Name: Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur Isolierung hochreiner RNA aus Pflanzensamen für quantitative Transkriptomanalysen. Diese Technik überwindet Hemmstoffe wie Öle und Polyphenole.

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Wir danken dem Personal von Functional Genomics Facility-und Spektrografie und Bioimaging-Anlage, Nibb Kernforschungsanlagen und Modellpflanze Research Facility, Nibb Bioresource-Center.

1. Extraktion von Gesamt-RNA aus Pflanzensamen <ol><li> Bereiten Puffersätze, Spin-Säulen, 1,5 und 2,0 ml-Polypropylenröhrchen und Nuklease-freies 1,5 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> 1% (w / v) für die Molekularbiologie Polyvinylpyrrolidon (nachstehend bezeichnet als PVP) Lysepuffer für RNA-Extraktion und kräftig vortexen zu Zelle. Inkubieren für 20 min bei 25 ° C vollständig gelöst. Nach 20 min Inkubation wird durch Drehen des Rohrs den Kopf zu verhindern, die Bildung von Blasen des Puffers vorsichtig mischen. Lagerung bei Raumtemperatur (15-25 ° C) vor dem Gebrauch. </li><li> Erntefrüchte aus Arabidopsis thaliana - Pflanzen und in 1,5 ml Polypropylen - Röhrchen auf Eis. Platz Früchte auf Aluminiumplatten gehalten bei 4 ° C und zu isolieren Samen aus den Früchten unter einem Stereomikroskop. <ol><li> Legen Sie die Samen isoliert (ca. 200 Samen) in 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen, die in einem Aluminiumgestell auf Eis gelagert wurden und sofort legen Sie die Röhrchen in flüssigem nitrogen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Schläuche aus dem flüssigen Stickstoff und bringt sie in die Aluminiumgestell auf dem Eis. Füge 100 &amp; mgr; l des Puffers, enthaltend 1% PVP und zentrifugieren für 1 min bei 1.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Homogenisieren der Probe mit einem Edelstahl-Stößel einen Motor-Mühle für 60 s unter Verwendung während der Schlauch in der Aluminium-Rack auf Eis zu halten. </li><li> In 550 &amp; mgr; l des Puffers, der 1% PVP, mischen Sie den Puffer sanft durch das Rohr auf den Kopf, und Inkubation bei 25 ° C für 10 min. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 8000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 550 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 450 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen. </li><li> Verwenden Sie den Überstand als Zelllysats zur RNA-Extraktion. Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers im Handel erhältlichen Kits beschrieben. </li><li> eluierenRNA mit einem Minimalvolumen des Elutionspuffers zur Überwachung der Expressionsmuster von niedrigem Pegel Transkripte eine ausreichend hohe Konzentration an RNA zu gewährleisten. Lagern Sie die RNA in einem Tiefkühlschrank bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Überprüfung der RNA-Qualität <ol><li> durch leichtes Klopfen, und legen Sie den Schlauch in einem Aluminiumgestell auf Eis auftauen Gesamt-RNA, mischen. </li><li> Messen Sie die RNA-Konzentration, A260 / A280-Verhältnis und A260 / A230-Verhältnis ein Mikrovolumen Spektralphotometer. </li><li> Verdünne die Gesamt-RNA in RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 70 ng / &amp; mgr; l. </li></ol> 3. Reverse Transkription von Gesamt-RNA aus Samen <ol><li> Tauen Sie die Gesamt-RNA und Puffersätze aus dem im Handel erhältlichen Kits. Halten Sie die Enzyme aus dem Kit auf Eis, nachdem leichtes Klopfen. Bereiten Sie Nuklease-freies 0,2 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l Gesamt-RNA, 1 &amp; mgr; l Oligo-dT-Primer (50 uM) und 1 uM Zufalls 6-mer (50 uM) zu dem 0,2 ml Polypropylene Röhrchen auf Eis. </li><li> Inkubieren für 15 min bei 37 ° C und auf Eis. </li><li> Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers in die Reverse Transkription-PCR-Kit beschrieben. </li><li> Legen Sie die reverse Transkription Produkte auf Eis vor dem Gebrauch. </li></ol> 4. Quantitative Real-time PCR-Analyse <ol><li> Konstrukt Plasmide, die die Ziel-Gensequenzen unter Verwendung von Protokoll des Herstellers beherbergt. </li><li> Passen Sie die Konzentrationen an 100-500,000 Kopien / ul für die DNA-Vorlagen für die Standardkurven. </li><li> Verdünnen der cDNA-Lösungen (1: 100) mit destilliertem Wasser. </li><li> In 2 ul der verdünnten cDNA-Lösungen und die Plasmide für die Standardkurven an den Master-Mix aus der quantitativen real-time PCR-Kit. </li><li> Set up PCR in Echtzeit die folgenden Zyklusbedingungen verwendet: 95 ° C für 30 s und dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 35 s. </li><li> Analysieren Sie die Kopienzahlen nach dem Mannsteller Anweisungen für den Echtzeit-PCR-System. </li></ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Genexpressionsprofile tragen zum Verständnis der Pflanzenphysiologie; Daher wurden spezifische RNA - Isolierungsverfahren wurden für jede Probe Bedingung 9-12 entwickelt. Wir untersuchten die Prozesse, die während der RNA-Isolierung aus Samen gehemmt wurden und festgestellt, dass RNA zu Silikamembranen Bindung war stark gehemmt. Große Mengen an Öl, Proteine ​​und Polyphenole hemmen RNA-Isolierung. Wir modifiziert, um die RNA-Extraktionsverfahren dieser Verbindungen mit einer Lyse-Lösung vor dem Prozess der RN...

