Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Das übergeordnete Ziel dieser konfokalen Mikroskopietechnik besteht darin, den pH-Wert und die Fläche des phagozytischen Vakuols sowie des Zytoplasmas von Neutrophilen abzubilden. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung dynamischer pH-Änderungen im phagozytischen Vakuol und im Zytoplasma sowie des Volumens des phagozytischen Vakuols. Diese Messgrößen verändern sich in Abhängigkeit von der Aktivität der NADPH-Oxidase und können als indirekte Marker für deren Funktion sowie für den Ionenfluss über die Membran des phagozytischen Vakuols dienen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl das Phagosom als auch das Zytoplasma gleichzeitig mit einem Farbstoff, der einen weiten pH-Bereich abdeckt, abgebildet werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Aliquot aus Carboxy-S-1-Succinimidester vor, indem Sie 50 Mikrogramm davon in 100 Mikroliter hochreinem DMSO verdünnen. Vortexen Sie die Lösung gründlich, um sie zu mischen.

Bereiten Sie anschließend ein Milliliter einer 1 × 10⁸ verdünnten hitzeinaktivierten oder HK-Candida-Lösung in 0,1 molarer Natriumbicarbonatlösung in einem 15-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie 100 Mikroliter Carboxy-S-1 tropfenweise unter Vortexen bei 2.000 U/min zur HK-Candida-Lösung hinzu. Danach umwickeln Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie und stellen es eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Rollapparat.

Nach einer Stunde das HKC-S-1 dreimal durch Zentrifugation bei 2.250 × g über jeweils 10 Minuten waschen. Bei den ersten beiden Waschschritten das Pellet in 15 Milliliter 0,1 molarer Natriumbicarbonat-Lösung resuspendieren. Nach der dritten Wäsche in ein Milliliter BSS-Puffer resuspendieren.

Überführen Sie die HKC-S-1-Suspension in Röhrchen zu je 100 Mikroliter-Aliquoten und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius. Um HKC-S-1 für humane Neutrophile zu opsonisieren, geben Sie 100 Mikroliter humanen IgG-Serums zu 100 Mikrolitern aufgetautem HKC-S-1 hinzu. Mischen Sie die Probe 60 bis 90 Minuten lang in einem Heizrüttler bei 37 Grad Celsius und 1.100 U/min und anschließend zwei Stunden lang auf einem Rollapparat bei vier Grad Celsius.

Anschließend die Probe dreimal durch Zentrifugation bei 17.000 × g für jeweils eine Minute in BSS-Puffer waschen. Danach die Probe in 100 Mikrolitern BSS-Puffer erneut suspendieren. Für humane periphere Blutneutrophile 15 Milliliter Blut mittels Venenpunktion von einem gesunden Spender entnehmen und in eine 20-Milliliter-Spritze überführen, die 90 Mikroliter Natriumheparinlösung mit 1.000 IE pro Milliliter enthält.

Mit einer Pipettenspitze 1,5 Milliliter einer 10 %igen Dextranlösung in die Spritze injizieren. Die Spritze vorsichtig dreimal umdrehen und dann 30 bis 60 Minuten lang aufrecht stehend auf dem Laborpult stehen lassen. Nach 30 bis 60 Minuten sollte sich das Blut ungefähr zur Hälfte geteilt haben, mit einer oberen, strohfarbenen Buffy-Coat-Schicht und einer unteren Schicht, die Erythrozyten enthält.

Schieben Sie vorsichtig die obere Schicht durch eine Nadel oder entfernen Sie sie mit einer Pipettenspitze und überführen Sie sie anschließend in ein 15-Milliliter-Röhrchen, wobei die rote Schicht nicht mitentnommen werden sollte. Fügen Sie mithilfe einer 5-Milliliter-Pipette 3 bis 4 Milliliter Dichtegradientenmedium unterhalb der Buffy-Coat-Schicht auf den Boden des Röhrchens hinzu, um zwei klar getrennte Schichten zu erhalten. Zentrifugieren Sie danach die Probe bei 900 × g für 10 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das rote Pellet zurück. Danach vorsichtig wirbeln, um das Pellet aufzulösen. Fügen Sie anschließend sieben Milliliter destilliertes, autoklaviertes Wasser zum Pellet hinzu und invertieren Sie die Probe 20 Sekunden lang, um das Pellet erneut zu suspendieren.

Fügen Sie danach sieben Milliliter 2x Salzlösung hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen, um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend mit 300 × g für fünf Minuten. Gießen Sie das Überstandsvolumen ab und resuspendieren Sie das Pellet in BSS-Puffer auf etwa vier mal 10 hoch 6 pro Milliliter. Behandeln Sie in diesem Verfahren eine Acht-Loch-Mikroskopieplatte vorab, indem Sie in jedes Loch 200 Mikroliter Poly-L-Lysin geben und 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie danach das Poly-L-Lysin und waschen die Löcher zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern destilliertem Wasser aus.

Fügen Sie anschließend 200 µL der hergestellten Zellsuspension in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten. Danach bereiten Sie ein Aliquot des S-1-AM-Esters vor, indem Sie 100 µL hochreines DMSO in ein Reagenzglas geben und kurz vortexen, um es zu mischen. Geben Sie in ein kleines Reagenzglas 1,7 mL BSS-Puffer und 20 µL S-1-AM hinzu und vortexen Sie das Gemisch.

