinieren, verwenden Sie "Bild", "Farbe" und dann "Zusammengesetzt".

Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um eine Datei zum Speichern der Ergebnisse auszuwählen. Klicken Sie anschließend auf das Linienwerkzeug in der Symbolleiste und doppelklicken Sie, um die Breite auf zwei zu erhöhen. Zeichnen Sie eine Linie über die Breite eines Phagosoms und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um den pH-Wert zu messen.

Der zytoplasmatische pH-Wert kann auf die gleiche Weise gemessen werden, indem eine Linie durch das Zytoplasma gezogen wird. Nachdem Sie die Messungen abgeschlossen haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Datei speichern auszuwählen. Um den Phagosomenbereich zu messen, verwenden Sie das vierte Symbol in der Symbolleiste, um freihändig um den Bereich herum zu zeichnen.

Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste, um Messbereich auszuwählen. Hier ist ein qualitativer visueller Schlüssel der ungefähren Farbe der S-1-gefärbten Phagosomen, die dem pH-Wert entspricht. Die gelbe Farbe zeigt einen höheren Säuregehalt an, während rot einen höheren Säuregehalt anzeigt.

Dieses Bild zeigt mausgebundene Knochenmarkneutrophile, denen der Hvcn1-Kanal 20 Minuten nach der Phagozytose fehlt. Die Phagosomen erscheinen sehr rot, alkalisch und geschwollen. Der rote Pfeil zeigt hier auf eine intrazelluläre Candida, während dieser Pfeil auf eine extrazelluläre Candida zeigt.

Dieses Bild zeigt neutrophile Wildtyp-Maus-Knochenmarkneutrophile, die Candida aufgenommen haben. Sie sind viel weniger alkalisch als Hvcn1-Knockout-Neutrophile. Dieses Bild zeigt humane Neutrophile im peripheren Blut zum gleichen Zeitpunkt nach der Phagozytose.

Sie erscheinen etwas alkalischer als die Wildtyp-Zellen der Maus, aber die Phagosomen sind immer noch nicht so groß und rot wie die Hvcn1-Knockout-Zellen, und dieses Bild zeigt menschliche Neutrophile, die Candida in Gegenwart von fünf mikromolaren Diphenylen-Jodonium phagozytiert haben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig zu sein, wenn Sie die Neutrophilen isolieren, damit sie nicht aktiviert werden.

Um festzustellen, ob die Auswirkungen, die man auf Veränderungen des vakuolären oder zytosolischen pH-Werts oder des vakuolären Volumens sieht, auf Veränderungen des Atemausbruchs zurückzuführen sind, kann dieser Atemausbruch auf andere Weise gemessen werden, die die Produktion freier Radikale oder den Sauerstoffverbrauch direkt messen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Neutrophile isoliert und dann das Phagosom und das Zytoplasma färbt und abbildet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Blutproben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzkleidung getroffen werden sollten.