Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit Enzymen gefüllte bakterielle äußere Membranvesikel zu reinigen und zu charakterisieren, um sie als katalytische Reagenzien in vitro zu verwenden. Diese Enzymisolationsmethode ermöglicht es, bakterielle OMVs aus Kulturmedien zu gewinnen und anschließend für die katalytische Umsetzung einer Organophosphatverbindung ohne Zellen einzusetzen. Eine gezielte Verpackung innerhalb bakterieller OMVs verbessert die Enzymstabilität unter einer Vielzahl von Reaktions- und Lagerbedingungen erheblich, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die häufig zu einem allmählichen und kontinuierlichen Verlust der Enzymaktivität führen.

Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik erstrecken sich auf die Verpackung von Proteinen, die in mehreren Bereichen von Bedeutung sind, wie beispielsweise bei der Entwicklung von Therapeutika, der Sanierung oder der Entwicklung zellfreier katalytischer Systeme. Obwohl dieses Protokoll die Aufreinigung von OMVs aus E.coli beschreibt, könnten die Techniken bei modifizierter Verpackungsstrategie leicht auch zur Aufreinigung von OMVs aus einer Vielzahl mikrobieller Zellkulturen eingesetzt werden. Nachdem äußere Membranvesikel oder OMVs gemäß dem Textprotokoll in Bakterien erzeugt wurden, zentrifugieren Sie das intakte bakterielle Kulturmedium bei 7.000 ×g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Entfernen und bewahren Sie das Überstandsmaterial auf, wobei darauf geachtet werden muss, das Zellpellet nicht zu stören. Danach wird der Überstand erneut zentrifugiert, um sicherzustellen, dass alle Bakterien aus dem Medium entfernt wurden. Um Proteingaggregate und große zelluläre Bestandteile aus dem aufbewahrten Kulturmedium zu entfernen, wird die Lösung in eine sterile Spritze mit einem Volumen von 10 bis 50 Milliliter aufgezogen.

Ein 0,45-Mikron-Filter an der Luer-Spitze der Spritze befestigen. Danach den Kolben herunterdrücken und das Durchflussvolumen in einem neuen Röhrchen auffangen. Alternativ das Kulturmedium durch Überführen in eine sterile Filtrationsvorrichtung vakuumfiltrieren.

Verbinden Sie das Gerät mit einer Vakuumpumpe oder einem Wasserstrahlpumpe, um Unterdruck zu erzeugen. Überführen Sie das filtrierte Medium in ein neues Gefäß. Um die OMVs zu isolieren, geben Sie das gefilterte Kulturmedium in Ultrazentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Medium mit etwa 150.000 × g und vier Grad Celsius für drei Stunden unter Verwendung eines Rotors, der den verwendeten Röhrchen entspricht. Unmittelbar nach der Ultrazentrifugation, um einen Verlust an Pelletmasse zu vermeiden, gießen Sie das OMV-depletierte Kulturmedium vom leicht bräunlichen OMV-Pellet ab, das möglicherweise mit bloßem Auge sichtbar ist oder auch nicht. Das nach der Ultrazentrifugation gebildete OMV-Pellet kann nur locker an dem Zentrifugationsgefäß haften.

Beim Abgießen ist Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass der Pellet nicht gelöst und verloren geht. Das Überstand aufbewahren, um später eine dynamische Lichtstreuung durchzuführen, um zu überprüfen, ob die OMV-Partikel vollständig aus dem Medium entfernt wurden. 0,5 bis ein Milliliter steril filtriertes PBS, pH 7,4, oder ein anderer filtrierter Puffer entsprechend den experimentellen Anforderungen oder Bedingungen zum Pellet geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Anschießend pipettieren Sie die gereinigte OMV-Lösung vorsichtig und mischen sie sanft, um sicherzustellen, dass der gesamte Pellet vollständig solubilisiert wurde. Um die Größenverteilung der OMV zu bestimmen, öffnen Sie die DLS-Nanopartikel-Tracking-Software für das verwendete Gerät. Schalten Sie das Mikroskop ein und reinigen Sie alle Oberflächen des Mikroskops und der Nanopartikel-Tracking-Einheit.

Unter Verwendung einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze etwa 0,5 Milliliter der OMV-Probe direkt durch die untere Anschlussstelle in das Sichtfenster des Partikelverfolgungsgeräts geben, wobei darauf geachtet werden muss, das gesamte Sichtfenster zu bedecken, ohne Luftblasen in das System einzubringen. Die Nano-Partikelverfolgungseinheit auf den Mikroskopständer stellen und den Laser einschalten. Anschließend im Softwaremenü auf „Capture“ klicken.

Stellen Sie die Fokussierung des Mikroskops und den Objekttisch so ein, dass die Partikel auf dem Vorschaubildschirm im Softwarefenster sichtbar sind. Passen Sie die Belichtungszeit und den Kameraverstärkungsfaktor (Gain) so an, dass helle Partikel vor dunklem Hintergrund deutlich sichtbar sind. Stellen Sie die Aufnahmedauer auf 60 Sekunden ein und klicken Sie dann auf Aufnehmen.

