Name: Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Erfahren Sie die groß angelegte 3D-Bildgebung zur Untersuchung der zellulären Organisation im Neocortex der Maus. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung neuronaler Strukturen und trägt zum Verständnis der Hirnarchitektur bei.

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Wir danken für ihre Beratung auf die AbScale Experimente, Charles Yokoyama zur Bearbeitung des Manuskripts, Atsushi Miyawaki und Hiroshi Hama Eriko Ohshima und Miyuki Kishino für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Forschungsgeldern aus RIKEN, t.h. und Grants-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan, t.h. unterstützt (Innovative Bereiche "Mesoskopischen Neurocircuitry"; 22115004) und S.S. (25890023).

Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.
1. Vorbereitung von Imaging-Kammern
<ol><li>
Imaging-Kammer19
	<ol>
<li>Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slice-Abstandhalter
	<ol>
<li>Bereiten Sie Abstandhalter für Samples, mit Silikon-Beläge mit einer Dicke von 0,5 mm (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Tracer Injektion
Hinweis: Stellen Sie Injektionen in der Pons (2.1) oder superior Colliculus (2.2). Injektion in den Pons Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einem breiten Hirnregion einschließlich der visuellen und motorischen Bereiche während der Injektion in die superior Colliculus Labels Sub zerebralen Projektion Neuronen im visuellen Bereich. Injizieren Sie für Experimente Kochsalzlösung statt eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B. Verwenden Sie für die Wartung von sterilem Zustand sterilisierte Geräte und Plastikhandschuhe mit Ethanol gereinigt.
<ol><li>
Machen Sie Injektionen in der Pons Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>1 µL eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B zu zeichnen (25 µg/µL mit PBS-Puffer) in eine 26 G Hamilton-Spritze.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze und Pumpe auf dem Werkzeugträger eines Manipulator, platziert auf einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator 12° nach hinten aus der vertikalen Achse.</li>
		<li>Betäuben Sie eine männliche oder weibliche Erwachsene Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9) durch die intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) oder durch die Gabe von Isofluran (2 – 3 %). Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stereotaktischen Instrument.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Haare mit einer Rasierklinge um Infektionen zu verhindern und 10 mm von der Kopfhaut zu schneiden, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind. Verabreichen Sie 0,1 mL von 1 % Lidocain mit einer Pipette. Legen Sie den Winkel des Kopfes, die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so angepasst, dass die Bregma und Lambda die gleichen Z-Ebene haben.</li>
		<li>Passen Sie die Position des Manipulators am stereotaktischen Gerät schieben, so dass die Spitze der Spritze in der Nähe der Bregma und zeichnen Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze durch Verschieben der Werkzeughalter auf dem Manipulator.</li>
		<li>Verschieben den Manipulator 5,4 mm nach hinten und 0,4 mm seitlich. Voraus die Spritze, so dass die Spitze in der Nähe der Einstiegspunkt auf dem Schädel ist. Ziehen Sie die Spritze und markieren Sie den Eintrittspunkt.</li>
		<li>Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 1 mm.</li>
		<li>Legen Sie die Spitze der Spritze durch das Loch, so dass die Spitze Tiefe 6,9 mm ist mehr als, dass bei der Bregma gemessen.</li>
		<li>1 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Ziehen Sie die Spritze aus dem Gehirn.</li>
		<li>Bei Bedarf decken Sie die exponierten Gehirn mit kleine Fragmente von mikrofibrillären Gefäßklemme und Sekundenkleber.</li>
		<li>Spülen Sie die exponierten Gehirn mit Kochsalzlösung mit einer Pipette geliefert um Infektionen zu verhindern und die Kopfhaut Naht.</li>
		<li>Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Lassen Sie die Maus wieder aus der Narkose in einem Inkubator bei 30 ° c, in der Regel für 1 h. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Zurückzugeben Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Tiere, nachdem es vollständig erholt hat.</li>
		<li>Halten Sie die Maus für 3 – 7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie Injektionen in den superior Colliculus Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm.</li>
		<li>Verbinden Sie die Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr (Abbildung 2A).</li>
		<li>Füllen Sie die Glaspipette, Kunststoffrohr und Hamilton Spritze mit Paraffin Flüssigkeit.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Der Manipulator der Glaspipette aufsetzen und Kippen des Manipulators 60° nach hinten aus der vertikalen Achse (Abb. 2 b).</li>
		<li>Führen Sie 2.1.4–2.1.9. Die Position des Manipulators ist 1,4 mm posterior, 0,5 mm seitlich an den Lambda-Ausdruck.</li>
		<li>Legen Sie einen kleine Kunststoff-Paraffin-Film auf den Schädel, dann setzen Sie ca. 1 µL Tracer Lösung auf. Schnell die Glaspipette voraus und füllen Sie ihn mit mindestens 0,5 µL Tracer-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie die Glaspipette, sodass die Spitze Tiefe 3,0 mm von der Oberfläche des Gehirns ist.</li>
