Name: Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln Escherichia coli: Entwurf, Herstellung und Reinigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Lernen Sie die Herstellung und Reinigung enzymgefüllter äußerer Membranvesikel aus Escherichia coli. Diese Methode verbessert die Enzymstabilität für zellfreie Katalysen in Biochemie und Biotechnologie erheblich.

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Diese Forschung wurde vom Office of Naval Research aus Kernmitteln finanziert, die dem Naval Research Laboratory zur Verfügung gestellt wurden.

1. Herstellung der Plasmide <ol><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pET22) mit dem Ankerprotein (OmpA) zu einer biorthogonales Verknüpfung Domäne fusioniert (bezeichnet in diesem Protokoll als Anker-ST), Epitop - Tag (wie 6xHis, myc oder FLAG - Tags für die Reinigung und Identifizierung), periplasmatischen Lokalisation tag, Antibiotikaresistenz, und geeignete Replikationsursprung auf der Basis der ausgewählten Bakterienstamm 7. <ol><li> Extrahieren Plasmid-DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA-Extraktions-Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pACYC184) mit dem Enzym / Protein (PTE) innerhalb der OMV an die komplementäre bioorthogonale Verknüpfung Domäne des Ankerproteins zu dem fusionierten verpackt werden ( im Sinne dieses Protokoll als Enzym-SC), Epitop - Tag, periplasmatische Lokalisierung Tag, Antibiotika-Resistenz, die als Ankerprotein-Plasmid unterschiedlich ist, und geeignete origin der Replikation auf dem ausgewählten Bakterienstamm 7 basiert. <ol><li> Extrahieren Plasmid - DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA - Extraktions - Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers 7. </li></ol></li></ol> 2. Erzeugung eines OMV Verpackung E. coli Kultur <ol><li> Plasmidisolierung <ol><li> Reinige Plasmide kodieren , das Enzym-SC konstruieren und Anker-ST - Konstrukte aus getrennten Leitungen Wartungszelle Kommerzielle Plasmidisolation Kit gemäß Herstellerprotokoll 7 verwenden. Bestimmen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen wird. </li></ol></li><li> Co-Transformation <ol><li> Wählen Sie ein E. coli - Stamm, der kommerziell erhältlich ist , die Proteinexpression zu erleichtern. HINWEIS: BL21 (DE3) -Zellen wurden hier verwendet. Die T7-Lysogen wird für die Expression des anker ST Konstrukts erforderlich, die für prot auf dem T7-Promotor und T7-RNA-Polymerase beruhtein Ausdruck. Verwendung anderer Bakterienstämme erfordert entweder die Anwesenheit des T7 - Lysogen - Gens oder die Verwendung eines Plasmids , ausgenommen pET22 7. </li><li> Verdünnen gereinigte Plasmid-DNA zu äquivalenten molaren Konzentrationen dann wandeln sie in kompetente Bakterienzellen entweder über Hitzeschock-Transformation oder Elektroporation gemäß dem Protokoll des Herstellers für die kompetenten Zellen ausgewählt. </li><li> Platte transformierten Zellen auf antibiotikahaltigen Luria-Bertani (LB) Agarplatten sowohl mit Ampicillin (pET22) und Chloramphenicol (pACYC184); beide in Endkonzentrationen von 25 ug / ml. </li><li> Legen Sie die Kulturschale bei 37 ° C über Nacht nur Klone zu isolieren beide Plasmide enthalten. HINWEIS: Kolonien, die Antibiotika-Selektion überleben wird für alle zukünftigen OMV Präparate verwendet werden. Antibiotika (Ampicillin und Chloramphenicol) wird für alle flüssigen Kulturen zugegeben werden Selektionsdruck aufrecht zu erhalten und um die Anwesenheit beider Plasmide gewährleistet. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produktion <ol><li> Colony Expansion <ol><li> Beimpfen von 5 ml Kulturmedium (typischerweise Terrific Broth (TB) oder LB) Antibiotika bei den genannten Konzentrationen (Schritt 2.2.3) mit einer einzelnen Kolonie aus den Selektionsplatten beschrieben in 2.2.4 enthält. </li><li> Führen Sie eine 1: 100-fache Verdünnung der über Nacht Starterkultur in verwirrte Kulturflaschen. HINWEIS: ein Volumen von Medien zwischen 250-500 ml verwenden. </li><li> Halten die Kultur bei 37 ° C bei 250 Upm Schütteln, dass eine ausreichende Belüftung der Kultur gewährleistet ist, erreicht. </li></ol></li><li> Induktion von jedem Plasmid <ol><li> Erlauben die Bakterienkultur bis zu einer OD 600 von 0,6-0,8, etwa 3 h Wachstum nach Beimpfung des Hauptwachstumskolben wachsen. </li><li> Um