Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochreine RNA aus Pflanzensamen zu extrahieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Getreidebiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis von Genprofilen, die die ursprünglichen Transkripte in Saatgut enthalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Forscher in der Lage sind, hochreine RNA mit leichten Modifikationen gegenüber der Spin-Säulen-basierten Methode herzustellen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die hohe Menge an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen im vorderen Sieb es schwierig macht, hochgereinigte RNA zu isolieren. Das Verfahren wird von Kazumi Hikino, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Experiments fügen Sie dem Zelllysepuffer für die RNA-Extraktion ein Prozent Gewicht pro Volumen molekularbiologisches PVP hinzu und wirbeln Sie die Mischung kräftig ein. Inkubieren Sie das PVP 20 Minuten lang bei 25 Grad Celsius, um es vollständig aufzulösen.

Mischen Sie den Puffer nach 20 Minuten Inkubation vorsichtig, indem Sie das Röhrchen auf den Kopf stellen, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Ernten Sie Früchte von Arabidopsis thaliana-Pflanzen und legen Sie sie in zwei 1,5 Millimeter große Polypropylen-Röhrchen auf Eis, legen Sie die Früchte dann auf Aluminiumplatten, die bei vier Grad Celsius gehalten werden, und isolieren Sie die Samen von den Früchten unter einem Stereomikroskop. Geben Sie als Nächstes etwa 200 isolierte Samen in 1,5-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen, die zuvor in einem Aluminiumgestell auf Eis gelagert wurden, und legen Sie die Röhrchen sofort in flüssigen Stickstoff.

Entfernen Sie die Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie wieder auf Eis in das Aluminiumgestell. Geben Sie 100 Mikroliter des einprozentigen PVP-Puffers in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 1000 mal G, bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation die Probe mit einem Edelstahlstößel unter Verwendung einer Motormühle 60 Sekunden lang homogenisieren, während das Röhrchen im Aluminiumgestell auf Eis gehalten wird; Fügen Sie als Nächstes 550 Mikroliter des 100%PVP-Puffers hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig auf den Kopf, um das Röhrchen zu mischen und zu inkubieren.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Lösung, überführen Sie 550 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Millimeter-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie den Überstand. Übertragen Sie 450 Mikroliter des Überstands auf ein neues 1,5 Millimeter Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie den Überstand als Zelllysat für die RNA-Extraktion mit einem kommerziell erhältlichen Kit.

Bereiten Sie ein Aluminiumgestell auf Eis vor und tauen Sie die gesamte RNA-Mischung durch leichtes Klopfen auf, dann stellen Sie das Röhrchen auf das Gitter. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Verdünnen Sie dann die Gesamt-RNA in RNase-freiem Wasser.

Tauen Sie die gesamte RNA und die Puffersätze aus dem kommerziellen Kit auf und bewahren Sie die Enzyme aus dem Kit nach vorsichtigem Klopfen auf Eis auf. Bereiten Sie sterilisierte nukleasefreie 0,2-Milliliter-Polypropylenröhrchen für die anschließende Analyse vor. Kombinieren Sie auf Eis fünf Mikroliter Gesamt-RNA, einen Mikroliter oder 50 Mikromolar Oligo-DT-Primer und einen Mikroliter oder 50 Mikromolare zufällige Sechser in das 0,2-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, dann stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Passen Sie die Plasmidkonzentrationen für DNA-Templates für die Standardkurven an. Als nächstes verdünnen Sie die CDNA-Lösungen bei eins bis 100 mit destilliertem Wasser und fügen Sie dann zwei Mikroliter der verdünnten CDNA-Lösungen und die zuvor vorbereiteten Plasmide für die Standardkurven zum Mastermix aus dem quantitativen Realtime-PCR-Kit hinzu.

Richten Sie abschließend die Realtime-PCR ein und fügen Sie die Proben ein. Die Gesamt-RNA wurde aus etwa 1.000 Seeds unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Zelllysepuffer (PVP) isoliert. Die Mengen und die Reinheit der isolierten RNAs zeigen, dass 1,0 % PVP die effektivste Konzentration ist, um große Mengen gereinigter RNA aus Samen zu isolieren.

Die Konzentrationen, die A260- und A280-Verhältnisse sowie die A260-A230-Verhältnisse von RNA, die aus 200 Samen isoliert wurde, zeigten, dass diese Methode am besten geeignet war, hochgereinigte RNA aus acht und 12 Tagen nach der Blüte oder DAF-Samen zu isolieren. Obwohl die Mengen an runzeligem und zuckerabhängigem Transkript in der Entwicklung von Samen relativ gering sind, war es möglich, Expressionsänderungen zwischen Samen in verschiedenen Entwicklungsstadien mittels Echtzeit-PCR zu erkennen; Diese Methode ist auch für andere Ölsaaten geeignet, wie in dieser Tabelle gezeigt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie den Weg, Genexpressionsprofile in hohen Konzentrationen von gespeicherten Reserven wie Samen und Früchten zu untersuchen.