Name: Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in Zea Mays Blätter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die kinematische Analyse von Zellteilung und Expansion in Maisblättern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Wachstumsregulationsmechanismen durch entwicklungsspezifische Probenahme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium an der Universität von Antwerpen nach VA unterstützt; ein Promotionsstipendium der flämischen Science Foundation (FWO, 11ZI916N) zu KS; Projektzuschüsse von der FWO (G0D0514N); eine konzertierte Forschungstätigkeit (GOA) Forschungsstipendium: &quot;Ein systembiologischer Ansatz der Blatt Morphogenese&quot; von der Forschungsgemeinschaft der Universität Antwerpen; und das Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte (IUAP VII / 29, MARS), &quot;Mais und Arabidopsis Wurzel und Sprosswachstum&quot; von der Föderale Wissenschaftspolitik (BELSPO) zu GTSB Han Asard, Bulelani L. Sizani und Hamada Abdelgawad alle zum Video beigetragen .

HINWEIS: Das folgende Protokoll für kinematische Analyse gilt nur für Blätter im stationären Zustand Wachstum. Dies impliziert eine stabile Blattdehnungsrate und räumlichen Muster der Zellenlänge und Expansion in einem Blatt während eines Zeitraums von mehreren Tagen 6. 1. Pflanzenwachstum und die Messungen der Blattdehnungsrate (LER) <ol><li> Wählen Sie ein Blatt im Steady-State-Wachstum und eine Entwicklungsphase von Interesse. HINWEIS: Es gibt einen Unterschied zwischen Steady-State-Wachstum und repetitive Wachstum, das auf aufeinanderfolgenden Blättern auf der gleichen Achse ähnliche räumliche Muster impliziert. Während der frühen Stadien der Sämlingwachstum wachsen sukzessive Blätter typischerweise immer schneller durch die zunehmende Größe der Wachstumszone 7. Obwohl einige höhere Blattpositionen ein ähnliches Wachstumsmuster 8 haben kann, ist dies eine Übergangsphase , die durch Behandlungen zu untersuch beeinträchtigt werden kann. Es ist daher wichtig zu vergleichen Linien und tr<html> eatments streng auf der gleichen Blattposition, auch wenn es zu einer anderen Zeit entwickeln kann. Selbst bei einer konstanten Dehnungsrate, ist die Wachstumsrate Profil nicht notwendigerweise gleich in verschiedenen Entwicklungsstadien. Daher ist es wichtig , Blätter an der gleichen Entwicklungsstufe 8 zu analysieren, in der Regel durch die Anzahl der Tage nach dem Auflaufen definiert. </li><li> Um eine vollständige kinematische Analyse des Blattwachstums in Monokotyledonen zuführen, wachsen mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum. </li><li> Zu der Zeit , das Blatt von Interesse erscheint (Austritt aus dem Quirl der umliegenden Blätter), starten Sie die Länge der Blattmess täglich mit einem Lineal , bis das Blatt vollständig erweitert ist (Abbildung 1 i). Blattlänge bedeutet die Länge vom Bodenniveau bis zur Spitze des Blattes. Achten Sie darauf, das Blatt zu brechen oder beschädigt werden, da dies möglicherweise sein Wachstum zu verändern. </li></ol>re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; Abb . 1: Schematische Darstellung einer kinematischen Analyse von Maisblättern Das Blatt von Interesse wird mit einem Lineal gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen das Blatt Dehnungsrate (LER) zu berechnen. Danach wird das Blatt geerntet und drei Zentimeter Segment für die Bestimmung der Meristem-Größe verwendet. Dies wird durch Messen der Länge von der Basis bis zu dem distalsten mitotische Figur nach DAPI-Färbung durchgeführt. (A) Beispiele für proliferative Mitosen und (B) gestaltende Mitosen. Die ersten elf Zentimeter von der Blattunterseite auf der anderen Seite der Mitte Vene verwendet 1001 Zentimeter Segmente für die Zelllängenmessungen zu schneiden. Diese Messungen bilden die Grundlage für die Erstellung der Zellenlänge Profil, das die reife Zelllänge (l mat) und die Länge der Zellen , so dass die Meristem (l div) zu bestimmen dient. Das <em&gt; LER und l Matte verwendet , um die Zellproduktionsrate (P) zu berechnen, während l div und L mer verwendet , um die Anzahl der Zellen im Meristem (N - mer) zu berechnen. Wiederum P und N mer verwendet , um die durchschnittliche Zellenteilungsrate (D) zu berechnen, die die Umkehrung der Zellzyklusdauer (T c). Pfeile in der gleichen Farbe zeigen Parameter, die die Parameter folgende auf diese Pfeile werden verwendet, um zu berechnen. Maßstabsbalken = 40 um. Römische Zahlen werden verwendet , um bestimmte experimentelle Verfahren in der beschriebenen Protokoll zu beziehen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Ernte <ol><li> In der Entwicklungsphase von Interesse (zB, am dritten Tag nach dem Schlüpfen), wählen Sie mindestens fünf Vertreter pMittelführerinnen aus dem Ansatz, auf dem die kinematische Analyse durchzuführen. Wodurch