Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in Zea Mays Blätter

Das übergeordnete Ziel dieser Analyse ist es, die zellulären Grundlagen des Maisblattwachstums zu bestimmen und diese Daten zu nutzen, um molekulare Wachstumsregulationsmechanismen durch die Durchführung entwicklungs- und stadienspezifischer Probenahmestrategien zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage der Pflanzenentwicklungsbiologie zu beantworten. Wie tragen Zellteilung und Zellexpansion zu Unterschieden im Wachstum ganzer Organe bei?

Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung und räumliche Kartierung biochemischer molekularer und physiologischer Prozesse, die dem Wachstum des gesamten Pflanzenorgans zugrunde liegen. Obwohl dieses System Einblicke in das Blattwachstum von Mais geben kann, kann die Technik auch für andere Systeme verwendet werden. Einschließlich anderer Grasarten und Organe.

visuelle Demonstration dieser Methoden ist von entscheidender Bedeutung. Bei der Ernte sind Probenbi-blation und Messschritte ohne diese Demonstration nur schwer durchzuführen. Das Verfahren wird von Katrien Sprangers und Viktoriya Avramova vorgeführt.

Zwei Doktoranden aus meinem Labor. Um eine vollständige chenematische Analyse des Blattwachstums bei Monokotyledonen durchzuführen, züchten Sie mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und jeden Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Zuchtraum. Wenn ein interessantes Blatt erscheint, messen Sie mit einem Lineal täglich die Länge des Blattes, d. h. die Länge vom Boden bis zur Blattspitze, bis das Blatt vollständig ausgebreitet ist.

Schneiden Sie in der interessierenden Entwicklungsphase den oberirdischen Teil der Pflanze von mindestens fünf repräsentativen Pflanzen so nah wie möglich an den Wurzeln ab, um den meristematischen Bereich intakt zu halten. Dann, beginnend mit den äußeren Blättern, rollen Sie vorsichtig alle Blätter bis zum gewünschten Blatt aus, eines nach dem anderen. Entfernen Sie ein paar zusätzliche Millimeter von der Basis, um die Blätter bei Bedarf zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Spitze und die kleinen Blätter, die von dem interessierenden Blatt umschlossen sind, und schneiden Sie ein drei Zentimeter langes Segment aus dem Blatt ab, beginnend von der Basis auf einer Seite der Mittelader. Es ist wichtig, das Blatt genau dort abzuschneiden, wo es mit dem Stiel verbunden ist. Da ein zu hoher Schnitt zu einer Unterschätzung der Größe des Meristems führen würde.

Lagern Sie das Segment in einem 1,5-Milliliter-Reagenzglas, gefüllt mit drei zwei Volumen-ein-Volumen-basierten absoluten Ethanolessigsäurelösung, bei vier Grad Celsius für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten. Schneiden Sie von der anderen Seite der Ader ein 11 Zentimeter langes Segment von der Basis ab und lagern Sie dieses Segment in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das mit absolutem Ethanol gefüllt ist, bei vier Grad Celsius für mindestens sechs Stunden, um die Pigmente zu entfernen. Nach einer zweiten 24-Stunden-Runde in absolutem Ethanol bei vier Grad Celsius wird das Ethanol durch reine Milchsäure ersetzt und das Segment für weitere 24 Stunden oder bis zur weiteren Analyse bei vier Grad Celsius gelagert.

Um das Meristem zu messen, geben Sie zunächst das drei Zentimeter große Blattsegment für 20 Minuten in frisch zubereiteten Spülpuffer. Am Ende der Inkubation wird das Segment für zwei bis fünf Minuten auf Eis im Dunkeln in einen Behälter mit Dapi-Färbelösung gegeben. Montieren Sie dann das Gewebe schnell auf einen Glasobjektträger und decken Sie das Segment mit einem Deckglas ab.

Bestätigen Sie die Fluoreszenz der Epidermiszellen unter einem Mikroskop mit UV-Fluoreszenz. Montieren Sie dann die Probe in einem Tropfen Spülpuffer auf einen neuen Objektträger mit einer neuen Glasabdeckung. Bringen Sie das Segment mit einer 20-fachen Vergrößerung wieder zum Mikroskop und scrollen Sie durch die Probe, um proliferative mitotische Figuren zu finden.