		<li>0,5 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Die Glaspipette aus dem Gehirn zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Fixierung und trimmen
<ol><li>Verleihen Sie Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal eine Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9, mit oder ohne die Tracer-Injektion wie in Schritt 2 beschrieben. Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
	<li>Einschläfern der Maus menschlich von Vorrichtung die Maus Transcardially20 mit 0,9 % Kochsalzlösung.</li>
	<li>Fix die Maus20 durch Vorrichtung 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5).</li>
	<li>
Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere, um den Schädel wie beschrieben20verfügbar zu machen.
	<ol>
<li>Schneiden Sie die Mittellinie des freigelegten Schädel mit einer Schere. Entfernen Sie den Schädel mit Pinzette.</li>
		<li>Wenn markiert die Position des Bregma und Lambda notwendig ist, entfernen Sie zunächst eine Hemisphäre des Schädels. Legen Sie dünne Wolfram Nadeln in das Gehirn an den Stellen der Bregma und Lambda auf dem Schädel noch auf das Gehirn, dann entfernen Sie die restlichen Schädel. Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° c gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Um durchzuführen Antikörper Färbung der hemmenden Neuronen, schneiden Sie die Gehirn-Muster in Scheiben.
	<ol>
<li>Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome.</li>
		<li>Scheiben Sie bis zu 500 µm Dicke mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 5 (AbScale-Methode).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Antikörper Färbung nicht erforderlich ist, trim zu Probe Gehirn blockiert (bis zu 3 mm dick) mit einer Rasierklinge (Abbildung 3) und fahren Sie mit Schritt 4 (SeeDB-Methode). Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° C nach dem Schneiden oder Trimmen gespeichert werden. Die SeeDB-Methode ist vorzuziehen, wenn Antikörper Färbung nicht notwendig ist, denn es weniger Zeit als die AbSca-l-e-Methode erfordert.</li>
</ol>4. löschen ohne Antikörper Färbung (SeeDB Methode)
<ol><li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 40 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 60 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 100 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80,2 % (w/w) Fruktose enthält und 24 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Behandeln Sie die Probe sorgfältig, um Verformungen so gering wie möglich zu halten. Inkubieren Sie Proben länger als angegeben, nicht als Proben schnell undurchsichtig werden können.</li>
	<li>Betten Sie die Probe in einer bildgebenden Kammer gefüllt mit 80,2 % Fructose-Lösung (Abbildung 1 b). Gegebenenfalls zu beheben die Probe indem man kleine Stücke von Kautschukkleber um. Wenn die Kammer zu tief ist, legen Sie eine Bodenplatte in der Kammer vor den Proben.</li>
	<li>Die Petrischale mit einer Glasabdeckung auf der bildgebenden Kammer legen Sie und Wasser in die Schüssel und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit. Erregung Wellenlängen und Emission Filter sind in Tabelle 1beschrieben. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.</li>
</ol>(5) Clearing mit Antikörper Färbung (AbScale-Methode)
<ol><li>Bereiten Sie Reagenzien, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL des Sca/eS0 Lösung und inkubieren sie 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° C (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 36 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL Sca/eB4-Lösung und inkubieren die Scheiben für 24 h mit sanft schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie mit Primärantikörpern (Tabelle 3) in 1 mL AbScale Lösung für 48-72 h bei 37 ° C (Abbildung 4) mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 5 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie in 4 mL AbScale Lösung für 2 h 2 Mal bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit fluoreszent-markierten Sekundärantikörper (Table of Materials, 1: 100) in 1 mL AbScale Lösung für 48 h bei 37 ° C mit sanft schütteln.</li>
	<li>Vorsichtig die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL der AbScale Lösung zu entfernen und die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL AbScale Lösung hinzugeben und die Scheiben für 2 h 2 Mal mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL 4 % PFA und die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL der Sca/eS4 Lösung hinzufügen und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Legen Sie das Distanzstück auf einen Glasobjektträger und legen Sie die Scheiben in der Abstandhalter und Tauchen Sie die Scheiben mit Sca/eS4 Lösung ein. Versiegeln Sie das Distanzstück mit einem Deckglas (Abbildung 1).</li>
	<li>Das Deckglas und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit setzen Sie Wasser auf. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die tiefen Teile der Probe zu den oberflächlichen teilen, ohne eine deutliche Kennzeichnung Voreingenommenheit bestätigen ähnlich beschriftet werden. Hinweis: Die Durchdringung der getesteten Antikörper ist in Tabelle 3beschrieben.</li>
</ol>6. Zelle Positionsbestimmung
<ol><li>Berechnen Sie für jede Position in den gescannten Bildern Korrelationswerte mithilfe ein dreidimensionales Bild Filter14 (Abb. 5A-5D).</li>
	<li>Bestimmen der Gipfel der Korrelationswert (Abbildung 5).</li>
	<li>Untersuchen Sie Bilder rund um die Gipfel, Zellen (Abb. 5E) zu finden.</li>
</ol>