die endgültige Ausbeute von PTE-SC beladenen Vesikel zu verbessern, Zentrifuge die gesamte Kultur bei 7000 × g für 15 min. Zellpellet in vorgewärmte, frische Kulturmedien. HINWEIS: Diese Optional Schritt hilft eine leere OMV zu entfernen, die die Induktion PTE-SC vor in den Kulturmedien vorhanden sind. </li><li> Machen Sie eine 20% ige Stammlösung von L-Arabinose in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. Store L-Arabinose-Lösung bei 4 ° C für 2-4 Wochen. </li><li> Fügen Sie den L-Arabinose-Lösung der Kulturflasche bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,2% PTE-SC Produktion zu initiieren. HINWEIS: Dies hilft, den periplasmatischen Raum mit PTE-SC vor der Förderung der verstärkten Vesikulation durch Induktion des mutierten OmpA-ST vorab zu laden. </li><li> Machen Sie eine 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Lösung in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. HINWEIS: IPTG muss sofort einmal mit Feuchtigkeit versorgt werden. Aliquots von IPTG kann für 3-6 Monate eingefroren werden gespeichert und können unmittelbar vor auftauen zu verwenden. </li><li> Hinzufügen IPTG nach weiteren 3 Stunden Inkubationszeit bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM Herstellung des OmpA-ST zu initiieren. </li><li> Lassen Sie die cultur für eine weitere 8-14 h bei 37 ° C wachsen unter Schütteln. </li></ol></li></ol> 4. OMV Reinigung <ol><li> Entfernung von intakten Bakterien <ol><li> Zentrifugieren der Bakterienkulturmedium für 15 min bei 7000 xg bei 4ºC intakten Bakterien zu pelletieren. </li><li> Dekantieren und zu speichern, die Medien von der Spitze der Post Zentrifugation Zellpellet wird vorsichtig, um nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 für einen zusätzlichen Zentrifugationszyklus alle intakten Bakterien aus dem Kulturmedium ist sicher entfernt werden, um sicherzustellen, dekantieren und die Medien speichern. </li></ol></li><li> Entfernung von Proteinaggregaten <ol><li> Reinigung weiter die Bakterienkulturmedien ein 0,45 um Membranfilter verwendet, um restliche unerwünschte Bakterien und große Zellmaterial zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie eine biologisch kompatiblen Membranmaterial für höhere Gewinnungsraten und niedriger Proteinadsorption wie Celluloseacetat (CA) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF). Spritzenfilter Volumen weniger als 100 ml und Vakuumfiltervolumen größer als 100 ml. <ol><li> Um Spritzenfilter, Kulturmedium in sterile 10-50 ml Spritze ziehen. Bringen 0,45 um Filter zu Luer Ende Spritze. Drücken Sie Kolben und sammeln Durchfluss in ein neues Gefäß. </li><li> Vakuumfilter Kulturmedium auf eine sterile Filtrationsvorrichtung übertragen. Bringen Einheit zur Vakuumpumpe oder Absauger versenken Sog zu erzeugen. Übertragen gefilterten Mediums zu neuen Schiff. </li></ol></li></ol></li><li> Die Isolierung von OMV über Ultrazentrifugation <ol><li> Fügen Sie die gefilterten Kulturmedien in Zentrifugenröhrchen vorsichtig gegenüberliegende Rohre in der Zentrifuge zu balancieren. </li><li> Pellet bei ~ 150.000 xg für 3 h bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge des entsprechenden Rotors unter Verwendung sowohl des Instruments passend und -röhren verwendet wird. </li><li> Dekantiert die OMV abgereichertem Kulturmedien von der OMV Pellet, darauf achten, daß die OMV Pellet zu stören, sofort bei der Fertigstellung of Zentrifugieren als Pellet ermöglicht die OMV in den Medien zu bleiben wird das Pellet reduzieren OMV Erholung erweichen. HINWEIS: Dieses Pellet leicht braun werden und in Abhängigkeit von der Ausgangsbetrag der Bakterienkultur kann oder mit dem Auge nicht sichtbar sein. direkt von der Spitze des Zentrifugationsröhrchens die Medien Ansaugrauchmelder ist auch eine Option, wenn man bedenkt, dass die mehr Medien aus dem OMV entfernt Pellet die reineren die endgültige OMV Probe sein wird. </li><li> Speichern Sie die zentrifugiert Überstand für eine spätere dynamische Lichtstreuung (DLS) Tests, um sicherzustellen, dass die OMV Partikel von den Medien völlig erschöpft waren. </li><li> Hinzufügen 0,5-1 ml sterilfiltriert Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4 oder 100 mM N - Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES) Puffer bei pH 8,0 auf das OMV Pellet ermöglicht es für 30 min bei RT inkubiert. