Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in

Die allgemeinen Ziele dieser Analyse bestehen darin, die zelluläre Grundlage des Maisblattwachstums zu ermitteln und diese Daten zu nutzen, um molekulare Wachstumsregulationsmechanismen durch entwicklungsspezifische, stadiengenaue Probennahmestrategien zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie von Pflanzen zu beantworten: Wie tragen Zellteilung und Zellstreckung zu Unterschieden im Wachstum ganzer Organe bei?

Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung und räumliche Abbildung biochemischer, molekularer und physiologischer Prozesse, die dem Wachstum eines gesamten Pflanzenorgans zugrunde liegen. Obwohl dieses System Einblicke in das Blattwachstum von Mais ermöglicht, kann die Technik auch für andere Systeme verwendet werden, einschließlich anderer Gräserarten und Organe.

Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist entscheidend. Die Schritte zur Ernte, zur zweifachen Probenaufbereitung und zur Messung sind ohne diese Demonstration schwer durchzuführen. Die Verfahren werden von Katrien Sprangers und Viktoriya Avramova demonstriert.

Zwei Doktoranden aus meinem Labor. Um eine vollständige chenematische Analyse des Blattwachstums bei Monokotylen durchzuführen, ziehen Sie mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und jeden Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum heran. Sobald ein interessierendes Blatt erscheint, messen Sie täglich mithilfe eines Lineals die Länge des Blattes – also die Strecke vom Boden bis zur Blattspitze –, bis das Blatt vollständig ausgewachsen ist.

In dem interessierenden Entwicklungsstadium schneiden Sie den oberirdischen Teil der Pflanze von mindestens fünf repräsentativen Pflanzen so dicht wie möglich an den Wurzeln ab, um den meristematischen Bereich intakt zu halten. Beginnen Sie dann, ausgehend von den äußeren Blättern, alle Blätter bis hin zum gewünschten Blatt vorsichtig nacheinander abzurollen. Entfernen Sie gegebenenfalls einige zusätzliche Millimeter an der Basis, um die Blätter zu lösen.

Entfernen Sie anschließend die Spitze und die kleinen Blätter, die vom betreffenden Blatt umschlossen sind, und schneiden Sie ein drei Zentimeter langes Segment vom Blatt ab, beginnend an der Basis auf einer Seite der Mittelrippe. Es ist entscheidend, das Blatt genau dort abzuschneiden, wo es mit dem Stängel verbunden ist. Ein zu hoch angesetzter Schnitt würde zu einer Unterschätzung der Größe des Meristems führen.

Den Abschnitt in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäß aufbewahren, das mit einer Lösung aus drei Teilen absolutem Ethanol und einem Teil Essigsäure (Volumen pro Volumen) gefüllt ist, bei vier Grad Celsius für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten. Von der anderen Seite der Vene einen 11 Zentimeter langen Abschnitt von der Basis abschneiden und diesen Abschnitt in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit absolutem Ethanol bei vier Grad Celsius mindestens sechs Stunden lang zur Entfernung der Pigmente lagern. Nach einer erneuten 24-stündigen Behandlung mit absolutem Ethanol bei vier Grad Celsius das Ethanol durch reine Milchsäure ersetzen und den Abschnitt bei vier Grad Celsius weitere 24 Stunden oder bis zur weiteren Analyse aufbewahren.

Um das Meristem zu messen, überführen Sie zuerst das drei Zentimeter lange Blattsegment für 20 Minuten in frisch zubereitete Spülpufferlösung. Am Ende der Inkubation überführen Sie das Segment zwei bis fünf Minuten lang im Dunkeln auf Eis in einen Behälter mit DAPI-Färbelösung. Danach montieren Sie das Gewebe schnell auf einen Glasobjektträger und bedecken das Segment mit einem Deckglas.

Überprüfen Sie unter dem Mikroskop mittels UV-Fluoreszenz die Fluoreszenz der Epidermiszellen. Danach montieren Sie die Probe in einem Tropfen Spüfpuffer auf einem neuen Objektträger mit einem neuen Deckglas. Verwenden Sie eine 20-fache Vergrößerung, bringen Sie das Segment erneut unter das Mikroskop und scannen Sie die Probe ab, um proliferative mitotische Figuren zu lokalisieren.

