Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung
21. April 2011
Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die physiologische Reaktion einzelner Neuronen während der Bewegung aufzuzeichnen und die Morphologie sowie Neurochemie dieser Neuronen weiter zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Tier anästhesiert und chirurgisch präpariert wird. Der nächste Schritt ist die elektrophysiologische Aufzeichnung der intrazellulären Antwort einzelner Neuronen während der Bewegung.
Nach der Perfusion des Tieres und Aufarbeitung des Gehirns besteht der letzte Schritt darin, die physiologische Reaktion und die neuronale Morphologie zu visualisieren und zu analysieren. Letztendlich kombinieren die Techniken der intrazellulären Neuronenableitung, der Immunchemie und der Analyse, um die Modulationen im Membranpotential einzelner Neuronen während der Bewegung aufzuzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zellkultur liegt darin, dass neuronale Verbindungen und synaptische Eingänge erhalten bleiben und die Neuronen weder ex autotomisiert noch in künstliche Medien überführt werden. Am Tag zuvor injizieren Sie einen neuronalen Tracer, wie beispielsweise Rettichperoxidase, in die peripheren Zielregionen, um motorische Neuronen retrograd zu markieren.
Am nächsten Tag das Tier anästhesieren und auf eine Heizplatte legen, die Haut über dem hinteren Schädel mit einem Tierrasierer unter aseptischen Bedingungen rasieren. Einen Schnitt entlang der Innenseite des Oberschenkels durchführen, eine Kanüle in die Vena femoralis zur zusätzlichen Anästhesie einführen. Eine weitere Kanüle in die Arteria femoralis einführen, um den Blutdruck zu überwachen.
Schließlich wird eine Kanüle in die Luftröhre eingesetzt. Anschließend wird die Ratte in einen stereotaktischen Halter platziert. Es wird eine Kraniotomie durchgeführt, um das Kleinhirn freizulegen, wobei darauf geachtet wird, den großen venösen Sinus zu vermeiden, der sich direkt unter der Verbindung zwischen den Parietal- und Interparietalknochen befindet.
Als Nächstes wird die Oberfläche des Gehirns mit erwärmtem Paraffinöl bedeckt. Danach wird der Unterkiefer an einen Stab geklebt, der mit einem elektromagnetischen Vibrator verbunden ist. Die Bewegung des Unterkiefers wird durch Steuersignale an den Vibrator, die von einem Signalgenerator ausgehen, gesteuert.
Als Nächstes platzieren Sie eine Erdungselektrode unter der Haut neben der Kraniotomie. Zum Vorbereiten der intrazellulären Elektroden ziehen und füllen Sie Mikroelektroden mit einer IDE- oder Tetraethylrodomin-Farbstofflösung. Die Elektrodenimpedanz beträgt 60 bis 80 Megaohm für Axone mit großem Durchmesser und 80 bis 150 Megaohm für kleine afferente Axone und Interneurone.
Als Nächstes platzieren Sie die Mikroelektrode mit Hilfe eines kleinen, hinter dem Kopf des Tieres fest montierten Teleskops in der Kopfstufe des Elektrometers. Visualisieren Sie die Mikroelektrode durch das 20×-eingeschlossene Rotationsprisma des Teleskops. Das Zielgebiet liegt etwa 0,5 Millimeter kaudal zur unteren Grenze des unteren Hügels.
Erstellen Sie nun eine kleine Öffnung in der Pia mater, um die genaue Positionierung an der Oberfläche des Gehirns zu ermöglichen. Überkompensieren Sie die Kapazitätsrückkopplung, sodass beim Kontakt der Elektrode mit dem Gehirn ein Rückkopplungssignal erzeugt wird. Führen Sie die Elektrode vorwärts, bis sie in das Gehirn eindringt.
Der nächste Schritt besteht darin, eine wiederholte Verschiebung des Unterkiefers zu aktivieren. Anschließend unter Verwendung eines Schrittmotors die Elektrode in das Gehirn vorrücken lassen. Sobald ein neuronaler Kontakt durch einen plötzlichen Abfall des DC-Potentials und fortlaufende synaptische Aktivität angezeigt wird, die Vorwärtsschiebung der Elektrode stoppen.
Wenn die Penetration als stabil eingestuft wird, beginnen Sie mit Ramp-and-Hold- und sinusförmigen Kieferbewegungen. Registrieren Sie die neuronale Antwort und charakterisieren Sie das Neuron anhand seiner Reaktion. Anschließend kartieren Sie das rezeptive Feld des Neurons, indem Sie mit einer stumpfen Sonde die Haut um den Kopf sowie die intraorale Kavität untersuchen.
