Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

Eine Technik ist beschrieben, um die in vivo physiologische Reaktion von Säugetieren Neuronen während der Bewegung zu quantifizieren und zu korrelieren die Physiologie des Neurons mit neuronalen Morphologie, neurochemischen Phänotyp und synaptischen Mikrotechnik.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die physiologische Reaktion einzelner Neuronen während der Bewegung zu erfassen und die Morphologie und Neurochemie dieser Neuronen weiter zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem das Tier zunächst betäubt und chirurgisch vorbereitet wird. Der nächste Schritt besteht darin, die intrazelluläre Reaktion einzelner Neuronen während der Bewegung elektrophysiologisch aufzuzeichnen.

Nach der Perfusion des Tieres und der Verarbeitung des Gehirns besteht der letzte Schritt darin, die physiologische Reaktion und die neuronale Morphologie zu visualisieren und zu analysieren. Letztendlich kombinieren sich die Techniken der intrazellulären neuronalen Aufzeichnung, Immunchemie und Analyse, um die Modulationen des Membranpotentials einzelner Neuronen während der Bewegung zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zellkultur besteht darin, dass neuronale Verbindungen und synaptische Eingaben erhalten bleiben und die Neuronen weder exautotomisiert noch in künstliche Medien gelegt werden. Am Tag zuvor injiziert das Experiment einen neuronalen Tracer, wie z.B. Meerrettich, Peroxidase, in die peripheren Zielregionen, um Motoneuronen retrograd zu markieren.

Am nächsten Tag betäuben Sie die Ratte und legen Sie sie auf ein Heizkissen, rasieren Sie die Haut und legen Sie den hinteren Schädel mit einer Tierschermaschine in aseptischer Technik über den hinteren Schädel. Machen Sie einen Schnitt entlang der Innenseite des Oberschenkels, führen Sie eine Kanüle in die Oberschenkelvene ein, um eine zusätzliche Anästhesie zu erhalten. Führen Sie eine weitere Kanüle in die Oberschenkelarterie ein, um den Blutdruck zu überwachen.

Führen Sie abschließend eine Kanüle in die Luftröhre ein. Platzieren Sie als Nächstes die Ratte in einem stereotaktischen Rahmen. Führen Sie eine Kraniotomie durch, um das Kleinhirn freizulegen, und achten Sie darauf, den großen Venensinus zu vermeiden, der sich direkt unter der Verbindung zwischen dem parietalen und dem interparietalen Knochen befindet.

Bedecken Sie anschließend die Oberfläche des Gehirns mit erwärmtem Mineralöl. Kleben Sie nun den Unterkiefer auf einen Stab, der mit einem elektromagnetischen Vibrator gekoppelt ist. Die Bewegung des Unterkiefers wird durch Befehlssignale an den Vibrator von einem Signalgenerator gesteuert.

Legen Sie dann eine Erdungselektrode unter die Haut neben der Kraniotomie. Zur Vorbereitung der intrazellulären Elektroden ziehen Sie die Mikroelektroden mit einem IDE- oder Tetraethylstäbchen-Domine-Farbstofflösungstest ab. Diese Elektrodenimpedanz beträgt 60 bis 80 Megaohm für Axone mit großem Durchmesser und 80 bis 150 Megaohm für kleine afferente Axone und Interneuronen.

Platzieren Sie dann die Mikroelektrode mit einem kleinen Teleskop, das hinter dem Kopf des Tieres befestigt ist, in der Kopfstufe des Elektrometers. Visualisieren Sie die Mikroelektrode durch das 20 x geschlossene Rot des Teleskops. Der Zielbereich liegt etwa 0,5 Millimeter an der unteren Grenze des Colliculus inferior.

Machen Sie nun eine kleine Öffnung in die Pia mater, um eine genaue Lokalisierung der Oberfläche des Gehirns zu ermöglichen. Überkompensieren Sie die Kapazitätsrückkopplung, so dass beim Auftreffen der Elektrode auf das Gehirn ein Rückkopplungssignal erzeugt wird. Schieben Sie die Elektrode vor, bis sie in das Gehirn eintritt.