Pflanzen produzieren Samen, die Anlass zu der nächsten Generation geben. Samen akkumulieren große Mengen an Speicherreserven, wie Öle, Kohlenhydrate und Proteine, für die post-germinative Wachstum. Die Menschen nutzen Samenspeicherreserven als Quellen für Lebens- und Futtermittel und damit Pflanzensamen sind eine der wichtigsten Lieferanten von essbaren organischen Stoffen weltweit. Samenerträge zu erhöhen, ist eine wichtige Herausforderung in der Pflanzenwissenschaft. Da Reserven Samenspeicher kommerziell wertvolle Quellen für Lebensmittel und Industriematerialien sind, wurden 1-6 umfassend untersucht die molekularen Mechanismen der Regulation des Stoffwechsels dieser Reserven zu Grunde liegen. Ferner werden diese Mechanismen, welche zur Erhöhung der Samenerträge in Kulturen nützlich sein. Samen entwickeln sich in Pflanzen Ovarien nach der Befruchtung, und sie reifen durch eine Reihe von Entwicklungsstufen 1,6,7. Weiterhin die Entwicklung zugrunde liegenden Samen molekularen Mechanismus zu verstehen, erfordert eine detaillierte, Präzise Genexpressionsprofile von einer Reihe Samen der Entwicklung erzeugt werden. Allerdings sind die hohen Mengen an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen in Pflanzensamen machen es schwierig, hochgereinigter RNA zu isolieren, die eine exakte Profilierung der Genexpression verhindert. Hier stellen wir ein effizientes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Ölsaaten, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen. Mit dieser Methode können die Forscher hoch gereinigter RNA herzustellen. Solche RNA wird zur Überwachung von Transkriptions Änderungen in Schlüsselgenen Steuerung der Stoffwechselregulation von Samenspeicherreserven in der Entwicklung und reifen Ölsaaten nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENISATOR S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Reagenzkit (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Schnelles qPCR-Kit</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

eine effiziente methode zur isolierung von highly purified rna aus samen für die verwendung in quantitative transkriptomanalyse

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Pflanzensamen sammeln große Mengen an Lagerreserven an, die biologisch abbaubares organisches Material enthalten. Der Mensch ist auf Saatgutvorräte für Nahrungsmittel und als Industriematerial angewiesen. Genexpressionsprofile sind leistungsfähige Werkzeuge, um die Stoffwechselregulation in Pflanzenzellen zu untersuchen. Daher sind für die Pflanzenzüchtung detaillierte, genaue Genexpressionsprofile während der Saatgutentwicklung erforderlich. Die Gewinnung von hochreiner RNA ist für die Erstellung dieser Profile unerlässlich. Um hochreine RNA aus Samen zu isolieren, sind effiziente Methoden erforderlich. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von RNA aus Samen, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen enthalten, die eine hemmende Wirkung auf die Isolierung hochreiner RNA haben. Unser Verfahren ermöglicht die Gewinnung von hochreiner RNA aus Samen ohne den Einsatz von Phenol, Chloroform oder zusätzlichen Prozessen zur RNA-Aufreinigung. Diese Methode ist auf Arabidopsis-, Raps- und Sojasaatgut anwendbar. Unsere Methode wird nützlich sein, um die Expressionsmuster von Low-Level-Transkripten in sich entwickelnden und reifen Samen zu überwachen.

Wir untersuchten zunächst die optimale Konzentration von PVP mit Arabidopsis reifen Samen. Gesamt-RNA wurde aus etwa 1000 Samen isoliert gemäß dem Protokoll oben unter Verwendung Zelllysepuffer beschrieben, die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% bzw. 2,0% PVP. Nach Homogenisierung und Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt , während die Ölschicht und Samen Debris (1A) zu vermeiden. <img alt="Abbildung 1" src=...