Untersuchen Sie die Reaktion des Neurons auf andere Reize wie Muskelkontraktion oder nozizeptive Reize. Wenn die Ableitungen abgeschlossen sind, injizieren Sie ein bis vier Nanoampere Gleichstrom für eine Gesamtinjektion von 15 bis 70 Nanoampere-Minuten. Überwachen Sie das Eindringen der Elektrode und stellen Sie die Strominjektion ein.
Wenn das Membranpotential positiver als minus 30 Millivolt wird, folgt als nächster Schritt das Schneiden des Gehirngewebes. Nach der Tötung und Durchspülung des Tieres wird das Gehirn entnommen. Anschließend schneidet man 50 bis 100 Mikrometer dicke Schnitte in frontaler, sagittaler oder horizontaler Ebene.
Um die Beziehung zwischen dem markierten Sinnesneuron und einer Vielzahl von Motoneuronen zu visualisieren, bearbeiten Sie das Gewebe mit H-R-P-D-A-B oder Texas Red, abhängig vom Gewebe; zusätzliche Analysen können mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop oder mithilfe von Software zur quantitativen Kolokalisation durchgeführt werden. Bei Bedarf kann eine immunchemische Bearbeitung für Synaptophysin durchgeführt werden, um Synapsen innerhalb der markierten Neuronen genau zu lokalisieren. Diese Abbildung zeigt ein Hirnstammneuron, das nach elektrophysiologischer Charakterisierung mit IDE injiziert wurde.
Aufgrund der neuronalen Reaktion während der Bewegung kann dieses Neuron als sekundäres Muskelspindel-Afferenzneuron identifiziert werden. Die braune Umrandung zeigt die Lage des Nucleus motorius nervi trigemini an. Diese Abbildung zeigt die physiologische Reaktion eines sensorischen Neurons während einer Kieferverlagerung.
Die Reaktion des Neurons wird als momentane Feuerrate dargestellt. Beachten Sie, dass die Reaktion die Unterkieferverlagerung genau nachahmt, was darauf hinweist, dass dieses spezielle Neuron sensorisches Feedback bezüglich der Unterkieferposition liefert. Diese Abbildung zeigt ein sensorisches Neuron, das während der Muskeluntersuchung reagiert hat.
Das Neuron wurde nach der immunchemischen Aufarbeitung mit Ide gefärbt. Die synaptischen Knötchen, die als rote Schwellungen erscheinen, zeigen eine kolokalisierte Verteilung mit dem gelben Synaptophysin. Grün ist eine fluoreszierende Markierungsfärbung.
Diese Abbildung zeigt eine Animation eines Axons eines primären afferenten Neurons aus einem Muskelspindelorgan. Mehrere optische Schnitte des markierten Neurons wurden zur Erzeugung der Animation verwendet. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Elektronenmikroskopie, konfokale Mikroskopie sowie antegrade oder retrograde neuronale Markierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu den ultrasruckturellen Eigenschaften des Neurons, zur Kolokalisation von Neurotransmittern mit synaptischen BNS und zur neuronalen Vernetzung zu beantworten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Technik beschrieben, um die in-vivo-physiologische Reaktion von Säugetierneuronen während der Bewegung zu quantifizieren. Sie korreliert die neuronale Physiologie mit der Morphologie, dem neurochemischen Phänotyp und der synaptischen Mikroschaltung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neuroanatomie
Hintergrund
- Die Aufzeichnung physiologischer Reaktionen von Neuronen ist entscheidend, um ihre Funktion zu verstehen.
- Bestehende Methoden stören häufig die neuronalen Verbindungen.
- Diese Technik erhält die natürliche Umgebung der Neuronen bei.
- Neuronale Tracer werden verwendet, um spezifische Neuronen zur Untersuchung zu markieren.
Zweck der Studie
- Aufzeichnung der physiologischen Reaktion einzelner Neuronen während der Bewegung.
- Charakterisierung der Morphologie und Neurochemie dieser Neuronen.
- Analyse des Zusammenhangs zwischen neuronaler Aktivität und Struktur.
Verwendete Methoden
- Betäubung und chirurgische Vorbereitung des Tieres.
- Elektrophysiologische Aufzeichnung intrazellulärer Antworten während der Bewegung.
- Perfusion des Tieres und Aufbereitung des Gehirns zur Analyse.
- Visualisierung und Analyse der neuronalen Morphologie sowie der physiologischen Antworten.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesene Modulationen des Membranpotentials von Neuronen während der Bewegung.