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht trocknet. HINWEIS: Extremes in Ionenstärke der Lösung, pH-Wert und Temperatur kann in reduzierter OMV Löslichkeit führen und fördern aggresuchung. </li><li> Pipettieren vorsichtig die gereinigte OMV Lösung aus dem Zentrifugenröhrchen, das Mischen sanft das gesamte Pellet, um sicherzustellen, wurde in Lösung gebracht worden. </li></ol></li></ol> 5. OMV Charakterisierung <ol><li> Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen DLS oder Nanopartikel-Tracking-Software nach den Protokollen des Herstellers zur Verfügung gestellt einzigartig für jedes Instrument OMV Größenverteilung und Partikelkonzentration zu bestimmen. HINWEIS: Hier OMV Größenverteilung und Konzentration bestimmt wurde Nanosight LM10 Nanoparticle-Tracking und NTA 2.3 Analyse-Software verwendet wird. <ol><li> Öffnen Sie die Software. </li><li> Schalten Sie Mikroskop und reinigen alle Oberflächen auf dem Mikroskop und Nanopartikel-Tracking-Einheit. </li><li> In ~ 0,5 ml OMV Probe direkt auf das Sichtfenster der Partikel-Tracking-Gerät durch den Luer mit einer sterilen 1-ml-Spritze Montage sicher zu sein, das gesamte Sichtfenster abdecken, ohne dass Luft in das System Blasen zu injizieren. </li><li> Platz ter Nanopartikel-Tracking-Einheit auf dem Mikroskoptisch, und schalten Sie den Laser. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Aufnahme&quot; in der Software. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop Fokus und inszenieren die Partikel auf dem Vorschaubildschirm in der Software-Fenster zu visualisieren. </li><li> Stellen Sie die &quot;Kamera-Shutter&quot; und &quot;Camera Gain&quot; bis helle Partikel eindeutig auf einem dunklen Hintergrund sichtbar gemacht werden. </li><li> Stellen Sie erfassen Dauer auf 60 Sekunden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Record&quot;. </li><li> Wenn Sie gefragt werden, geben Sie die Probe / Gerätetemperatur, die Probe beschriften und in einen Benutzer festgelegten Ordner laufen bei der Fertigstellung der jeweils die Videodaten speichern. </li><li> Halten Sie alle Analyseparameter (Nachweisgrenze, Blur, Min Streckenlänge, Min Erwartete Partikelgröße) auf automatische Erkennung Modus und klicken Sie auf &quot;Prozessablauf.&quot; HINWEIS: Das Handbuch für wie kann jeder Parameter unabhängig für die Feinabstimmung Analyseergebnisse angepasst werden. </li><li> Nehmen Sie Partikelgrößenverteilung und Partikel / ml Konzentration, wie durch die Software bestimmt wird. HINWEIS: Eine typische OMV hydrodynamischen Größenbereich zwischen 30 bis 200 nm mit einer Partikel / ml - Konzentration von ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Die Bestimmung OMV Proteingehalt <ol><li> Verwenden Sie Standard - SDS-PAGE und Western - Blot - Protokolle OMV Reinheit, Enzymproduktion, und die SC-ST Vernetzungseffizienz 7 zu bewerten. HINWEIS: Vernetzungseffizienz wird nicht zu 100% 7 sein. </li></ol></li></ol> 6. Überprüfung der Enzym Verpackung <ol><li> PTE-Aktivitätstest <ol><li> Führen alle enzymatischen Assays in einem geeigneten Puffer, wie 100 mM CHES-Puffer (pH 8) bei 25 ° C entweder in einer Küvette oder in einer Well-Platte 96/384 gemultiplext. </li><li> Werden 5 ul einer 1: 1.000-Verdünnung von Paraoxon in CHES-Puffer und 90 &amp; mgr; l CHES und 5 &amp; mgr; l gereinigter OMV (~ 36-fach konzentriert, im Vergleich zu der OMV-Konzentration im Kulturmedium). Achtung: Paraoxon ist eine giftige Pestizidund muss pro Hersteller und institutionellen Richtlinien behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie Extinktionsablesungen in regelmäßigen Abständen (alle 20 sec für ~ 2 Stunden Gesamtreaktionszeit) bei 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) und bei 348 nm (isosbestischer Punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) zu Überwachung der Reaktionsverlauf des chromogenen paraoxon Abbauprodukt, p - Nitrophenol. HINWEIS: Bei pH - Werten über 8 die dominante deprotonierten Form p - Nitrophenol vorhanden ist , bei 405 nm für eine genaue Überwachung zu ermöglichen. In allen anderen komplexen oder niedrigerer pH - Lösungen ist es notwendig , den isosbestischen Punkt von 348 nm , wie mehrere Formen der p - Nitrophenol zu nutzen , wird anwesend sein. </li><li> Berechnen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten durch die Steigung des linearen Teils der Verlaufskurven aus Schritt 6.1.3 Bestimmung der relativen Menge des PTE in jeder Probe, Verpackungseffizienz und Gesamt PTE Produktion zu vergleichen. </li><li> Führen Standard enzymatischeTestprotokolle K M, V max und k cat für die OMV verkapselt PTE zu bestimmen. ANMERKUNG: Eine Analyse Lineweaver-Burk kann zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet werden , wenn der y-Intercept = 1 / V max und Steigung = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembran-Substrat / Produkt Diffusion. <ol><li> Führen die gleiche Analyse kinetischer Assay, wie in Schritt 6.1 unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Triton X-100 in Puffer CHES von 0-3 Vol% beschrieben. HINWEIS: Die Zugabe von Triton X-100 zu den solubilisierten Funktionen OMV so dass die Lipid-Doppelschicht zu stören, für die der Inhalt der OMV zur Reaktionslösung frei zugänglich zu sein. </li><li> Berechnen und vergleichen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten an jedem Triton X-100 Ebene Trans Passage des Substrats / Produkt durch minimale Änderung der Enzymaktivität (Anfangsgeschwindigkeiten) angegeben, um zu überprüfen, verglichen zur Enzymaktivität in die Abwesenheit von Triton X-100. Wenn eine wesentliche Erhöhung der Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100 beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, daß das Substrat frei diffundieren nicht in das OMV. </li><li> Assay freie Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100, der Enzymaktivität (wie in Abschnitt 6.1 oben beschrieben), um zu überprüfen, wird nicht durch das Tensid selbst gehemmt. HINWEIS: Wenn Aktivität stark von Triton X-100, alternative Additive wie Saponine oder verschiedene Polysorbat / Tween-Tenside können besser geeignet sein Bersten der OMV Membran beeinflusst. </li></ol></li></ol> 7. OMV über Speicher, <ol><li> Einfrieren <ol><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l-Aliquots von gereinigtem OMV direkt in flüssigem Stickstoff zu schnappen die Aliquots einfrieren sicher nicht vollständig zu sein, um die Fläschchen in Wasser getaucht oder Kontakt mit einem flüssigen Stickstoff mit der Probe selbst. HINWEIS: Gereinigte OMV direkt im Puffer werden einschnappen können eingefroren, die zum Lösen der OMV Pellet während des purificat ausgewählt wurdeIonen - Prozess ohne zusätzliche Gefrierschutzmittel notwendig 7. </li><li> Lagern Sie die schockgefroren Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Tauen gefrorenen Aliquots aus Schritt 7.1.1, indem sie bei RT sicher zu sein, nicht zu erwärmen, die Proben platzieren. </li><li> Vor allen Proben für die Speicherung auf diese Weise vorbereitet führen den Enzymtest in Schritt 6.1 Vergleich Anfangsgeschwindigkeiten beschrieben vor und nach dem Einfrieren zu verifizieren, dass es keinen signifikanten Verlust der Enzymaktivität Beitrag Gefrier-Auftau. HINWEIS: Shop gereinigt OMV bei 4 ° C, wenn eine Verringerung der Enzymaktivität aufgrund von Gefrieren beobachtet wird. </li></ol></li><li> Die Gefriertrocknung <ol><li> Lyophilisieren die schockgefroren gereinigte OMV Aliquots im Handel erhältliche Lyophilisation Ausrüstung verwendet 21. </li><li> Die lyophilisierte Aliquots bei RT für Wochen oder bei -80 ° C für viele Monate. </li><li> Das gleiche Volumen von gereinigtem Wasser auf das gefriergetrocknete OMV als vor der Lyophilisation und lassen Sie sich für 30 min bei RT stehen t rehydrierener probieren. Vorsichtig mischen, wenn notwendig, sicher zu sein, nicht zu verwirbeln oder die OMV beschallen. </li><li> In lyophilisierten OMV Pulver direkt auf Point-of-Care für Anwendungen, in denen eine vorherige Verdünnung / Solubilisierung nicht notwendig ist. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Protokoll - Funktionen eine repräsentative gerichtet Verpackungstechnik zu demonstrieren , in dem ein Enzym von Interesse produziert und verpackt in die OMV durch E. coli. Wie bei vielen komplexen Techniken gibt es mehrere Bereiche, in denen das Protokoll zur Verwendung in verschiedenen einzigartigen Anwendungen aufzunehmen modifiziert werden, von denen einige im Folgenden beschrieben. Während der Mechanismus der OMV Verpackung und Enzym Verkapselung kann auf die spezifischen Bedürfnisse angepasst werden ...