der Rest der Pflanzen messen, wie in Schritt 1.3 erläutert die endgültige Blattlänge zu bestimmen. </li><li> Schneiden Sie das oberirdische Teil der Pflanze. Damit die meristematic Teil intakt, schneiden Sie so nah wie möglich an die Wurzeln (Abbildung 1II). </li><li> Ausgehend von den äußeren Blättern, entfernen Sie alle Blätter auf dem Blatt von Interesse, indem sie sanft eins nach dem anderen Abrollen. Entfernen Sie ggf. ein paar zusätzliche Millimeter von der Basis, um die Blätter zu lösen. Entfernen Sie auch die Spitze und kleine Blätter durch die Blatt von Interesse (Abbildung 1III) eingeschlossen. </li><li> Schneiden Sie ein 3 cm-Segment, von der Basis auf einer Seite der mittleren Ader beginnen, und bewahren Sie sie in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 3 gefüllt: 1 (v: v) absolutem Ethanol: Essigsäure-Lösung (ACHTUNG: Handschuhe tragen) bei 4 ° C für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten (Abb 1IV). Dieses Segment wird später verwendet werden, um die Länge des Meristem zu bestimmen. </li><li> Von demandere Seite der Vene, ein 11 cm - Segment von der Basis (1 v) geschnitten und in einem 15 ml Röhrchen mit absolutem Ethanol bei 4 ° C für mindestens 6 h gefüllten Pigmente (1 vi) zu entfernen. HINWEIS: Später, wenn Sie nur die ersten 10 cm der Zellenlänge Profil (siehe Diskussion) zu bestimmen. </li><li> Erneuern Sie die absolute Ethanol für eine weitere Runde von mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Reinigung (Abbildung 1vi). </li><li> Schließlich ersetzen die absolute Ethanol mit reinem Milchsäure (ACHTUNG: Handschuhe tragen) für die Reinigung und Lagerung bei 4 ° C für 24 Stunden oder bis zur weiteren Verwendung (Abbildung 1vi). </li></ol> 3. Meristem Längenmessungen <ol><li> Bereiten Sie eine Spülung Puffer, der 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; ACHTUNG: Handschuhe tragen) und 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-Salzsäure (TRIS-HCl, pH 7). </li><li> Nehmen Sie die 3 cm Segment aus dem Abschnitt 2.4 und soak es in dem Puffer für 20 min (Abbildung 1vii). </li><li> Während des Wartens, verwenden Sie den Spülpuffer ein 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Färbelösung von 1 ug / ml herzustellen, es auf Eis und im Dunkeln zu halten. </li><li> Stain die Kerne durch das meristem Segment für 2-5 min in der DAPI-Färbelösung platzieren. Die Arbeiten auf dem Eis und in der Dunkelheit (Abbildung 1vii). </li><li> Prüfen Sie, ob Fluoreszenzsignal durch schnell das Segment auf einem Mikroskopie Glasmontage und Abdecken mit einem Deckglas. Die epidermalen Zellen sollten Fluoreszenz zeigen, während die zugrunde liegenden Zellschichten sollten nicht. </li><li> Wenn die Färbung nicht ausreichend ist, legte das Segment wieder in den DAPI-Färbung Lösung für einige zusätzliche Minuten. </li><li> Um die Färbung zu stoppen, montieren Sie die Segmente in einem Tropfen Pufferspülung auf einer Mikroskopie Objektträger und Deck mit einem Deckglas. </li><li> Verwenden Sie ein Mikroskop mit UV-Fluoreszenz bei einer 20-facher Vergrößerung ausgestattet, so dass für die Visualisierung von rund 1.000 epidermal-Zellen auf einmal. Blättern Sie im gesamten Segment und sucht proliferative Mitosefiguren (Metaphase, Anaphase, Telophase und Zytokinese), aber vermeiden prägenden Zellteilung der Entwicklung Stomata (Abbildung 1viii) 9. Definieren Sie, wo die am weitesten distal gelegene Mitose befindet. </li><li> Bestimmen die Länge des Meristem durch den Abstand zwischen der Basis des Blattes gemessen wird und die distalste epidermal mitotische Figur. Verwenden Sie eine Bildanalyse - Software (zB ImageJ) über die volle Länge des Bildrahmens zu messen. <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der Bilder , die die volle meristem Länge (von der Blattbasis zu dem am weitesten entfernten Mitose) und multiplizieren Sie diese Zahl durch die Länge eines Rahmens decken die gesamte meristem Länge (Abbildung 1ix) zu erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Zell Länge Profil <ol><li> Nehmen Sie das Segment, das in Milchsäure (Schritt 2.5) und vorsichtig auf der Bank gespeichert. Schneiden Sie die Segmente Witzha Skalpell in 10 Segmente von 1 cm jeweils (Abbildung 1x). </li><li> Montieren der aufeinanderfolgenden Blattsegmente auf einem Mikroskopie Schieber in einem kleinen Tropfen Milchsäure. Stellen Sie sicher, konsequent auf einen Blick auf die adaxial oder abaxial Seite nach oben. Im Prinzip gibt es keine Präferenz für eine bestimmte Seite. </li><li> Verwenden Sie ein Mikroskop mit differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Optik ausgestattet, um die Segmente zu analysieren, von der Blattbasis beginnen. Messung mit einer Bildanalysesoftware, die Länge von mindestens 20 replicate Epidermiszellen in Dateien unmittelbar