Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Transkriptakkumulation in spezifischen Zellen oder zellulären Domänen zu quantifizieren, so dass Vergleiche zwischen verschiedenen Domänen oder zwischen äquivalenten Domänen in Mutanten- und Wildtyp-Proben angestellt werden können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie Organdomänen spezifiziert werden oder wie sich bestimmte Mutationen auf die Genexpression auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Transkriptakkumulation in winzigen, genau definierten Domänen quantifiziert werden kann, die zu klein sind, um von Hand präpariert zu werden.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, ziehen Sie Maissetzlinge unter normalen Bedingungen bis zu einem Alter von zwei Wochen an. Um die Triebspitzen für die Seitenabschnitte zu zerschneiden, schneiden Sie zuerst einen Sämling knapp unterhalb der Bodengrenze heraus. Entfernen Sie dann mit einer Rasierklinge dünne Scheiben von der Basis des Stiels, bis ein Oval der Ruhe sichtbar ist, das von ein oder zwei reifen Blättern umgeben ist.

Machen Sie einen weiteren Schnitt etwa 10 Millimeter über der Basis. Dieses 10-Millimeter-Segment enthält das apikale Meristem der Sprosse bei jungen Blattprimordien. Drehen Sie das 10-Millimeter-Segment so, dass die Basis nach oben zeigt.

Machen Sie zwei Schnitte parallel zur Seitenachse, um einen zwei bis drei Millimeter dicken Gewebeschieber zu erhalten. Entsorgen Sie die beiden äußeren Teile und behalten Sie die mittlere Scheibe zur Fixierung und Einbettung. Tauchen Sie die Gewebescheibe in ca. 10 Milliliter Bauern, die in einem Glasfläschchen auf Eis fixiert sind.

Nachdem alle Proben präpariert wurden, wenden Sie ein Vakuum an, um Luftblasen zu entfernen und das Eindringen des Fixiermittels zu unterstützen. Halten Sie das Vakuum 10 Minuten lang fest und lassen Sie es dann langsam los. Ersetzen Sie das Fixiermittel und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln.

Am nächsten Tag wird die Verarbeitung des Gewebes für die Einbettung wie im Textprotokoll beschrieben fortgesetzt. Um Paraffinblöcke zu gießen, legen Sie die Einbettformen auf eine Heizplatte der Gewebeeinbettstation und übertragen Sie die Gewebeproben mit einer Pinzette mit der Schnittfläche nach unten in die Einbettungsformen. Platzieren Sie den Einbettring auf der Oberseite der Form.

Füllen Sie jede Form mit geschmolzenem Paraffin auf. Übertragen Sie die Formen auf eine kalte Platte, bis sich das Paraffin verfestigt hat. Lagern Sie die Paraffinblöcke in einem luftdichten Behälter mit Kieselgel bei vier Grad Celsius.

Die Schnitte werden aus Paraffinblöcken auf einem Mikrotom nach Standardverfahren geschnitten, und die Medianschnitte, die das Sprossapikalmeristem enthalten, werden für die Montage ausgewählt. Um die Abschnitte auf Objektträger zu montieren, legen Sie Objektträger, die entweder RNase-frei oder eingebrannt sind, auf einen 42 Grad Celsius warmen Objektträgerwärmer. Tragen Sie mehrere Tropfen 50%ige Ethanollösung auf, um jeden Objektträger zu bedecken.

Legen Sie die Abschnitte vorsichtig auf den Objektträger und schwimmen Sie die Abschnitte auf der Ethanollösung, bis sie sich ausgedehnt haben. Kippen Sie anschließend den Objektträger und entfernen Sie überschüssige Ethanollösung durch Aspiration mit einer Einweg-Transferpipette. Verwenden Sie fusselfreie Tücher, um zusätzliche Ethanollösung abzuleiten.

Trocknen Sie die Objektträger bei 42 Grad Celsius für mehrere Stunden oder über Nacht. Wenn die Objektträger trocken sind, bewahren Sie sie in einem luftdichten Behälter mit Kieselgel bei vier Grad Celsius auf. Entparaffinieren Sie die Objektträger am Tag der Mikrodissektion.

Bereiten Sie drei Coplin-Glasgläser vor, zwei Gläser mit etwa 50 Millilitern 100%igen Xylolen und ein Glas mit etwa 50 Millilitern 100%igem Ethanol. Tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang in Xylole, zwei Minuten lang in Xylole und eine Minute lang in 100 % Ethanol. Lassen Sie die Objektträger auf fusselfreien Tüchern abtropfen und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft.

Um diesen Vorgang zu starten, befestigen Sie die Objektträger auf dem Tisch des Laser-Mikrodissektionsmikroskops. Ein kritischer Faktor für den Erfolg der Lasermikrodissektion in RNasic-Experimenten ist die Verwendung morphologischer und molekularer Marker zur Auswahl präziser Domänen für die Mikrodissektion. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem 5X-Objektiv und identifizieren Sie die fünf mediansten Abschnitte auf jedem Objektträger, wobei die Spitze des Sprossapikalmeristems als zentraler Referenzpunkt dient.