Dargestellt ist hier ein Verfahren für die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von Enzym-beladenen bakterielle äußere Membranvesikel (OMV). OMV sind klein, vor allem unilamellare, Proteo , die von 30 bis 200 nm 1,2 in einem Größenbereich. Alle Gram-negative und Gram-positive Bakterien , die bisher untersucht wurden , haben gezeigt , Freisetzung von entweder OMV oder extrazelluläre Vesikel (EV) von ihrer Oberfläche 3,4. Der genaue Mechanismus, durch den OMV produziert haben noch voll auf Grund der unterschiedlichen Bakterienpopulationen aufgeklärt werden, dass sie so gut wie die unterschiedlichen Funktionen ausscheiden, die sie dienen. OMV wurden , um eine breite Palette von Fracht aus kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen an genetischem Material dazu dient , eine Vielzahl von komplexen Signal, Gen - Translokation zu transportieren gezeigt, und Virulenzfunktionen 5,6. Die genauen Mechanismen der OMV Biogenese sind nicht gut charakterisiert, und scheinen zwischen Bakterienarten zu unterscheiden. Trotz this der Tat haben wir ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz eines rekombinanten Proteins in OMV entwickelt durch eine synthetische Bindung zwischen einem Protein von Interesse und eine hoch reichlich Protein endogen der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV entsteht. In Abwesenheit eines synthetischen Bindung oder künstlich eingearbeitet Affinität zwischen dem rekombinant exprimierten Protein und der OMV die beobachtete Verpackungseffizienz sehr niedrig 7. Dieses Ergebnis ist in dem Augenblick der OMV Bildung an der Bakterienoberfläche oder durch gerichtete Verpackung durch Mechanismen, die nicht gut verstanden sind innerhalb der OMV erfolgt entweder durch Zufall Verkapselung als Einbau der Proteine ​​zu erwarten. Ein gewisser Erfolg wurde in Verpackungsproteine ​​einfach durch Überexpression in den periplasmatischen Raum beobachtet worden, die auf zufällige Chance Verkapselung, aber effektive Verpackung setzt eine hohe Proteinabhängig mit einigen Proteinen mit hohem Wirkungsgrad Verpackung im Vergleich zu anderen tham Do Paket nicht mehr 8-10. Durch die Verwendung von gemeinsamen synthetischen Biologie - Techniken haben wir versucht , Escherichia coli (E. coli) zu konstruieren , ein aktives Enzym von Interesse in OMV gleichzeitig produzieren, verpacken und ausscheiden, die derzeitigen Kenntnissen Beschränkungen hinsichtlich umgeht , wie OMV gebildet werden und wie Ladung durch die Bakterien ausgewählt ist für Verpackung. Für die Zwecke dieser Anmeldung ein Split-Protein Biokonjugation System wurde als der synthetische Verknüpfung der Wahl ausgewählt Richtungs Verpackung in das OMV erleichtern. Wie der Name schon ein Split-Protein Biokonjugation System schlägt besteht aus zwei komplementären Untereinheit Domänen, die miteinander interagieren. Die geteilten Proteindomänen für die Zwecke dieses Protokoll ausgewählt werden als die SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) Domäne und aus dem Streptococcus pyogenes Fibronektin-bindenden Protein (FbaB) 11 abgeleitet werden. Diese Spaltung Proteinsystem ist ungewöhnlich, dass when die beiden Untereinheiten innerhalb der Nähe sind eine Isopeptidbindung bildet sich spontan zwischen dem proximalen Asparaginsäure und Lysin Aminoreste Säure eine kovalente Bindung zu schaffen. Isopeptidbindung Bildung erfordert nicht die Zugabe von Chaperon - Proteinen, katalytische Enzyme oder Cofaktoren und kann bei Raumtemperatur (RT) und über einen weiten Bereich von physiologisch relevanten Bedingungen 12 leicht auftreten. Als Beweis des Konzeptes wurde Phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) aus Brevundimonas diminuta ausgewählt in E. coli 13 OMV abgeleitet verpackt werden. PTE enthält einen zweikernigen Zn / Zn aktiven Stelle und hat die Fähigkeit , Organophosphate durch eine Hydrolysereaktion zu brechen aryldialkylphosphates in Dialkylphosphate und arylalkohole Umwandlung 14. Die Exposition gegenüber Organophosphaten beeinträchtigt richtige Neurotransmitterfunktion durch die Hydrolyse von Acetylcholin durch Acetylcholinesterase bei neuromuskulären Verbindungen Hemmung Making Organophosphat abgeleiteten Verbindungen extrem gefährlich 15. Längerer oder signifikante Exposition gegenüber Organophosphaten führt häufig zu unkontrollierbaren Zuckungen und in der Regel zum Tode führt über Erstickung. Während PTE die höchste katalytische Aktivität gegenüber paraoxon zeigt, ein sehr wirksames Insektizid, ist es auch in der Lage 16 eine breite Palette von anderen Pestiziden und V / G - Typ chemischen Nervenmittel zur Hydrolyse. Zur Erleichterung wurde OMV Verpackung, ein bakterielles Plasmid ausgelegt, dass ein Genkonstrukt kodiert, das einen induzierbaren Promotor, einen periplasmatischen Lokalisierungssequenz und eine kurze multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von der SC-Gensequenz. Einsetzen des PTE Gens zwischen dem Leiter und SC Sequenz zur Erstellung eines genetischen Schalter erlaubt, die die PTE-SC-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum für OMV Verpackung ausgerichtet ist. Während die hier beschriebenen Bemühungen auf PTE konzentrieren, ist das Enzym-Gen untereinander austauschbar und leicht mit einem anderen Gen-Sequenz ersetzt werden könnte, um facilitate Verpackung eines alternativen Enzym oder Protein. Was den zweiten Teil des synthetischen Bindung, eine reichliche outer membrane protein (OmpA) wird gewählt, um die ST-Peptidsequenz zu präsentieren. Während die Wahl des Ankerproteins variieren kann, ist es wesentlich, dass das Protein eine permissive Domäne besitzt, die in den periplasmatischen Raum präsentiert, toleriert das Fusionskonstrukt ohne Zytotoxizität zu induzieren, ist bekannt, in OMV anwesend zu sein, und nicht aggregiert, wenn er rekombinant ist hergestellt. OmpA ist ein 37,2 kDa Transmembran - Porin - Protein , das 17 in der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV stark exprimiert wird bekannt sein. Es liegt im Transport von kleinen Molekülen verwickelt &lt;2 nm in der Größe, in der Bakterienmembran 18. Einheimische OmpA hat zwei strukturell unterschiedliche Domains, ein Trans Beta Barrel - Motiv und ein periplasmatisch löslichen C-terminalen Teil bekannt mit dem Peptidoglycan 19 zu interagieren. In der Mutante OmpA-ST Fusion designed hier der C-terminalen Teil von OmpA wurde gelöscht und die ST wurde dem periplasmatisch zugewandt N- oder C-Terminus fusioniert. Löschen des periplasmatischen Teil OmpA verringert die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und der Peptidoglykan in Membrandestabilisierung resultierende was zu hyper-vesiculation 7. Genomic OmpA wurde zusätzlich zu dem rekombinant exprimierten OmpA-ST-Konstrukt zu mildern Brutto Membrandestabilisierung gehalten.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Immer frisch zubereiten oder aliquotieren und einfrieren.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Kann im Voraus zubereitet und bei 4 °C gelagert werden.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Unmittelbar vor der Verwendung hinzufügen, nachdem das Medium nach dem Autoklavieren ausreichend abgekühlt ist. &nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Jede</td><td></td><td>Zugabe unmittelbar vor der Verwendung, nachdem das Medium ausreichend abgekühlt ist, nachdem es autoklaviert wurde. &nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB-Nährmedien</td><td>Alle</td><td></td><td>anderen Wachstumsmedien werden wahrscheinlich ähnlich funktionieren.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Eines von vielen potenziell geeigneten Tensiden. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kulturflaschen mit Blenden</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Die Kolben fördern ein höheres Maß an Belüftung. &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimaler Puffer für die Paraoxon-Degredierung (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Sehr giftige Substanz, die vorsichtig behandelt und ordnungsgemäß entsorgt werden muss. &nbsp;</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,45 &Mikro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Der Filterdurchmesser hängt vom Probenvolumen ab. Eine proteinarme Bindungsmembran ist entscheidend.</td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Präzise Temperatur und Durchmischung sind für ein reproduzierbares Bakterienwachstum unerlässlich.</td></tr><tr><td>Sorvall Kulturzentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Kulturzentrifuge mit großem Volumen (500 ml) mit einer Kapazität von 7.000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Geeignet für Zentrifugalkräfte > 150.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenrotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Stellen Sie sicher, dass der richtige Rotor und die richtigen Röhrchen verwendet werden und dass alles richtig ausbalanciert ist.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultrazentrifugenröhrchen (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Schar</td><td>344058</td><td>Stellen Sie sicher, dass vor der Verwendung keine Stressfrakturen vorhanden sind und dass die Röhrchen genau ausbalanciert sind.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Notwendig für enzymkinetische Assays.</td></tr><tr><td>DLS/Partikelverfolgung</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>Notwendig für die OMV Größenverteilung und Konzentrationsbestimmung. &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Geeigneter Bakterienexpressionsstamm.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Anstelle dieser können andere Plasmide verwendet werden. &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Anstelle dieser können andere Plasmide verwendet werden. &nbsp;</td></tr><tr><td>Gel-Extraktions-Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Beispiel-Kit.</td></tr></tbody></table>