neben der Stomata Dateien, um konsequent die gleichen Zelltyp auszuwählen. <ol><li> Tun Sie dies in gleich beabstandeten Positionen entlang jedes der Segmente (4 Positionen pro Segment ausreichend), und stellen Sie sicher , die entsprechende Position für jede Messung im gesamten Blatt (Abbildung 1 xi) zu notieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die mittlere Zellenlänge an jedem mm entlang der Blattachse durch eine lokale Polynom Glättung p mitERFAHREN, implementiert in einem R-Skript (Abbildung 1xii; Ergänzende Datei 1). HINWEIS: Die R-Skript stellt eine Reihe von Daten mit Glättung erhöht. Die erforderliche Menge der Glättung ist etwas willkürlich und sollte idealerweise nur das lokale Rauschen zu entfernen, aber nicht die gesamte Kurve beeinflussen. Sicherstellen, dass die gleiche Menge an Glättung für alle Proben in einem Experiment zu verwenden. </li><li> Der Mittelwert der Zellenlänge an jeder Position zwischen den Pflanzen und berechnen Sie die Standardfehler eine Zellenlänge Profil entlang der Blattachse zu schaffen. </li></ol> 5. Die Berechnung der kinematischen Parameter (siehe Zusatz Datei 2) <ol><li> Berechne die LER , indem die Änderung in der Blattlänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nehmen (beispielsweise 24 Stunden, wie in Schritt 1.3) , und es durch das Zeitintervall dividiert wird . </li><li> Berechnen der Länge der Wachstumszone (L gz) entsprechend der Position distal von der Basis , wo Zellen 95% ihrer reifen ce erreichenll Länge auf der Zelllängenprofil geglättet. <ol><li> Nehmen Sie für jede Position auf der geglättete Zellenlänge Profil 95% des Durchschnitts aller Zellenlängen nach dieser Position (Abbildung 2). </li><li> Vergleichen Sie die geglättete Zellenlängen (Schritt 4.4) mit der berechneten 95% Zelllänge in jeder Position. Ausgehend von der Basis des Blattes endet die Wachstumszone an der Position , wo die tatsächliche Zellenlänge entspricht 95% der folgenden Zelllängen (2; siehe Zusatz Data 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Die Bestimmung des Endes der Wachstumszone Meristem: An der Stelle , mit einem roten Stern angegeben, ist die tatsächliche Zellengröße von weniger als 95% (rot gestrichelte Linie) der durchschnittlichen Zellgröße aller in dieser Position folgende Zellen (rot solide Linie). Das Ende der Wachstumszone (L gz, angegeben mit ablue Sterne) liegt dort, wo 95% (gestrichelte blaue Linie) der durchschnittliche Zellgröße aller Zellen im Anschluss an diese Position (durchgezogene blaue Linie) ist gleich der tatsächlichen Zellgröße. Abteilung Zone (D), Dehnungszone (E) und reifen Zone (M). Eine gestrichelte Pfeile , um die Konvergenz zwischen der lokalen Größe und 95% der mittleren Größe über den distalen Teil des Blattes zeigen , wenn sie von den basalen Positionen an der Spitze des Blattes bewegt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> Berechnen der Länge der Dehnungszone (L EL) als die Differenz zwischen der Länge der Wachstumszone (L gz) und Meristem Größe (L mer; bestimmt in Schritt 3). </li><li> Berechnen Sie die reifen Zelllänge (l mat) als auch die durchschnittliche Zellenlänge in der reifen Zone. </li><li> Teilen Sie die LER von l Matte zu erhalten , dieZellproduktionsrate (P). </li><li> Berechnen der Anzahl von Zellen in der Dehnungszone (N el) als die Differenz zwischen N und N gz mer. Die Anzahl der Zellen in dem Meristem (N mer) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu Meristem entsprechenden befindlichen Zellen. Die Anzahl der Zellen in der Wachstumszone (N gz) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu der Wachstumszone entsprechenden befindlichen Zellen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellteilungsrate (D) als P / N mer. Die Zellzyklusdauer (T c) ist gleich ln (2) / D. </li><li> Berechnen Sie die Zeit in der Dehnungszone (T el) durch Teilen N el durch P. Die Zeit , in der Teilungszone gleich log 2 (N - mer) * T c. Die Länge der Zellen Verlassen des meristem (l div)gleich der Zelle aus dem geglätteten Zellenlänge Profil am Ende der Meristem Länge. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellexpansionsrate (R el) unter Verwendung folgender Formel: ln (l Matte) -ln (l div)] / T el. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Eine vollständige kinematische Analyse auf Maisblättern ermöglicht die Bestimmung der zellulären Basis des Blattwachstums und ermöglicht die Gestaltung effizienter Probenahmestrategien. Obwohl das Protokoll relativ einfach ist, ist eine gewisse Vorsicht in den folgenden kritischen Schritte empfohlen: (1) Es ist wichtig, die jüngeren, geschlossenen Blätter zu lösen (2.3 Schritt), ohne die meristem zu beschädigen, da meristem Längenbestimmung (Schritt 3) erfordert die vollständige meristem vorhanden sein. Einige der Praxi...