Verwenden Sie als Nächstes entweder ein 10X- oder ein 20X-Objektiv, um die Position des Ligulus auf dem siebenblättrigen Plastochron-Primordium jedes Abschnitts zu bestimmen. Die Ligular ist als Beule sichtbar, die aus der adaxialen Oberfläche des Blattprimordiums herausragt. Verwenden Sie das Zeichenwerkzeug der Lasermikrodissektionssoftware, um diese Position zu markieren.

Wählen Sie das Freihandzeichensymbol aus, bewegen Sie den Cursor an die entsprechende Position, klicken und ziehen Sie die Maus, um zu zeichnen. Der nächste Schritt besteht darin, mit dem Lineal und dem rechteckigen Zeichenwerkzeug 100 Mikrometer hohe Rechtecke zu messen, die auf einer Ligule jedes Abschnitts zentriert sind, während die Liguli-Proben entnommen werden. Um das Linealwerkzeug zu verwenden, wählen Sie das Linealsymbol aus, bewegen Sie den Cursor an ein Ende des zu messenden Bereichs, und klicken und ziehen Sie dann, um den Bereich zu messen.

Die Länge des Lineals wird auf dem Bildschirm angezeigt. Verwenden Sie das Linealwerkzeug, um ein 100-Mikrometer-Segment zu messen, das auf einer Ligule zentriert ist. Um ein Rechteck zu zeichnen, wählen Sie das Werkzeug zum Zeichnen gerader Linien aus und zeichnen Sie vier gerade Linien.

Messen Sie auf die gleiche Weise 100-Mikrometer-Rechtecke, die 50 Mikrometer über und unter dem Ligule-Rechteck positioniert sind. Dabei handelt es sich um die Klingen- und Scheidenproben. Mikrodisparieren Sie die gemessenen Rechtecke mit der Laserschnittfunktion, um den Gewebeschnitt entlang des Umrisses der ausgewählten Domäne zu durchschneiden, und mit der Katapultfunktion, um das Rechteck des Gewebes vom Objektträger in den Deckel des Röhrchens zu befördern.

Entnehmen Sie Proben von Liguli, Klinge und Scheide in separaten Röhrchen. Verwenden Sie das gleiche Verfahren, um adaxiale Epidermisproben aus Plastochron siebenblättrigen Primordien zu mikrodisparieren. Tragen Sie abschließend einen RNA-Extraktionspuffer auf das mikropräparierte Gewebe auf und fahren Sie mit der RNA-Extraktion, der RNA-Amplifikation, dem Bibliotheksaufbau, der Sequenzierung und der bioinformatischen Analyse fort, wie im Manuskript beschrieben.

Bei der Analyse der Transkriptakkumulation und aller Zellschichten der Klingen-, Ligulus- und Scheidenregionen wurden 2.359 differentiell exprimierte Gene gefunden. In den adaxialen Regionen der epidermalen Klinge, des Ligulus und der Scheide wurden 3.128 differentiell exprimierte Gene gefunden. Lasermikrodissektion, RLM, RNA-Sequenzierung und In-situ-Hybridisierungsanalysen lieferten konsistente Ergebnisse, die durch diese repräsentativen Gene veranschaulicht werden.

Die Karikaturen auf der linken Seite veranschaulichen die LM aller Zellschichten, und die Karikaturen auf der rechten Seite zeigen nur die LM der adaxialen Epidermis. Die Pfeilspitzen in den Bildern deuten auf austretende Liguli hin. Die Akkumulation des Ligules one Transkripts war im Ligulus sowohl in allen Zellschichten als auch in der epidermalen LM signifikant höher.Die schmale Schleuse eins war in der Ligulusregion sowohl in allen Zellschichten LM als auch in der adaxialen Epidermis LM signifikant hochreguliert und reichert sich spezifisch in der Spitze des entstehenden Ligulus an.

Ein Gen mit unbekannter Funktion hatte eine höhere mittlere Recount in der ligulären epidermalen LM als in den LM aller Schichten.Dieses Transkript akkumuliert am stärksten in epidermalen Zellen. Das vierte Gen, Zm PIN1a, wurde in der Analyse aller Zellschichten nicht signifikant differentiell exprimiert, war aber in der reinen Epidermisanalyse im Ligulus signifikant hochreguliert. Seine hohe Expression im Gefäßgewebe könnte die Unterschiede in der Transkriptakkumulation in der Epidermis verfälscht haben, wenn alle Zellschichten gesammelt wurden.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Wahl der zellulären Domänen für die Mikrodissektion und den Vergleich sowie die Genauigkeit der Mikrodissektionen entscheidend für den Erfolg der Experimente sind.