regie protein verpackung innerhalb der äußeren membran von vesikeln<em&gt; escherichia coli</em&gt;: entwurf, herstellung und reinigung

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Eine zunehmende Interesse der synthetischen Biologie-Techniken bei der Anwendung der äußeren Membran Vesikel (OMV) zu programmieren, führen zu einigen sehr interessanten und einzigartigen Anwendungen für die OMV, wo traditionelle Nanopartikel zu schwierig erweisen zu synthetisieren. Bis heute sind alle gramnegativen Bakterien wurde gezeigt, OMV Demonstrieren Verpackung einer Vielzahl von Ladung zu erzeugen, die kleine Moleküle, Peptide, Proteine ​​und genetische Material enthält. Auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Ladung, sind OMV in vielen biologischen Prozessen beteiligt im Bereich von Zell-Zell-Kommunikation zu Gentransfer und Lieferung von Virulenzfaktoren abhängig davon, welche Bakterien die OMV produzieren. Erst vor kurzem haben bakterielle OMV für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen durch die Entwicklung von Techniken zugänglich zu steuern und direkte Verpackung von rekombinanten Proteinen in die OMV. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Verwendung von Enzym verpackt OMV zur Bereitstellung verbesserter Marktpreisefürll Herstellung von rekombinanten Enzyms erhöht Vesikulation und verbesserte Enzymstabilität. Erfolgreiche Nutzung dieses Protokolls wird in der Schaffung einer Bakterienstamm führen, die gleichzeitig ein rekombinantes Protein produziert und leitet sie für OMV Verkapselung durch eine synthetische Bindung zwischen dem rekombinanten Protein zu schaffen, und eine äußere Membran-Ankerproteins. Dieses Protokoll beschreibt auch Verfahren zur Isolierung von OMV aus Bakterienkulturen sowie für eine angemessene Handhabung Techniken und Dinge zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll für den Einsatz für andere einzigartige Anwendungen wie Anpassung: pharmazeutische Drug Delivery, medizinische Diagnostik und Umweltsanierung.