Wachstumsanalyse hängt von einer Reihe von Werkzeugen, die von Pflanzenwissenschaftler häufig verwendet werden, Genotyp bestimmt Wachstumsunterschiede und / oder phänotypische Reaktionen auf Umweltfaktoren zu beschreiben. Dazu gehören Größe und Gewichtsmessungen der gesamten Anlage oder ein Organ und Berechnungen der Wachstumsraten, die zugrunde liegenden Mechanismen des Wachstums zu erkunden. Organwachstum wird durch Zellteilung und Expansion auf der zellulären Ebene bestimmt. Daher analysiert die Quantifizierung dieser beiden Prozesse in Wachstum einschließlich ist der Schlüssel zum Verständnis der Unterschiede in Vollorganwachstum 1. Folglich ist es wichtig, eine geeignete Methodik haben zellulären Wachstumsparameter zu bestimmen, der relativ leicht von nicht spezialisierten Labors zu verwenden. Kinematic Analyse wurde bereits als Ansatz etabliert 2 einen leistungsstarken Rahmen für die Entwicklung von Organwachstumsmodelle bieten. Die Technik wurde für lineare Systeme optimiert,wie Arabidopsis thaliana Wurzeln und monokotyle Blätter, sondern auch für nichtlineare Systeme, wie dikotyle Blätter 3. Heute wird diese Methode immer mehr, wie genetische Studie verwendet wird, hormonelle, entwicklungs und Umweltfaktoren beeinflussen die Zellteilung und die Expansion in verschiedenen Organen (Tabelle 1). Darüber hinaus bietet sie auch einen Rahmen zelluläre Prozesse auf die ihnen zugrunde liegenden biochemischen, molekularen und physiologischen Bestimmungen (Tabelle 2) zu verbinden, obwohl Einschränkungen können durch Organgröße und räumliche Organisation für Techniken , die höhere Mengen an Pflanzenmaterial erfordern auferlegt werden (zB Metaboliten Messungen, Proteomics, etc.). Monokotylen Blätter, wie beispielsweise Mais (Zea mays) Blatt-, für lineare Systeme , in denen Zellen von der Basis des Blattes gegen die Spitze zu bewegen, der Reihe nach durch die Meristem und Dehnungszone Leiten des reifen zu erreichenZone. Dies macht es zu einem idealen Modellsystem für quantitative Untersuchungen der räumlichen Muster des Wachstums 4. Darüber hinaus haben Maisblätter große Wachstumszonen (Meristem und Dehnungszone über mehrere Zentimeter 5) und in anderen Organisationsebenen Möglichkeiten für Studien. Dies ermöglicht die Untersuchung der (vermeintlichen) Regulationsmechanismen der Zellteilung steuern und Expansion, durch kinematische Analyse durch eine Reihe von molekularen Techniken quantifiziert, physiologische Messungen und Zellbiologie Ansätze (Tabelle 2). Hier stellen wir ein Protokoll für eine kinematische Analyse in monokotylen Blätter durchführt. Zuerst wird erklärt, wie eine richtige Analyse der sowohl die Zellteilung und Zell Dehnung als Funktion der Position längs der Blattachse zu leiten und wie kinematischen Parameter zu berechnen. Zweitens zeigen wir auch, wie diese als Grundlage für die Stichprobenplan verwendet werden können. Hier diskutieren wir zwei Fälle: hochauflösende Abtastung eind konzentriert Probenahme, verbesserte Dateninterpretation und die Einsparung von Zeit / Geld ermöglicht, respectively. Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Organ </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> monokotylen Blätter </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> Wurzelspitzen </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> dikotylen Blätter </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> Sprossapikalmeristem </td><td> 32 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen. Tabelle 2 Zusammenhang zwischen zellulärer Prozesse quantifiziert durch die kinematische Analyse auf ihre Regulation auf molekularer Ebene. Verweise auf verschiedene Studien , die die Quantifizierung von zellulären Prozessen zu den Ergebnissen von biochemischen und molekularen Assays in verschiedenen Spezies und Organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), Malondialdehyd (MDA), Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Töpfe</td><td>Beliebig Beliebig</td><td></td><td>Wir verwenden Töpfe mit folgenden Maßen, die jedoch je nach Behandlung/Studie unterschiedlich sein können: Bodendurchmesser: 11 cm, Öffnungsdurchmesser: 15 cm, Höhe: 12 cm. Wir bauen eine Maispflanze pro Topf an.</td></tr><tr><td>Wir</td><td></td><td></td><td>verwenden Blumenerde (Jiffy, Niederlande), aber je nach Behandlung/Studie können auch andere Substrate verwendet werden.</td></tr><tr><td>Lineal</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig</td><td>Ein Verlängerungslineal, das mindestens 1,5 Meter abdeckt, wird benötigt, um die endgültige Blattlänge der Pflanzen zu messen.</td></tr><tr><td>Samen</td><td>Alle</td><td>NA</td><td>Samen können bei einem Züchter bestellt werden.</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig</td><td>Das Skalpell wird während der Blatternte verwendet, um das Blatt von den umgebenden Blättern zu lösen, und direkt nach der Ernte, um eine geeignete Probe für die Messung der Zelllänge und der Meristemlänge zu schneiden.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig</td><td>Die 15 mL Falcon Röhrchen werden zur Lagerung von Proben verwendet, die für Zelllängenmessungen während der Probenreinigung mit absolutem Ethanol und Milchsäure verwendet werden.</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Beliebig Beliebig</td><td></td><td>Die Eppendorf Röhrchen werden zur Lagerung von Proben verwendet, die für Meristemlängenmessungen in Ethanol:Essigsäure 3:1 (v:v) Lösung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Alle</td><td>Alle</td><td>Latexhandschuhe, die vor korrosiven Reagenzien schützen.</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Alle</td><td>Alle ACHTUNG</td><td>: Korrosiv gegenüber Metallen, Kategorie 1 Korrosion der Haut, Kategorie 1A, 1B, 1C Schwere Augenschäden, Kategorie 1; Entzündbare Flüssigkeiten, Kategorien 1,2,3</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Alle</td><td>Alle ACHTUNG</td><td>: Gefahrvoll bei Hautkontakt (reizend), bei Augenkontakt (reizend), beim Einatmen. Leicht gefährlich bei Hautkontakt (Permeator), bei Verschlucken</td></tr><tr><td>Milchsäure&nbsp; >98%</td><td>Beliebig</td><td>BELIEBIG</td><td>VORSICHT: Korrosiv gegenüber Metallen, Ätzwirkung auf die Haut der Kategorie, Kategorie 1A, 1B, 1C Schwere Augenschäden, Kategorie 1</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Beliebig</td><td>Jegliche</td> Ethylendiamintetraessigsäure <td></td></tr><tr><td>(EDTA)</td><td>Beliebig</td><td>BEACHTUNG</td><td>: Akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), Kategorie 4 Hautreizung, Kategorie 2 Augenreizung, Kategorie 2 Hautsensibilisierung, Kategorie 1 Spezifische Toxizität des Zielorgans &ndash; Einmalige Exposition, Kategorie 3</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl)</td><td>Alle</td><td>Alle Dieses</td><td>Material kann reizend sein, der Kontakt mit Augen und Haut sollte vermieden werden. Das Einatmen von Staub kann die Atemwege reizen.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidin-2&prime;-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Jede</td><td></td><td>beliebige zelldurchlässige fluoreszierende kleine Rillenbindungssonde für DNA. Verursacht Hautreizungen. Kann allergische Hautreaktionen hervorrufen. Kann Atemwegsreizungen verursachen.</td></tr><tr><td>Eis</td><td>Beliebig</td><td></td><td>NA Die DAPI-Lösung muss auf Eis gehalten werden.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 von Zeiss oder andere</td><td></td> Jedes <td>Fluoreszenzmikroskop kann zur Bestimmung der Meristemlänge verwendet werden.</td></tr><tr><td>Mikroskopischer Objektträger</td><td>Beliebig</td><td>Beliebig</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Eine Pinzette wird benötigt, um das ausgerollte Maisblatt direkt nach der Ernte zu entfalten, um eine geeignete Probe für die Messung der Zelllänge und der Meristemlänge zu schneiden.</td></tr><tr><td>Bildanalyse-Software</td><td>Axiovision (Release 4.8) von Zeiss</td><td>NA</td><td>Die Software kann heruntergeladen werden unter: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Andere Software wie ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kann ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Mikroskop ausgestattet mit DIC</td><td>AxioScope A1, Axiocam ICm1 von Zeiss oder anderen</td><td></td><td>Jedes Mikroskop, ausgestattet mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC), kann zur Messung von Zelllängen verwendet werden.</td></tr><tr><td>R statistische Analysesoftware</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Open Source; Kann unter https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>R Skript</td><td>NA</td><td>NA heruntergeladen</td> werden. <td>Wir verwenden die Kernel-Glättungsfunktion locpoly des Kern Smooth-Pakets (Wand MP, Jones MC.&nbsp; Kernel-Glättung: Chapman & Hall/CRC (1995)). Das Skript ist für Mac und Windows auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.</td></tr></tbody></table>