Anschließend die Vertiefungen zweimal mit je 200 µL BSS-Puffer waschen und den Puffer durch die S-1-AM-Lösung ersetzen. Dabei vorsichtig die Flüssigkeit entlang der Wand der Vertiefungen pipettieren, um die an der Bodenfläche der Vertiefung haftende Zellmonolayer nicht zu stören. Danach die Probe mindestens 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Anschließend die Vertiefungen zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern BSS-Puffer waschen. Um einen Inhibitor zu testen, eine Stammlösung des entsprechenden Wirkstoffs in BSS-Puffer herstellen und die Vertiefungen zweimal damit waschen. Danach das opsonierte HKC-S-1 etwa drei Sekunden lang bei fünf Mikron sonifizieren und jeweils 10 Mikroliter davon zu jeder Vertiefung hinzufügen. Dann die Platte 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, wodurch die Zellen bereit sind, für Momentaufnahmen der Phagozytose abgebildet zu werden.

Stellen Sie mithilfe eines konfokalen Mikroskops die Laserwellenlänge so ein, dass die Zellen bei 555 Nanometern angeregt werden und die Emission von zwei Detektoren im Bereich von 560 bis 600 Nanometern sowie über 610 Nanometern erfasst wird. Betrachten Sie anschließend die Zellen mit einem 63X-Ölimmersionsobjektiv. Verwenden Sie eine Kachel-Scan-Aufnahme im kontinuierlichen Modus, um die mittlere Kachel zu betrachten.

Unter Verwendung der Fluoreszenzintensität und der Verstärkung der Detektor-Kanäle justieren Sie die Fokussierung und Intensität des Lasers sowie die Verstärkung der beiden Kanäle, um das Bild zu optimieren. Danach teilen Sie das Bild mithilfe der Einstellungen auf, um beide Kanäle einzeln betrachten zu können. Vor Beginn des Experiments überprüfen Sie, ob keine Sättigung der Fluoreszenzintensität im Zytoplasma oder in den Vakuolen vorliegt, was sich als rote Punkte zeigen würde.

Falls ja, reduzieren Sie die Laserintensität so, dass eine minimale Anzahl roter Punkte vorhanden ist, die Zellen und Phagosome jedoch hell und klar genug sind, um sie zu erkennen. Öffnen Sie in diesem Verfahren ImageJ und laden Sie die für die Analyse ausgewählte Bilddatei in die Symbolleiste. Um die beiden Kanäle zu kombinieren, verwenden Sie Bild, Farbe und dann Zusammengesetztes Bild erstellen.

Rechtsklicken Sie, um eine Datei zum Speichern der Ergebnisse auszuwählen. Klicken Sie anschließend auf das Linienwerkzeug in der Symbolleiste und doppelklicken Sie, um die Breite auf zwei zu erhöhen. Zeichnen Sie eine Linie über die Breite eines Phagosoms und rechtsklicken Sie dann, um den pH-Wert zu messen.

Der zytoplasmatische pH-Wert kann auf die gleiche Weise gemessen werden, indem eine Linie durch das Zytoplasma gezogen wird. Nach Abschluss der Messungen mit der rechten Maustaste auf „Datei speichern“ klicken. Um die Phagosomefläche zu messen, verwenden Sie das vierte Symbol in der Symbolleiste, um freihand eine Umrandung um die Fläche zu zeichnen.

Als Nächstes mit der rechten Maustaste klicken, um „Fläche messen“ auszuwählen. Hier folgt ein qualitativer visueller Schlüssel für die ungefähre Farbe der S-1-gefärbten Phagosomen, die dem pH-Wert entspricht. Die gelbe Farbe weist auf eine höhere Säurehaftigkeit hin, während Rot eine höhere Alkalinität anzeigt.

Dieses Bild zeigt bei Mäusen gebundene Markneutrophile ohne den Hvcn1-Kanal 20 Minuten nach der Phagozytose. Die Phagosomen erscheinen sehr rot, alkalisch und geschwollen. Der rote Pfeil zeigt hier auf ein intrazelluläres Candida, während dieser Pfeil auf ein extrazelluläres Candida zeigt.

Dieses Bild zeigt neutrophile Zellen aus dem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen, die Candida aufgenommen haben. Sie sind deutlich weniger alkalisch als neutrophile Zellen von Hvcn1-Knockout-Mäusen. Dieses Bild zeigt humane neutrophile Zellen aus peripherem Blut zum gleichen Zeitpunkt nach der Phagozytose.

Sie erscheinen leicht alkalischer als die Wildtyp-Zellen der Maus, aber die Phagosomen sind immer noch nicht so groß und rot wie bei den Hvcn1-Knockout-Zellen, und diese Aufnahme zeigt humane Neutrophile, die Candida in Gegenwart von fünf µM Diphenylen-Iodonium phagozytiert haben. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, beim Isolieren der Neutrophilen vorsichtig zu sein, damit diese nicht aktiviert werden.

Um zu bestimmen, ob die beobachteten Effekte auf Veränderungen des vakulären oder zytoplasmatischen pH-Werts oder des Vakuolumfangs auf Änderungen des respiratorischen Burst zurückzuführen sind, kann dieser respiratorische Burst auf andere Weise gemessen werden, die direkt die Produktion freier Radikale oder den Sauerstoffverbrauch erfasst. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane Neutrophile isoliert, anschließend den Phagosom und das Zytoplasma anfärbt und abbildet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Blutproben äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzkleidung, während Sie dieses Verfahren durchführen.