Gleichzeitige Expression von zwei rekombinanten Proteinen, wie für die OMV Verpackungsstrategie in diesem Protokoll detailliert erforderlich ist, kann durch eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Hier wird ein Zwei-Vektor-System wurde mit kompatiblen Replikationsursprünge und separaten induzierbaren Genkassetten verwendet. Für die Expression des PTE-SC konstruieren Kommerzielle Plasmidrückgrat (pACY184) konstruiert wurde eine Arabinose induzierbare Gen-Kassette und ein Doppel Ar...

Ein Protokoll für die Produktion, Reinigung und Verwendung von enzymverpackten äußeren Membranvesikeln (OMV), das eine verbesserte Enzymstabilität für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen bietet, wird vorgestellt.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Enzymen gefüllte bakterielle äußere Membranvesikel zu reinigen und zu charakterisieren, um sie als katalytische Reagenzien in vitro zu verwenden. Diese Enzymisolationsmethode ermöglicht es, bakterielle OMVs aus Kulturmedien zu gewinnen und anschließend für die katalytische Umsetzung einer Organophosphatverbindung ohne Zellen einzusetzen. Eine gezielte Verpackung innerhalb bakterieller OMVs verbessert die Enzymstabilität unter einer Vielzahl von Reaktions- und Lagerbedingungen erheblich, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die häufig zu einem allmählichen und kontinuierlichen Verlust der Enzymaktivität führen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik erstrecken sich auf die Verpackung von Proteinen, die in mehreren Bereichen von Bedeutung sind, wie beispielsweise bei der Entwicklung von Therapeutika, der Sanierung oder der Entwicklung zellfreier katalytischer Systeme. Obwohl dieses Protokoll die Aufreinigung von OMVs aus E.coli beschreibt, könnten die Techniken bei modifizierter Verpackungsstrategie leicht auch zur Aufreinigung von OMVs aus einer Vielzahl mikrobieller Zellkulturen eingesetzt werden. Nachdem äußere Mem