Wir haben es geschafft, eine Methode zur RNA-Isolierung aus Pflanzensamen zu etablieren, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen enthalten, die eine hemmende Wirkung auf die hochreine RNA-Isolierung haben. Unsere Methode eignet sich zur Überwachung der Expression von Genen mit niedrigen Transkripten in Saatgut.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochreine RNA aus Pflanzensamen zu extrahieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Getreidebiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis von Genprofilen, die die ursprünglichen Transkripte in Saatgut enthalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Forscher in der Lage sind, hochreine RNA mit leichten Modifikationen gegenüber der Spin-Säulen-basierten Methode herzustellen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die hohe Menge an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen im vorderen Sieb es schwierig macht, hochgereinigte RNA zu isolieren. Das Verfahren wird von Kazumi Hikino, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Experiments fügen Sie dem Zelllysepuffer für die RNA-Extraktion ein Prozent Gewicht pro Volumen molekularbiologisches PVP hinzu und wirbeln Sie die Mischung kräftig ein. Inkubieren Sie das PVP 20 Minuten lang bei 25 Grad Celsius, um es vollständig aufzulösen.Mischen Sie den Puffer nach 20 Minuten Inkubation vorsichtig, indem Sie das Röhrchen auf den Kopf stellen, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Ernten Sie Früchte von Arabidopsis thaliana-Pflanzen und legen Sie sie in zwei 1,5 Millimeter große Polypropylen-Röhrchen auf Eis, legen Sie die Früchte dann auf Aluminiumplatten, die bei vier Grad Celsius gehalten werden, und isolieren Sie die Samen von den Früchten unter einem Stereomikroskop. Geben Sie als Nächstes etwa 200 isolierte Samen in 1,5-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen, die zuvor in einem Aluminiumgestell auf Eis gelagert wurden, und legen Sie die Röhrchen sofort in flüssigen Stickstoff.Entfernen Sie die Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie wieder auf Eis in das Aluminiumgestell. Geben Sie 100 Mikroliter des einprozentigen PVP-Puffers in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 1000 mal G, bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation die Probe mit einem Edelstahlstößel unter Verwendung einer Motormühle 60 Sekunden lang homogenisieren, während das Röhrchen im Aluminiumgestell auf Eis gehalten wird; Fügen Sie als Nächstes 550 Mikroliter des 100%PVP-Puffers hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig auf den Kopf, um das Röhrchen zu mischen und zu inkubieren.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Lösung, überführen Sie 550 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Millimeter-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie den Überstand. Übertragen Sie 450 Mikroliter des Überstands auf ein neues 1,5 Millimeter Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie den Überstand als Zelllysat für die RNA-Extraktion mit einem kommerziell erhältlichen Kit.Bereiten Sie ein Aluminiumgestell auf Eis vor und tauen Sie die gesamte RNA-Mischung durch leichtes Klopfen auf, dann stellen Sie das Röhrchen auf das Gitter. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Verdünnen Sie dann die Gesamt-RNA in RNase-freiem Wasser.Tauen Sie die gesamte RNA und die Puffersätze aus dem kommerziellen Kit auf und bewahren Sie die Enzyme aus dem Kit nach vorsichtigem Klopfen auf Eis auf. Bereiten Sie sterilisierte nukleasefreie 0,2-Milliliter-Polypropylenröhrchen für die anschließende Analyse vor. Kombinieren Sie auf Eis fünf Mikroliter Gesamt-RNA, einen Mikroliter oder 50 Mikromolar Oligo-DT-Primer und einen Mikroliter oder 50 Mikromolare zufällige Sechser in das 0,2-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen.Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, dann stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Passen Sie die Plasmidkonzentrationen für DNA-Templates für die Standardkurven an. Als nächstes verdünnen Sie die CDNA-Lösungen bei eins bis 100 mit destilliertem Wasser und fügen Sie dann zwei Mikroliter der verdünnten CDNA-Lösungen und die zuvor vorbereiteten Plasmide für die Standardkurven zum Mastermix aus dem quantitativen Realtime-PCR-Kit hinzu.Richten Sie abschließend die Realtime-PCR ein und fügen Sie die Proben ein. Die Gesamt-RNA wurde aus etwa 1.000 Seeds unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Zelllysepuffer (PVP) isoliert. Die Mengen und die Reinheit der isolierten RNAs zeigen, dass 1,0 % PVP die effektivste Konzentration ist, um große Mengen gereinigter RNA aus Samen zu isolieren.Die Konzentrationen, die A260- und A280-Verhältnisse sowie die A260-A230-Verhältnisse von RNA, die aus 200 Samen isoliert wurde, zeigten, dass diese Methode am besten geeignet war, hochgereinigte RNA aus acht und 12 Tagen nach der Blüte oder DAF-Samen zu isolieren. Obwohl die Mengen an runzeligem und zuckerabhängigem Transkript in der Entwicklung von Samen relativ gering sind, war es möglich, Expressionsänderungen zwischen Samen in verschiedenen Entwicklungsstadien mittels Echtzeit-PCR zu erkennen; Diese Methode ist auch für andere Ölsaaten geeignet, wie in dieser Tabelle gezeigt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie den Weg, Genexpressionsprofile in hohen Konzentrationen von gespeicherten Reserven wie Samen und Früchten zu untersuchen.

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