kinematische analyse der zellteilung und expansion: die quantifizierung der zellulären grundlagen der wachstums- und sampling entwicklungszonen in<em&gt; zea mays</em&gt; blätter

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Wachstumsanalysen werden in der Pflanzenwissenschaft häufig verwendet, um gegensätzliche Genotypen und die Auswirkungen von Umweltbedingungen zu untersuchen. Der zelluläre Aspekt dieser Analysen ist von entscheidender Bedeutung, da das Wachstum durch Zellteilung und Zellverlängerung angetrieben wird. Die kinematische Analyse stellt eine Methodik dar, um diese beiden Prozesse zu quantifizieren. Darüber hinaus ist diese Technik in nicht spezialisierten Labors einfach anzuwenden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung einer kinematischen Analyse in monokotylen Maisblättern (Zea mays) vor. Zwei Aspekte werden vorgestellt: (1) die Quantifizierung von Zellteilungs- und Expansionsparametern und (2) die Bestimmung der Lage der Entwicklungszonen. Dies könnte als Grundlage für das Probenahmedesign dienen und/oder für die Dateninterpretation von biochemischen und molekularen Messungen mit hoher räumlicher Auflösung in der Blattwachstumszone nützlich sein. Die Wachstumszone von Maisblättern wird während des stationären Wachstums geerntet. Einzelne Blätter werden für die Meristemlängenbestimmung mittels einer DAPI-Färbung und Zelllängenprofile mittels DIC-Mikroskopie verwendet. Das Protokoll eignet sich für geschlüpfte monokotyle Blätter, die während des stationären Wachstums geerntet werden, mit Wachstumszonen von mindestens mehreren Zentimetern. Um die Regulation des Pflanzenwachstums besser zu verstehen, müssen Daten zum Wachstum und molekulare Studien kombiniert werden. Ein wichtiger Vorteil der kinematischen Analyse ist daher die Möglichkeit, Veränderungen auf molekularer Ebene mit genau definierten Stadien der zellulären Entwicklung zu korrelieren. Darüber hinaus ermöglicht es eine gezieltere Stichprobenziehung bestimmter Entwicklungsstadien, was bei begrenztem Budget oder begrenzter Zeit nützlich ist.