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

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Aufbereitung von E. coli Sphäroplasten

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Rekombinante Proteinproduktion und -rückgewinnung aus bakteriellen Vesikeln

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 (PPEP-1) ist eine sezernierte Metalloprotease und ein vielversprechendes Wirkstoffziel aus dem humanpathogenen Clostridium difficile. Hier beschreiben wir alle Methoden, die für die Herstellung und Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig sind.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

An der Schnittstelle von organischen und wässrigen Lösungsmitteln fügen sich maßgeschneiderte amphiphile Elastin-ähnliche Proteine zu komplexen supramolekularen Strukturen wie Vesikeln, Fasern und Koacervaten zusammen, die durch Umweltparameter ausgelöst werden. Die beschriebenen Montageprotokolle ergeben Proteinmembran-basierte Fächer (PMBCs) mit abstimmbaren Eigenschaften, die die Verkapselung verschiedener Ladungen ermöglichen.

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur bakteriellen Herstellung von rekombinanten Proteinen, einschließlich typischerweise unlöslicher oder Disulfidbrücken-haltiger Proteine, die in extrazellulären membrangebundenen Vesikeln verpackt sind. Dies hat das Potenzial, auf vielseitige Bereiche der wissenschaftlichen Forschung angewendet zu werden, einschließlich der angewandten Biotechnologie und der Medizin.

Optimierte Herstellung und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli

Lernen Sie die Herstellung und Reinigung enzymgefüllter äußerer Membranvesikel aus Escherichia coli. Diese Methode verbessert die Enzymstabilität für zellfreie Katalysen in Biochemie und Biotechnologie erheblich.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln

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