Wenn dazu aufgefordert, geben Sie die Temperatur des Probenahmegeräts ein, beschriften Sie die Probe und speichern Sie die Videodaten am Ende jedes Durchlaufs in einem vom Benutzer festgelegten Ordner. Belassen Sie alle Analyseparameter im Automatikmodus und klicken Sie auf „Sequenz verarbeiten“. Notieren Sie die Partikelgrößenverteilung und -konzentration in Partikeln pro Milliliter, wie sie von der Software bestimmt wird.

Um den Proteingehalt von OMV zu bestimmen, verwenden Sie SDS-PAGE und Western Blots, um die Reinheit der OMV, die Enzymproduktion sowie die Vernetzungseffizienz von SpyCatcher oder SC mit SpyTag oder ST zu beurteilen. Es ist unbedingt erforderlich, die Expression der Zielenzyme und des Ankerproteins zu bestätigen. Die Expression rekombinanter Proteine kann aus verschiedenen Gründen oft nicht erfolgreich sein, weshalb die erfolgreiche Proteinproduktion vor der Charakterisierung der OMV überprüft werden sollte.

Um einen Phosphotriesterase- oder PTE-Aktivitätsassay durchzuführen, geben Sie fünf Mikroliter einer 1:1.000-Verdünnung von Paraoxon in CHES-Puffer zu fünf Mikrolitern gereinigten OMVs in 90 Mikrolitern CHES-Puffer hinzu. Nehmen Sie alle 20 Sekunden Absorptionsmessungen bei 405 Nanometern und 348 Nanometern über eine Gesamtreaktionszeit von etwa zwei Stunden vor, um den Fortschritt des chromogenen Abbauprodukts von Paraoxon, p-Nitrophenol, zu verfolgen. Führen Sie abschließend die Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Hier werden Beispiele für die Morphologie gereinigter OMVs von E.coli mittels REM gezeigt. OMVs variieren in der Größe von 50 bis 250 Nanometern, wie durch Partikelverfolgungsinstrumente bestimmt. In diesem Diagramm ist die absolute OMV-Konzentration dargestellt.

Wenn OMP-A-ST am N-Terminus zusammen mit PTE-SC in Gegenwart von Arabinose und IPTG kotransformiert wurde, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollproben eine signifikante Zunahme der OMV-Produktion. Die hier gezeigten SDS-PAGE- und Western-Blots charakterisieren weiterhin den Proteingehalt der OMV sowie die Expression rekombinanter Proteine für OMP-A-ST, natives OMP-A, PTE-SC und OMP-A-ST-PTE-SC. In dieser Abbildung wurden die Gesamtwerte der PTE-Expression sowie die Verpackungseffizienz der OMV in den Zellpellets, dem UC-Überstand und den gereinigten UC-OMV-Pellets durch Anfangsgeschwindigkeitsmessungen mit Paraoxon als chromogenem Substrat bestimmt.

Hier wurde Triton X-100 verwendet, um die Translokation von Paraoxon über intakte OMV-Doppelschichten zu überprüfen. Es zeigte sich kaum ein Unterschied in der Aktivität mit oder ohne Detergens, was darauf hindeutet, dass Paraoxon frei durch endogene Poren auf den OMV diffundiert. Schließlich wird, wie in diesem Experiment zu sehen ist, die kinetischen Daten von PTE-SC mit einer standardmäßigen Michaelis-Menten-Gleichung für die Enzymkinetik angepasst, und zwar für die N-terminale OMP-A-ST-Kotransformation mit PTE-SC in Gegenwart von Arabinose und IPTG sowie für PTE-SC unter Aktivierung durch Arabinose.

Nachdem alle genetischen Konstrukte hergestellt und bestätigt wurden, können die Enzymverpackung und die OMV-Reinigung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Ein dritter Tag ist erforderlich, um OMVs zu bestätigen und zu charakterisieren, sobald ein neues Konstrukt entwickelt wurde. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sicherheitsstufen aller Materialien und der Zentrifugationsgeräte zu überprüfen.

Zusätzlich ist es wichtig, den Erfolg jedes Schritts vor dem Fortfahren zum nächsten Schritt zu überprüfen. Die hier beschriebenen Charakterisierungsschritte können durch weitere ergänzt werden, um die Enzymverpackung und die OMV-Morphologie zu bestätigen. Die Proteinkonzentration, der Lipidgehalt, die LPS-Konzentration sowie viele andere Eigenschaften können je nach unterschiedlichen Frachtinhalten und Adduktionbedingungen variieren und nachfolgende Anwendungen beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man enzymgefüllte OMVs reinigt und charakterisiert sowie vorläufige Assays zur Beurteilung der Aktivität der Enzymfracht durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bakterien und chemischen Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets entsprechende Vorsichtsmaßnahmen wie eine korrekte aseptische Technik und den Einsatz persönlicher Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.