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<li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex%2C+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+%28Ce3D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit können d...

Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo 1,2 ,3,4,5,6,7. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wiederholt, aber ihre zelluläre Organisation bleibt unklar8,9. Diese sind in der kortikalen Bereiche und sind kein Gehirn-System.
In neokortikalen Schicht 5 sind die große Mehrheit der Neuronen in vier Haupttypen eingeteilt. Eine wichtige Art von exzitatorischen Neuronen, Sub-zerebrale Projektion Neuronen Axone, subkortikale Ziele einschließlich der Pons, Rückenmark und Colliculus superior-Projekte und stellt daher, die größeren kortikalen Ausgang Weg10. Kortikalen Projektion Neuronen, eine weitere wichtige Art von exzitatorischen Neuronen innervieren den Kortex-10. Hemmende Neuronen enthalten auch zwei Hauptgruppen: Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen11.
Jüngste Analysen deuten darauf hin, dass die vier Zelltypen in wiederholten Strukturen12,13,14organisiert sind. Sub-zerebrale Projektion Neuronen12,13,14 und kortikalen Projektion Neuronen14 organisieren in Zelltyp spezifische Microcolumns mit einem Durchmesser von 1 – 2 Zellen. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen richten Sie speziell mit Microcolumns von Sub-zerebrale Projektion Neuronen, aber nicht mit Microcolumns von kortikalen Projektion Neuronen14. Microcolumns selbst ausrichten in regelmäßigen Abständen in Form eines sechseckigen Gitter Array14 und sind in mehrere kortikalen Bereiche einschließlich visuelle, somatosensorische und motorische Bereichen Maus Gehirn12,14 und in Sprache Bereiche des menschlichen Gehirns13. Neuronen in den einzelnen Microcolumn synchronisierte Aktivität aufweisen und haben ähnliche sensorischen Antworten14. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Schicht 5 Zelltypen in einer Microcolumn Gitterstruktur repräsentieren die erste bekannte Gehirn-weiten Organisation wiederholen Funktionsmodule zu organisieren.
Microcolumns haben einen Radius von ca. 10 µm und eine räumliche Periodizität von etwa 40 µm. Darüber hinaus ist die Ausrichtung des Microcolumns parallel zu ihrer apikalen Dendriten und ändert sich je nach ihrer Position in der Kortex-14. Das Microcolumn System ist daher schwer zu analysieren, mit herkömmlichen kortikalen Scheiben mit einer typischen Dicke von ein paar Dutzend Mikrometer. Darüber hinaus die Analyse der Periodizität erfordert dreidimensionale Daten aus einer Vielzahl von Hirnareale und daher die typische imaging-Bereich der konfokalen Mikroskopie oder in Vivo 2-Photonen-Bildgebung ist zu schmal.
Vor kurzem haben Techniken entwickelt worden, um Dicke Gewebe15,16zu löschen. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Methoden auf groß angelegte, dreidimensionale Bilder der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 erhalten, aus die das Microcolumn-System besteht. Subcerebral Projektion Neuronen sind gekennzeichnet durch die retrograde Beschriftung oder den Ausdruck das erhöhte grün fluoreszierende Protein in Crym-Egfp Transgene Mäuse12und kortikalen Projektion Neuronen durch entweder die retrograde beschriftet sind Kennzeichnung oder durch den TdTomato Ausdruck im Tlx3-Cre/Ai9 Mäuse17. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen sind von Immunohistochemistry bezeichnet. (Antikörper Skala S) AbScale Methode18 dient für den Antikörper Experimente, Färbung, während die SeeDB (siehe Deep Brain) Methode19 für andere Experimente verwendet wird. Diese Methoden der konventionellen bildgebenden Verfahren die oben genannten Schwierigkeiten überwinden und zeigen die genaue zelluläre Organisation der Schicht 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgene Mäuse</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgene Mäuse</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Silikonkautschukplatte</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0,5 mm</td></tr><tr><td>Dicke Silikonkautschukplatte</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1,0 mm Dicke</td></tr><tr><td>Silikonkautschukplatte</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3,0 mm Dicke</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 555 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 647 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injektorpumpe</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons Injektion</td></tr><tr><td>Injektorpumpe</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior Colliculus</td></tr><tr><td>Injektion Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Pfizer Lidocain</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocain Injektion 1% mit Adrenalin</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene mikrofibrillärer Hämostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Seide</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, leicht</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadel</td><td>Inter medical</td><td>&Phi; 0,1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Kunststoffrohr</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Thioglycerin</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Objektive für den Wasserimmersionsbereich mit langem Arbeitsabstand</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Objektive für den langen Arbeitsbereich mit Wasserimmersion</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorischer Tisch</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Kunststoff Tube</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Kunststoff</td><td>Tube Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>0030120094</tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Sorbit</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;--Cyclodextrin</td><td>Tokyo chemische Industrie</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;- Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Hydroxyprolin</td><td>Essentielle Wirkstoffe für die Haut</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai Tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1,1 g/ml)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbiert sekundär Antikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Ziege anti-Maus IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Wasserimmersion Objektive mit langem Arbeitsabstand</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