Hier zeigen wir einen Vergleich zwischen gut bewässerten Pflanzen (Kontrolle, 54% Wassergehalt des Bodens, (SWC)) und Pflanzen ausgesetzt Dürre Stressbedingungen (Dürre, 34% SWC) in Bezug auf ihre Blattwachstum. Alle Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen (16 Stunden Tag / 8 h Nacht, 25 ° C / 18 ° C Tag / Nacht, 300-400 &amp; mgr; Em gewachsen -2 s -1 photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die Trockenheit bis die richtige SWC und...

Die Quantifizierung der Zellteilung und -expansion ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis des Wachstums ganzer Pflanzen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Berechnung zellulärer Parameter vor, die die Wachstumsraten von Maisblättern bestimmen, und heben die Verwendung dieser Daten zur Untersuchung molekularer Wachstumsregulationsmechanismen hervor, indem entwicklungsstadienspezifische Probenahmestrategien gesteuert werden.

Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Blätter

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Die allgemeinen Ziele dieser Analyse bestehen darin, die zelluläre Grundlage des Maisblattwachstums zu ermitteln und diese Daten zu nutzen, um molekulare Wachstumsregulationsmechanismen durch entwicklungsspezifische, stadiengenaue Probennahmestrategien zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie von Pflanzen zu beantworten: Wie tragen Zellteilung und Zellstreckung zu Unterschieden im Wachstum ganzer Organe bei?Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung und räumliche Abbildung biochemischer, molekularer und physiologischer Prozesse, die dem Wachstum eines gesamten Pflanzenorgans zugrunde liegen. Obwohl dieses System Einblicke in das Blattwachstum von Mais ermöglicht, kann die Technik auch für andere Systeme verwendet werden, einschließlich anderer Gräserarten und Organe.Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist entscheidend. Die Schritte zur Ernte, zur zweifachen Probenaufbereitung und zur Messung sind ohne diese Demonstration schwer durchzuführen. Die Verfahren werden von Katrien Sprangers und Viktoriya Avramova demonstriert.Zwei Doktoranden aus meinem Labor. Um eine vollständige chenematische Analyse des Blattwachstums bei Monokotylen durchzuführen, ziehen Sie mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und jeden Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum heran. Sobald ein interessierendes Blatt erscheint, messen Sie täglich mithilfe eines Lineals die Länge des Blattes – also die Strecke vom Boden bis zur Blattspitze –, bis das Blatt vollständig ausgewachsen ist.In dem interessierenden Entwicklungsstadium schneiden Sie den oberirdischen Teil der Pflanze von mindestens fünf repräsentativen Pflanzen so dicht wie möglich an den Wurzeln ab, um den meristematischen Bereich intakt zu halten. Beginnen Sie dann, ausgehend von den äußeren Blättern, alle Blätter bis hin zum gewünschten Blatt vorsichtig nacheinander abzurollen. Entfernen Sie gegebenenfalls einige zusätzliche Millimeter an der Basis, um die Blätter zu lösen.Entfernen Sie anschließend die Spitze und die kleinen Blätter, die vom betreffenden Blatt umschlossen sind, und schneiden Sie ein drei Zentimeter langes Segment vom Blatt ab, beginnend an der Basis auf einer Seite der Mittelrippe. Es ist entscheidend, das Blatt genau dort abzuschneiden, wo es mit dem Stängel verbunden ist. Ein zu hoch angesetzter Schnitt würde zu einer Unterschätzung der Größe des Meristems führen.Den Abschnitt in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäß aufbewahren, das mit einer Lösung aus drei Teilen absolutem Ethanol und einem Teil Essigsäure (Volumen pro Volumen) gefüllt ist, bei vier Grad Celsius für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten. Von der anderen Seite der Vene einen 11 Zentimeter langen Abschnitt von der Basis abschneiden und diesen Abschnitt in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit absolutem Ethanol bei vier Grad Celsius mindestens sechs Stunden lang zur Entfernung der Pigmente lagern. Nach einer erneuten 24-stündigen Behandlung mit absolutem Ethanol bei vier Grad Celsius das Ethanol durch reine Milchsäure ersetzen und den Abschnitt bei vier Grad Celsius weitere 24 Stunden oder bis zur weiteren Analyse aufbewahren.Um das Meristem zu messen, überführen Sie zuerst das drei Zentimeter lange Blattsegment für 20 Minuten in frisch zubereitete Spülpufferlösung. Am Ende der Inkubation überführen Sie das Segment zwei bis fünf Minuten lang im Dunkeln auf Eis in einen Behälter mit DAPI-Färbelösung. Danach montieren Sie das Gewebe schnell auf einen Glasobjektträger und bedecken das Segment mit einem Deckglas.