Entwicklung eines Direkt Pulp-Kappungsmodell für die Beurteilung von Pulpal Wundheilung und Reparative Dentinbildung bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das direkte Verfahren der Pulpaverschließung an Mäusen vorzustellen. Diese Methode kann Ihnen helfen, wichtige Fragen der Pulpabiologie zu beantworten, z. B. wie die Pulpa heilt oder wie sich reparatives Dentin bildet, wenn Sie eingeschlossene Pulpa-Überdeckungsmaterialien auf die freiliegende Pulpa legen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das eigentliche direkte Pulpa-Capping-Verfahren, das am Menschen durchgeführt wird, auch bei Mäusen auf genau die gleiche Weise durchgeführt werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Verbesserung der Materialeigenschaften, um Zähne zu retten, die sonst zu invasiveren Behandlungen wie der Wurzelkanaltherapie verdammt wären. Nachdem Sie die Maus für den Eingriff richtig betäubt haben, positionieren Sie den Mundhalter in seinem Mund und befestigen Sie das andere Ende so am Tisch, dass der Kopf nach oben zeigt. Betrachten Sie bei guter Beleuchtung und einem Stereoskop den ersten Backenzahn im Oberkiefer.

Entfernen Sie dann mit dem Viertelrundbohrer in einem Hochgeschwindigkeitshandstück bei 200.000 U/min den zentralen Bereich des Zahnschmelzes, bis die Pulpa durch das transparente Dentin sichtbar ist. Achten Sie darauf, nicht in das Fruchtfleisch einzudringen. Verwenden Sie als Nächstes eine Nr.

15 endodontische K-Feile, perforieren Sie durch das Dentin und legen Sie die Pulpa frei. Schieben Sie keine Ablagerungen in das Fruchtfleisch; Dies kann vermieden werden, indem Sie die K-Datei vierteljährlich drehen und dann die K-Datei herausziehen. Bereiten Sie nun den MTA vor, geben Sie den MTA mit dem Explorer ab und packen Sie ihn dann mit der Rückseite der Papierspitze und leichtem Klopfen in den freiliegenden Bereich.

Bedecken Sie anschließend den Zahn mit einer Spritze, die mit 35% Phosphorsäure-Ätzmittel beladen ist, mit dem Ätzmittel, vermeiden Sie das Zahnfleischgewebe und lassen Sie das Ätzmittel 15 Sekunden lang einwirken. Saugen Sie nach 15 Sekunden das Ätzmittel vom Zahn ab und wischen Sie mit einem wasserfeuchten Baumwollapplikator alle verbleibenden Ätzmittel ab. Saugen und wischen, bis der gesamte Ätzstoff entfernt ist.

Tragen Sie anschließend die Zahnadhäsiven mit der Rückseite der Papierspitze auf. Machen Sie die Klebeschicht dünn, indem Sie sie einige Sekunden lang mit Druckluft blasen. Anschließend härten Sie den Kleber 30 Sekunden lang mit dem entsprechenden Licht aus.

Geben Sie nun kleine Mengen Komposit mit der Spitze des Explorers auf den Zahn, um das Komposit in die Zahnrillen fließen zu lassen. Nach dem Auftragen härten Sie das Komposit 30 Sekunden lang aus. Nachdem Sie die Maus eingeschläfert und den gesamten Oberkiefer entfernt haben, legen Sie den Kiefer in 4%iges Paraformaldehyd in PBS bei pH 7,4.

Halten Sie das Gewebe über Nacht bei 4 Grad Celsius und überführen Sie es am nächsten Morgen zur Lagerung auf 70 % Ethanol, bis es verarbeitet werden kann. Um einen Mikro-CT-Scan des Oberkiefers zu machen, befestigen Sie ihn zuerst in Gaze, die mit 70 % Ethanol getränkt ist, und packen Sie ihn dann in ein 15-Milliliter-Zellkulturröhrchen. Montieren Sie dann die Röhre auf dem Mikro-CT-Scantisch.

Stellen Sie als Nächstes die Röntgenquelle so ein, dass sie 200 Millisekunden lang einen Strom von 145 Mikroampere mit 55 Spitzenkilovolt liefert. Mit einem 0,5-Millimeter-Aluminiumfilter können Sie Bilder mit einer Auflösung von 20 Mikrometern aufnehmen. Nachdem die Scans abgeschlossen sind, beginnen Sie mit der Entkalkung des Oberkiefers mit 5 % EDTA und 4 % Saccharose in PBS bei einem pH-Wert von 7,4.

Lassen Sie diese Reaktion zwei Wochen lang bei 4 Grad Celsius laufen. Nach dem Einbetten des Oberkiefers fünf Mikrometer dicke Scheiben formen. Die Pulpa-Überdeckungsbereiche fallen in der Regel mit der distalen Gaumenwurzel zusammen, die als Landmarker verwendet werden kann.

Bestimmen Sie den genauen Interessenbereich, indem Sie die Histologie unter dem Lichtmikroskop untersuchen und die Ergebnisse mit den Mikro-CT-Scans vergleichen. Entfernen Sie für die H&E-Färbung das Paraffin und rehydrieren Sie die Objektträger mit zwei Bädern in Xylol für jeweils einige Minuten. Führen Sie sie dann durch eine Reihe von seriell verdünntem Ethanol.

Jedes Bad sollte nur eine Minute lang angewendet werden. Folgen Sie der Rehydrierung mit einer Spülung. Tragen Sie dann die Hämotoxylinlösung zweieinhalb Minuten lang auf.

Entfernen Sie den Farbstoff mit einer Spülung und legen Sie die Objektträger dann eine Minute lang in 95%iges Ethanol. Färben Sie die Objektträger anschließend eine Minute lang mit Eosinlösung und spülen Sie sie dann ab. Kehren Sie die Hydratationsschritte um, um das verfärbte Gewebe zu dehydrieren, beginnend mit Ethanol.

Behandeln Sie sie dann mit Xylol. Die Folien können dann montiert und abgebildet werden. Unter Verwendung der beschriebenen Verfahren wurde das Pulpa-Capping an 8 Wochen alten Mäusen durchgeführt.

Sechs Wochen später wurden ihre Oberkiefer entnommen und untersucht. Kurioserweise zeigte die H&E-Färbung eine Dentinbildung in der gesamten Pulpakammer und in den Wurzelkanälen. Im Vergleich dazu zeigte der unbedeckte Backenzahn nicht die gleiche Dentinbildung.

Im gedeckelten Molaren gab es Merkmale sowohl einer dentinähnlichen als auch einer knochenartigen Bildung, da sowohl Dentintubuli als auch Osteozyten im reparativen Dentin gefunden wurden, was darauf hindeutet, dass die verletzte Pulpa sowohl von ansässigen Odontoblasten als auch von eingewanderten Osteoblasten mineralisiert sein könnte. Die Verwendung von immunhistochemischer DMP1-Färbung bestätigte die erhöhte Aktivität der Zellen, die reparatives Dentin bilden. Genau wie in echten zahnärztlichen klinischen Praxen ist es äußerst hilfreich, eine Assistentin zu haben.

Mit einem Assistenten kann diese Technik beispielsweise in nur zehn Minuten durchgeführt werden, wenn sie einmal gemeistert ist. Wichtig ist, dass Sie beim Freilegen der Pulpa daran denken, Endofile und nicht den Bohrer zu verwenden. Und wenn Sie die MTA übergeben, seien Sie vorsichtig.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixiermitteln wie Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sollten immer getroffen werden.