Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln Escherichia coli: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Aufreinigung und Charakterisierung von enzymgefüllten bakteriellen Vesikeln der äußeren Membran für den Einsatz als in vitro katalytische Reagenzien. Diese Enzymisolationstechnik ermöglicht es, bakterielle OMVs aus Nährmedien zu ernten und dann zur zellfreien Katalyse einer Organophosphatverbindung einzusetzen. Die gerichtete Verpackung in bakteriellen OMVs verbessert die Enzymstabilität über eine Reihe von Reaktions- und Lagerbedingungen erheblich, im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, die oft zu einem allmählichen und kontinuierlichen Verlust der Enzymaktivität führen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Verpackung von Proteinen, die in verschiedenen Bereichen relevant sind, wie z. B. bei der Entwicklung von Therapeutika, der Sanierung oder der Entwicklung zellfreier katalytischer Systeme. Während dieses Protokoll die Aufreinigung von OMVs aus E.coli detailliert beschreibt, könnten die Techniken mit Modifikation der Verpackungsstrategie ohne weiteres für die OMV-Aufreinigung aus einer Vielzahl von mikrobiellen Zellkulturen verwendet werden. Nach der Erzeugung von äußeren Membranvesikeln oder OMVs in Bakterien gemäß dem Textprotokoll wird das intakte Bakterienkulturmedium 15 Minuten lang bei 7.000 G und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Entfernen und bewahren Sie den Überstand auf, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören. Drehen Sie dann den Überstand ein zweites Mal um, um sicherzustellen, dass alle Bakterien aus dem Medium entfernt werden. Um Proteinaggregate und großes zelluläres Material aus dem gespeicherten Nährmedium zu entfernen, ziehen Sie die Lösung in eine sterile 10- bis 50-Milliliter-Spritze.

Bringen Sie einen 0,45-Mikron-Filter an, um das Ende der Spritze anzulocken. Drücken Sie dann den Kolben und sammeln Sie den Durchfluss in einem neuen Rohr. Alternativ können Sie das Nährmedium vakuumfiltrieren, indem Sie es in eine Sterilfiltrationsvorrichtung überführen.

Befestigen Sie das Gerät an einer Vakuumpumpe oder einem Sinksauger, um einen Sog zu erzeugen. Füllen Sie das gefilterte Medium in ein neues Gefäß um. Um die OMVs zu isolieren, wird das gefilterte Kulturmedium in Ultrazentrifugationsröhrchen überführt.

Schleudern Sie das Medium drei Stunden lang bei etwa 150.000 G und vier Grad Celsius mit einem Rotor, der den verwendeten Röhren entspricht. Um einen Verlust der Pelletmasse zu vermeiden, wird unmittelbar nach der Ultrazentrifugation das OMV-abgereicherte Kulturmedium aus dem leicht braunen OMV-Pellet dekantiert, das mit dem Auge sichtbar sein kann oder auch nicht. Das nach der Ultrazentrifugation gebildete OMV Pellet darf nur lose mit dem Zentrifugationsvesikel verklebt werden.

Beim Dekantieren sollte darauf geachtet werden, dass sich das Pellet nicht löst und verloren geht. Bewahren Sie den Überstand für eine spätere dynamische Lichtstreuung auf, um zu überprüfen, ob die OMV-Teilchen vollständig aus dem Medium entfernt wurden. Geben Sie 0,5 bis 1 Milliliter steril filtrierten PBS, PH 7,4 oder einen anderen gefilterten Puffer je nach experimentellem Bedarf oder Bedingungen in das Pellet und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Pipettieren Sie dann vorsichtig die gereinigte OMV-Lösung und mischen Sie sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass das gesamte Pellet löslich ist. Um die OMV-Größenverteilung zu bestimmen, öffnen Sie die DLS-Nanopartikel-Tracking-Software für das verwendete Instrument. Schalten Sie das Mikroskop ein und reinigen Sie alle Oberflächen des Mikroskops und der Nanopartikel-Tracking-Einheit.

Geben Sie mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze ca. 0,5 Milliliter OMV Probe durch die untere Armatur direkt in das Sichtfenster des Partikelverfolgungsgeräts, wobei darauf zu achten ist, dass das gesamte Sichtfenster abgedeckt wird, ohne dass Luftblasen in das System injiziert werden. Platzieren Sie die Nanopartikel-Tracking-Einheit auf dem Mikroskoptisch und schalten Sie den Laser ein. Klicken Sie dann in der Software auf Aufnehmen.

Passen Sie den Fokus und den Tisch des Mikroskops an, um die Partikel auf dem Vorschaubildschirm im Softwarefenster zu visualisieren. Passen Sie den Kameraverschluss und die Kameraverstärkung an, bis helle Partikel auf einem dunklen Hintergrund deutlich sichtbar sind. Passe die Aufnahmedauer auf 60 Sekunden an und klicke dann auf "Aufnehmen".