- Zeigte erhaltene neuronale Verbindungen und synaptische Eingänge.
- Die Kombination von Techniken lieferte Einblicke in das neuronale Verhalten.
- Hob die Vorteile gegenüber herkömmlichen ZellkulturmMethoden hervor.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung der neuronalen Physiologie in vivo.
- Sie vertieft das Verständnis des Zusammenhangs zwischen neuronaler Aktivität und Morphologie.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um verschiedene neuronale Funktionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis, wie einzelne Neuronen während der Bewegung reagieren, ist entscheidend, um Zielstrukturen in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung mit geringerem Risiko zu validieren. Diese Technik ermöglicht Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen, indem sie die physiologische Aktivität mit Morphologie und Neurochemie in intakten Schaltkreisen korreliert und so eine vorhersagbare Sicherheit bezüglich der Zielstrukturenbindung unterstützt. Sie schließt eine wichtige Lücke in der sensorimotorischen Forschung, wo statische oder extrazelluläre Methoden nicht in der Lage sind, funktionelle Dynamiken während des Verhaltens zu erfassen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem neuronale Feuermuster während der Bewegung mit spezifischen Zelltypen und Bahnen verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung der neuronalen Modulation unter physiologisch relevanten Bedingungen.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in Zielstrukturen, indem neurochemische Phänotypen und synaptische Vernetzungen modulierter Neuronen charakterisiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte neuronale Systeme mit quantifizierten physiologischen Reaktionen für die anschließende Wirkstoff-Screening-Analyse vor.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die morphologische und neurochemische Charakterisierung, um konsistente Messergebnisse über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Wiederverwendung der Plattform, indem detaillierte Neuronenabbildungen ermöglicht werden, die mit Immunchemie oder Elektronenmikroskopie zur multiplexen Analyse kombiniert werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem die native Verschaltung während In-vivo-Bewegungsstudien erhalten bleibt.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert Unklarheiten bezüglich der Zielstruktur-Funktion, indem Aktivität mit ultrastrukturellen Merkmalen und synaptischen Eingängen korreliert wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch umfassende Neuronen-Profilierung, die die Ausrichtung von Biomarkern und die Validierung von Signalwegen fördert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Charakterisierung, indem sie strukturelle und funktionelle Daten über Neuronen liefert, die während der Bewegung aktiv sind.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem intrazelluläre Reaktionen während definierter motorischer Verhaltensweisen wie Kieferbewegungen aufgezeichnet werden.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Visualisierung und Quantifizierung der neuronalen Morphologie sowie der physiologischen Modulation.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen des Membranpotentials und Daten zur neurochemischen Kolokalisation, die einen objektiven Vergleich neuronaler Zustände erlauben.
- Translationale Forschung: Schließt an präklinische Arbeiten an, indem die synaptische Mikroschaltung erhalten bleibt und somit Kontinuität von der physiologischen Reaktion bis zur strukturellen Validierung gewährleistet ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Charakterisierungsplattform, die auf sensorische, motorische und Interneuron-Systeme in verschiedenen Krankheitsmodellen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet Vorhersagegenauigkeit, indem mechanistische Unschärfen durch korrelierte Physiologie, Morphologie und Neurochemie reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch festgelegte chirurgische Vorbereitungen, Elektrodenprotokolle und Gewebeprozessierungsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitaleffizienz, indem frühzeitige Ent风险ierung von Zielstrukturen durch umfassende Charakterisierung von Neuronen in vivo ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem multimodale Daten bereitgestellt werden, die Auswahl- und Fortschreitungsentscheidungen bezüglich Zielstrukturen informieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der intrazellulären Elektrophysiologie, chirurgischen Vorbereitung und Techniken zur Injektion neuronaler Tracer.
- Benötigt spezialisierte Instrumentierung, einschließlich Elektrometer, Signalgeneratoren, Schrittmotoren und Mikroskopiesysteme für Licht-, Elektronen- oder konfokale Bildgebung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei Anästhesieprotokollen, Perfusionsmethoden und Gewebeschnitten voraus, um die Datenkonsistenz sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Technik auf andere Neuronentypen oder Hirnregionen außerhalb des trigeminalen Systems angewendet wird.
- Ist durch die technische Schwierigkeit begrenzt, stabile intrazelluläre Ableitungen während von Bewegungen aufrechtzuerhalten, was von der Elektrodenimpedanz und der Stabilisierung des Gehirns abhängt.