Der nächste Schritt besteht darin, die wiederholte Verschiebung des Unterkiefers zu aktivieren. Schieben Sie dann mit einem Schrittmotor die Elektrode in das Gehirn. Wenn ein neuronales Pfählung durch einen plötzlichen Abfall des Gleichstrompotentials und eine anhaltende synaptische Aktivität angezeigt wird, hören Sie auf, die Elektrode vorzuschieben.

Wenn die Penetration als stabil eingestuft wird, leiten Sie Rampen- und Halte- und sinusförmige Kieferbewegungen ein. Zeichnen Sie die neuronale Reaktion auf und charakterisieren Sie das Neuron anhand seiner Reaktion. Um das rezeptive Feld des Neurons zu kartieren, verwenden Sie als Nächstes eine stumpfe Sonde, um die Haut um den Kopf und die Intraoralhöhle herum zu untersuchen.

Erforschen Sie die Reaktion des Neurons auf andere Reize wie Muskelkontraktion oder schädliche Reize. Wenn die Aufnahmen abgeschlossen sind, injizieren Sie ein bis vier Nanoampere Gleichstrom für eine Gesamtinjektion von 15 bis 70 Nanoampere Minuten. Überwachen Sie die Elektrodenpenetration und brechen Sie die Strominjektion ab.

Wird das Membranpotential positiver als minus 30 Millivolt, wird im nächsten Schritt das Hirngewebe durchtrennt. Nachdem Sie das Tier eingeschläfert und durchblutet haben, entfernen Sie das Gehirn. Schneiden Sie dann 50 bis 100 Mikrometer große Abschnitte entweder in der frontalen, sagittalen oder horizontalen Ebene.

Um die Beziehung zwischen dem markierten sensorischen Neuron und einer Vielzahl von Motoneuronen zu visualisieren, bearbeiten Sie das Gewebe auf H-R-P-D-A-B oder Texas-Rot, je nach Gewebe können zusätzliche Analysen mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop oder unter Verwendung einer quantitativen Kolokalisierungssoftware durchgeführt werden. Wie gewünscht kann eine immunchemische Prozessierung für Synaptophysin durchgeführt werden, um Synapsen innerhalb markierter Neuronen genau zu lokalisieren. Diese Abbildung zeigt ein Hirnstammneuron, dem nach elektrophysiologischer Charakterisierung IDE injiziert wurde.

Basierend auf der neuronalen Reaktion während der Bewegung kann dieses Neuron als sekundäres Muskelspindel-afferentes Neuron identifiziert werden. Der braune Umriss zeigt die Lage des Trigeminus-Motorkerns. Diese Abbildung zeigt die physiologische Reaktion eines sensorischen Neurons während der Kieferverlagerung.

Die Reaktion des Neurons wird als momentane Feuerfrequenz dargestellt. Beachten Sie, dass die Reaktion die Unterkieferverschiebung genau nachahmt, was darauf hindeutet, dass dieses spezielle Neuron sensorisches Feedback in Bezug auf die Unterkieferposition gibt. Diese Abbildung zeigt ein sensorisches Neuron, das während der Muskelsondierung reagierte.

Das Neuron wurde nach immunchemischer Prozessierung mit ide gefärbt. Die synaptischen Stäbe, die als rote Schwellungen erscheinen, sind zusammen mit dem gelben Synaptophysin zu sehen. Grün ist ein fluoreszierender Raketenfleck.

Diese Abbildung ist eine Animation eines Axons aus einem primären afferenten Neuron der Muskelspindel. Zur Generierung der Animation wurden mehrere optische Abschnitte des markierten Neurons verwendet. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Elektromikroskopie, konfokale Mikroskopie und anteriore oder retrograde neuronale Markierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den ultrastrukturellen Eigenschaften der Neuronenkolokalisation von Neurotransmittern mit synaptischem bns und neuronaler Konnektivität zu beantworten.