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie die Temperatur des Beispielgeräts ein, beschriften Sie das Beispiel, und speichern Sie die Videodaten nach Abschluss jedes Durchlaufs in einem vom Benutzer festgelegten Ordner. Behalten Sie alle Analyseparameter im automatischen Erkennungsmodus bei, und klicken Sie auf Prozesssequenz. Erfassen Sie die Partikelgrößenverteilung und -konzentration als Partikel pro Milliliter, wie von der Software bestimmt.

Um den OMV Proteingehalt zu bestimmen, verwenden Sie SDS-PAGE und Western Blots zur Beurteilung der OMV Reinheit der Enzymproduktion und SpyCatcher oder SC zur SpyTag oder ST Vernetzungseffizienz. Es ist zwingend erforderlich, die Expression der Zielenzyme und des Ankerproteins zu bestätigen. Die Expression rekombinanter Proteine kann aus verschiedenen Gründen oft erfolglos sein, und eine erfolgreiche Proteinproduktion sollte vor der OMV Charakterisierung bestätigt werden.

Um einen Phosphotriesterase- oder PTE-Aktivitätsassay durchzuführen, fügen Sie fünf Mikroliter einer Verdünnung von eins bis 1.000 Paraoxon in CHES-Puffer zu fünf Mikrolitern gereinigten OMVs in 90 Mikrolitern CHES hinzu. Nehmen Sie alle 20 Sekunden Absorptionsmessungen bei 405 Nanometern und 348 Nanometern für eine Gesamtreaktionszeit von etwa zwei Stunden vor, um das Fortschreiten des chromogenen Paraoxon-Abbauprodukts p-Nitrophenol zu überwachen. Führen Sie abschließend eine Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Hier sind Beispiele für die Morphologie von gereinigten OMVs aus E.coli über REM gezeigt. OMVs haben eine Größe von 50 bis 250 Nanometern, wie mit Hilfe von Particle Tracking Instrumenten bestimmt. In dieser Grafik ist die absolute OMV-Konzentration dargestellt.

Bei der Co-Transformation von N-terminalem OMP-A-ST mit PTE-SC in Gegenwart von Arabinose und IPTG wurde ein signifikanter Anstieg der OMV-Produktion im Vergleich zu den Kontrollproben beobachtet. Die hier zu sehenden SDS-PAGE und Western Blots charakterisieren den OMV-Proteingehalt und die rekombinante Proteinexpression für OMP-A-ST, natives OMP-A, PTE-SC und OMP-A-ST-PTE-SC. In dieser Abbildung wurden die PTE-Expressionsniveaus und die OMV-Verpackungseffizienz in den Zellpellets, dem UC-Überstand und den gereinigten UC-OMV-Pellets durch erste Geschwindigkeitsmessungen unter Verwendung von Paraoxon als chromogenem Substrat bestimmt.

Hier wurde Triton X-100 verwendet, um die Translokation von Paraoxon über intakte OMV-Doppelschichten zu verifizieren. Es gab kaum einen Aktivitätsunterschied mit oder ohne Detergens, was darauf hindeutet, dass Paraoxon auf der OMV ungehindert durch endogene Poren gelangt. Schließlich sind, wie in diesem Experiment zu sehen ist, die kinetischen PTE-SC-Daten an eine Standard-Michaelis-Menten-Enzymkinetikgleichung für N-terminales OMP-A-ST angepasst, das mit PTE-SC in Gegenwart einer Arabinose und IPTG und PTE-SC in Gegenwart einer Arabinose-Aktivierung kotransformiert wurde.

Sobald alle genetischen Konstrukte hergestellt und bestätigt wurden, können die Enzymverpackung und die OMV-Reinigung über einen Zeitraum von zwei Tagen durchgeführt werden. Ein dritter Tag ist notwendig, um OMVs zu bestätigen und zu charakterisieren, wenn ein neues Konstrukt entwickelt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sicherheitsbewertungen aller Materialien und Zentrifugationsgeräte zu überprüfen.

Darüber hinaus ist es wichtig, den Erfolg jedes Schritts zu überprüfen, bevor Sie mit dem nächsten fortfahren. Die hier beschriebenen Charakterisierungsschritte können durch andere ergänzt werden, um die Enzymverpackung und die OMV-Morphologie zu bestätigen. Die Proteinkonzentration, der Lipidgehalt, die LPS-Konzentration und viele andere Eigenschaften können je nach Nutzlast und Adduktionsbedingungen variieren und nachgelagerte Anwendungen beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie enzymgefüllte OMVs gereinigt und charakterisiert werden können, sowie vorläufige Assays durchführen, um die Aktivität der Enzymfracht zu beurteilen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bakterien und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die richtige aseptische Technik und persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.