Vermeiden Sie jede formative Zellteilung der sich entwickelnden Stemmata und definieren Sie dann, wo sich die distalste mitotische Figur befindet. Messen Sie mit einem Bildanalyse-Softwareprogramm die volle Länge des Bildrahmens. In diesem Beispiel 645 Mikrometer.

Zählen Sie dann die Anzahl der Frames, die die gesamte Meristemlänge von der distalsten mitotischen Figur bis zur Blattbasis abdecken, und multiplizieren Sie diese Zahl mit der Länge eines Frames, um die volle Meristemlänge zu erhalten. Um ein Zelllängenprofil zu erhalten, übertragen Sie das 11 Zentimeter große Segment von der Milchsäure auf die Bank und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in 10 ein Zentimeter große Segmente. Montieren Sie die resultierenden Blattsegmente auf einen einzigen Objektträger und einen kleinen Tropfen Milchsäure.

Lege alle Teile mit der gleichen Seite nach oben. Übertragen Sie den Objektträger dann unter ein Mikroskop, das mit einer differentiellen Interferenzkontrastoptik ausgestattet ist. Beginnend mit dem Segment, das der Blattbasis am nächsten liegt, verwenden Sie ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm, um die Länge von mindestens 20 replizierten Epidermiszellen und Dateien direkt neben den Stammmataldateien zu messen, um die konsistente Auswahl desselben Zelltyps an gleichmäßig verteilten Positionen entlang jedes der Segmente sicherzustellen.

Nehmen Sie die Ansteckung, um die entsprechende Position für jede Messung im gesamten Blatt zu notieren. Bestimmen Sie dann die durchschnittliche Zellenlänge an jedem Millimeter entlang der Blattachse mithilfe eines lokalen polynomialen Glättungsverfahrens, das im R-Skript implementiert ist, das als ergänzende Datei eins verfügbar ist. Achten Sie darauf, nicht zu glatt zu werden.

Die Glättung sollte das Rauschen in den Celling-Daten entfernen, aber nicht die Gesamtform der Kurve beeinflussen. Hier wird ein Vergleich zwischen gut bewässerten Pflanzen und Pflanzen gezeigt, die in Bezug auf ihr Blattwachstum Trockenstressbedingungen ausgesetzt sind. Die endgültige Blattlänge der Kontrollpflanzen war aufgrund einer geringeren Blattverlängerungsrate um 40 Prozent niedriger als die der trockengestressten Pflanzen.

Die Blattverlängerungsrate der trockengestressten Pflanzen ist aufgrund einer reduzierten Zellproduktion um 73 Prozent niedriger als die von gut bewässerten Kontrollen. Dies wird vor allem durch eine verminderte Zellteilungsrate verursacht. Die kinematische Analyse liefert eine Karte der Lokalisierung der Blattwachstumszone und ermöglicht die Probenahme mit einer subzonalen Auflösung für molekulare und biochemische Analysen.

Zum Beispiel zeigt die MDA-Quantifizierung entlang der Wachstumszone des Maisblattes in Pflanzen, die gut bewässerten Kontroll- und Trockenbedingungen ausgesetzt waren, einen signifikanten Anstieg dieses Produkts des Lipidabbaus in der gesamten Wachstumszone als Reaktion auf Wasserentzugsbedingungen. Aufgrund der Blattverkürzung als Reaktion auf die Trockenheit stimmten die Entwicklungszonen bei den Kontroll- und bei den gestressten Pflanzen in diesem Versuch nicht überein. Anhand des Zelllängenprofils kann jedoch die Länge der Entwicklungszonen bestimmt werden, so dass die MDA-Gehalte in den einzelnen Zonen verglichen werden können.

Einmal gemeistert, kann eine einzelne Probe in vier Stunden verarbeitet werden, wenn die Technik richtig angewendet wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Meristem während der Ernte intakt zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken angewendet werden, wie z. B. die Bestimmung molekularer und biochemischer Parameter, um ihre Beteiligung an der Wachstumsregulation zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zellteilung und Zellexpansion in wachsenden Maisblättern quantifiziert, die Größe der verschiedenen Wachstumszonen bestimmt und molekulare und biochemische Daten entsprechend interpretiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Milch- und Essigsäure sowie EDTA gefährlich sein kann. Daher sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Reinigen des Mikroskops in jeder Phase nach dem Gebrauch getroffen werden.