Überprüfen Sie unter dem Mikroskop mittels UV-Fluoreszenz die Fluoreszenz der Epidermiszellen. Danach montieren Sie die Probe in einem Tropfen Spüfpuffer auf einem neuen Objektträger mit einem neuen Deckglas. Verwenden Sie eine 20-fache Vergrößerung, bringen Sie das Segment erneut unter das Mikroskop und scannen Sie die Probe ab, um proliferative mitotische Figuren zu lokalisieren.Vermeiden Sie jegliche formative Zellteilung der sich entwickelnden Stemmata und bestimmen Sie anschließend, wo sich die am weitesten distal gelegene Mitosefigur befindet. Messen Sie mithilfe einer Bildanalyse-Software die volle Länge des Bildrahmens. In diesem Beispiel 645 Mikrometer.Zählen Sie dann die Anzahl der Felder, die die gesamte Meristemlänge von der am weitesten distalen mitotischen Figur bis zur Blattbasis abdecken, und multiplizieren Sie diese Zahl mit der Länge eines einzelnen Feldes, um die volle Meristemlänge zu erhalten. Um ein Zelllängenprofil zu erhalten, übertragen Sie das 11 cm lange Segment aus der Milchsäure auf den Arbeitsplatz und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in 10 ein Zentimeter lange Abschnitte. Bringen Sie die resultierenden Blattsegmente auf einem einzigen Objektträger an, zusammen mit einem kleinen Tropfen Milchsäure.Alle Stücke mit derselben Seite nach oben legen. Anschließend wird der Objektträger unter ein Mikroskop mit Differentialinterferenzkontrastoptik überführt. Beginnend mit dem Segment, das der Blattbasis am nächsten liegt, wird mithilfe eines geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramms die Länge von mindestens 20 Epidermiszellen und Zellreihen, die direkt neben den Spaltöffnungsreihen liegen, vermessen, um eine konsistente Auswahl desselben Zelltyps an gleichmäßig verteilten Positionen entlang jedes Segments sicherzustellen.Achten Sie darauf, die entsprechende Position für jede Messung entlang des Blattes zu notieren. Bestimmen Sie anschließend die durchschnittliche Zelllänge in jedem Millimeter entlang der Blattachse mithilfe eines lokalen Polynom-Glättungsverfahrens, das im R-Skript implementiert ist und als ergänzende Datei eins verfügbar ist. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu glätten.Die Glättung sollte das Rauschen in den Messdaten beseitigen, jedoch die Gesamtform der Kurve nicht beeinflussen. Hier wird ein Vergleich zwischen einer gut bewässerten Pflanze und Pflanzen unter Trockenstressbedingungen hinsichtlich ihres Blattwachstums gezeigt. Die endgültige Blattlänge der Kontrollpflanzen lag aufgrund einer geringeren Blattstreckungsrate um 40 Prozent unter der der trockenstressbelasteten Pflanzen.Die Blattstreckungsrate der durch Trockenstress belasteten Pflanzen liegt um 73 Prozent unter der der gut bewässerten Kontrollen, bedingt durch eine verminderte Zellproduktion, die wiederum hauptsächlich auf einer reduzierten Zellteilungsrate beruht. Die kinematische Analyse liefert eine Abbildung der Lokalisation der Blattwachstumszone und ermöglicht die Probenentnahme mit einer subzonalen Auflösung für molekulare und biochemische Analysen.Beispielsweise zeigt die Quantifizierung von MDA entlang der Wachstumszone des Maisblatts bei Pflanzen unter gut bewässerten Kontroll- und Trockenstressbedingungen einen signifikanten Anstieg dieses Produkts des Lipidabbaus in der gesamten Wachstumszone als Reaktion auf Wasserknappheit. Aufgrund der Verkürzung des Blatts als Reaktion auf die Trockenheit entsprachen die Entwicklungsabschnitte in diesem Experiment nicht zwischen Kontroll- und belasteten Pflanzen. Mithilfe des Zelllängenprofils kann jedoch die Länge der Entwicklungsabschnitte bestimmt werden, wodurch ein Vergleich der MDA-Spiegel in den einzelnen Abschnitten ermöglicht wird.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann eine einzelne Probe innerhalb von vier Stunden verarbeitet werden, sofern das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Meristem während der Gewinnung intakt bleibt. Nach diesem Verfahren können weitere Techniken angewendet werden, wie beispielsweise die Bestimmung molekularer und biochemischer Parameter, um deren Beteiligung an der Wachstumsregulation zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Zellteilung und Zellstreckung in einem wachsenden Maisblatt quantifiziert, die Größe der verschiedenen Wachstumszonen bestimmt und molekulare sowie biochemische Daten entsprechend interpretiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Milchsäure, Essigsäure und EDTA gefährlich sein kann. Daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise das Tragen von Handschuhen und die Reinigung des Mikroskops nach jedem Arbeitsschritt, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