Vermeiden Sie jegliche formative Zellteilung der sich entwickelnden Stemmata und bestimmen Sie anschließend, wo sich die am weitesten distal gelegene Mitosefigur befindet. Messen Sie mithilfe einer Bildanalyse-Software die volle Länge des Bildrahmens. In diesem Beispiel 645 Mikrometer.

Zählen Sie dann die Anzahl der Felder, die die gesamte Meristemlänge von der am weitesten distalen mitotischen Figur bis zur Blattbasis abdecken, und multiplizieren Sie diese Zahl mit der Länge eines einzelnen Feldes, um die volle Meristemlänge zu erhalten. Um ein Zelllängenprofil zu erhalten, übertragen Sie das 11 cm lange Segment aus der Milchsäure auf den Arbeitsplatz und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in 10 ein Zentimeter lange Abschnitte. Bringen Sie die resultierenden Blattsegmente auf einem einzigen Objektträger an, zusammen mit einem kleinen Tropfen Milchsäure.

Alle Stücke mit derselben Seite nach oben legen. Anschließend wird der Objektträger unter ein Mikroskop mit Differentialinterferenzkontrastoptik überführt. Beginnend mit dem Segment, das der Blattbasis am nächsten liegt, wird mithilfe eines geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramms die Länge von mindestens 20 Epidermiszellen und Zellreihen, die direkt neben den Spaltöffnungsreihen liegen, vermessen, um eine konsistente Auswahl desselben Zelltyps an gleichmäßig verteilten Positionen entlang jedes Segments sicherzustellen.

Achten Sie darauf, die entsprechende Position für jede Messung entlang des Blattes zu notieren. Bestimmen Sie anschließend die durchschnittliche Zelllänge in jedem Millimeter entlang der Blattachse mithilfe eines lokalen Polynom-Glättungsverfahrens, das im R-Skript implementiert ist und als ergänzende Datei eins verfügbar ist. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu glätten.

Die Glättung sollte das Rauschen in den Messdaten beseitigen, jedoch die Gesamtform der Kurve nicht beeinflussen. Hier wird ein Vergleich zwischen einer gut bewässerten Pflanze und Pflanzen unter Trockenstressbedingungen hinsichtlich ihres Blattwachstums gezeigt. Die endgültige Blattlänge der Kontrollpflanzen lag aufgrund einer geringeren Blattstreckungsrate um 40 Prozent unter der der trockenstressbelasteten Pflanzen.

Die Blattstreckungsrate der durch Trockenstress belasteten Pflanzen liegt um 73 Prozent unter der der gut bewässerten Kontrollen, bedingt durch eine verminderte Zellproduktion, die wiederum hauptsächlich auf einer reduzierten Zellteilungsrate beruht. Die kinematische Analyse liefert eine Abbildung der Lokalisation der Blattwachstumszone und ermöglicht die Probenentnahme mit einer subzonalen Auflösung für molekulare und biochemische Analysen.

Beispielsweise zeigt die Quantifizierung von MDA entlang der Wachstumszone des Maisblatts bei Pflanzen unter gut bewässerten Kontroll- und Trockenstressbedingungen einen signifikanten Anstieg dieses Produkts des Lipidabbaus in der gesamten Wachstumszone als Reaktion auf Wasserknappheit. Aufgrund der Verkürzung des Blatts als Reaktion auf die Trockenheit entsprachen die Entwicklungsabschnitte in diesem Experiment nicht zwischen Kontroll- und belasteten Pflanzen. Mithilfe des Zelllängenprofils kann jedoch die Länge der Entwicklungsabschnitte bestimmt werden, wodurch ein Vergleich der MDA-Spiegel in den einzelnen Abschnitten ermöglicht wird.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann eine einzelne Probe innerhalb von vier Stunden verarbeitet werden, sofern das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Meristem während der Gewinnung intakt bleibt. Nach diesem Verfahren können weitere Techniken angewendet werden, wie beispielsweise die Bestimmung molekularer und biochemischer Parameter, um deren Beteiligung an der Wachstumsregulation zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Zellteilung und Zellstreckung in einem wachsenden Maisblatt quantifiziert, die Größe der verschiedenen Wachstumszonen bestimmt und molekulare sowie biochemische Daten entsprechend interpretiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Milchsäure, Essigsäure und EDTA gefährlich sein kann. Daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise das Tragen von Handschuhen und die Reinigung des Mikroskops nach jedem Arbeitsschritt, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.