groß angelegte dreidimensionale bildgebung der zelluläre organisation in der maus neocortex

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.

Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadium. E...

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Analyse der Struktur und der Funktion des Neokortex. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die großflächige dreidimensionale Struktur im Gehirn aufdecken kann. Obwohl diese Methode Einblicke in den Neokortex geben kann, kann sie auch auf andere Nervensysteme wie das Rückenmark angewendet werden.Um den Tracer in die Pons der erwachsenen Mäuse zu injizieren, ziehen Sie zunächst einen Mikroliter fluoreszenzmarkiertes Choleratoxin-Untereinheit B in eine 26-Gauge-Hamilton-Spritze. Platzieren Sie eine Injektorpumpe auf der Spritze, dann setzen Sie die Spritze und die Pumpe auf den Werkzeughalter eines Manipulators an einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator um 12 Grad nach hinten von der vertikalen Achse.Platzieren Sie anschließend die Maus auf dem stereotaktischen Instrument. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge die Haare, um eine Infektion zu vermeiden. Schneiden Sie dann 10 Millimeter der Kopfhaut ab, so dass das Bregma und das Lambda sichtbar sind.Verabreichen Sie 0,1 Milliliter 1%iges Lidocain mit einer Pipette. Stellen Sie den Winkel des

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Rechtwinklige Mikroprismen in die Maus gesteckt Neokortex ermöglicht tiefe Bildgebung von mehreren kortikalen Schichten mit einer Sicht in der Regel in Scheiben gefunden. Ein-Millimeter-Mikroprismen bieten ein weites Feld-of-view (~ 900 um) und räumliche Auflösungen ausreichen, um dendritischen Dornen zu lösen. Wir zeigen, Schicht V neuronalen Bildgebung und Neokortex Gefäßdarstellung mit Mikroprismen.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die...

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung von Magnetresonanztomographie, Clearing und Immunmarkierung intakter Mausgehirne mit iDISCO+, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Bildgebung mittels Lichtblattmikroskopie und nachgeschalteten Analysen mit NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Diese Studie beschreibt die Schritte zur Gewinnung hochauflösender Bilder von neugeborenen Mäusegehirnen durch die Kombination von Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) und einem Kontrastmittel in ex vivo-Proben . Wir beschreiben grundlegende morphometrische Analysen, um die Größe und Form des Gehirns in diesen Bildern zu quantifizieren.

Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie die groß angelegte 3D-Bildgebung zur Untersuchung der zellulären Organisation im Neocortex der Maus. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung neuronaler Strukturen und trägt zum Verständnis der Hirnarchitektur bei.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

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