kinematic-analysis-cell-division-expansion-quantifying-cellular-basis

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Mitose ist für jeden lebenden Organismus von entscheidender Bedeutung und Defekte führen oft zu Krebs und Entwicklungsstörungen. Mit diesem Bildgebungsprotokoll und dem Zebrafisch als Modellsystem können Forscher die Mitose in einem lebenden Wirbeltierorganismus und die Vielzahl von Defekten sichtbar machen, die entstehen, wenn mitotische Prozesse defekt sind.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Viele entwicklungsrelevante Gene haben zell- oder gewebespezifische Expressionsmuster. In dieser Arbeit werden LM-RNA-seq-Experimente zur Identifizierung von Genen beschrieben, die an der Grenze zwischen Maisblatt, Blatt, Scheide und in lg1-R-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich exprimiert werden. Die hier diskutierten experimentellen Überlegungen gelten für transkriptomische Analysen anderer Entwicklungsphänomene.

Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Live-konfokale Abbildung stellt Biologen ein leistungsfähiges Werkzeug zum Studium der Entwicklung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Live - konfokale Abbildung von Arabidopsis Blumen zu entwickeln.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

Hier präsentiert sich eine einfache Technik für hochauflösende konfokale Zeitraffer-Bildgebung der Wurzel- und Hypokotyl-Entwicklung für bis zu 3 Tage mit hohen Ziffernblende und Perfluordecalin als Immersionsmedium.

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Dieses Protokoll stellt Informationen zum live-Bild und analysieren schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie.

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung des kortikalen Mikrotubule-Zytoskeletts am triebförmigen Meristem und die Überwachung seiner Reaktion auf Veränderungen der physikalischen Kräfte.

Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Maisblatt-Primordien sind tief umhüllt und gerollt, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Herstellung von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung vor.

Verbesserte Methoden zur Präparation von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung

Dieser Prozess verwendet die Konfokalmikroskopie in Verbindung mit einer fluoreszenzmarkierten Kern- und Chromatinmarkerlinie bei Arabidopsis thaliana, um gleichzeitig die Kern- und Chromatindynamik in Arabidopsis-Wurzeln aufzuzeichnen und Veränderungen in dieser Dynamik als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale zu untersuchen.

Quantitative lebende Zellbildgebung der Kernform und der Chromatindynamik während der Entwicklung und Umweltstress in der Wurzel Arabidopsis thaliana

Erfahren Sie die kinematische Analyse von Zellteilung und Expansion in Maisblättern. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Wachstumsregulationsmechanismen durch entwicklungsspezifische Probenahme.

Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in Zea Mays Blätter (Video) | JoVE Journal

Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in

Weitere Videos entdecken