Eine einfache Methode für die automatisierte Festphasenextraktion von Wasserproben für die immunologische Analyse von kleinen Schadstoffe

Das übergeordnete Ziel dieser Probenvorbereitungsmethode ist es, kleine, organische Schadstoffe aus Wasserproben auf benutzerfreundliche, kostengünstige und automatisierte Weise vorzukonzentrieren. Diese Methode kann Standard-SPE-Prozesse bei der Untersuchung der Kontamination von Wasserproben mit Immundetektionsmethoden, wie z. B. Well-Plate-Immunoassays oder Biosensoren, ersetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das SPE-Verfahren automatisiert ist, während der Platzbedarf und die Kosten der Instrumente im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen gering sind.

Darüber hinaus entsprechen die Leistungen des Anreicherungsprozesses den Anforderungen an die Analyse von Immunoassays, und zwar sowohl in Bezug auf den niedrigen Lösungsmittelgehalt als auch auf die Effizienz der Vorkonzentration. Filtern Sie zunächst eine 100-Millimeter-Wasserprobe mit einem Nullkommafilter mit zwei Mikrometern aus. Geben Sie die gefilterte Probe in eine Glasflasche mit GL 45-Gewinde

Bereiten Sie 300 Mikroliter Eluent vor, indem Sie Methanol in entionisiertem Wasser in einem engen Röhrchen auf 50 Volumenprozent verdünnen. Als nächstes bereiten Sie eine Suspension von 20 Milligramm pro Milliliter von Octadecyl-Siliziumdioxid-Sorptionspartikeln vor, indem Sie 1.600 Mikroliter Methanol gefolgt von 400 Mikrolitern deionisiertem Wasser zu 40 Milligramm Umkehrphasen-Sorptionsmittel in einem Glas hinzufügen. Schließen Sie den Deckel fest und rühren Sie mit einem Wirbelmischer um.

Legen Sie eine Nylonmembran mit einer Porengröße von 11 Mikrometern auf eine doppelte Schicht aus Staubschutzgewebe. Schneiden Sie zwei kleine Teile mit einem Stempel von drei Millimetern Durchmesser in die Membran. Fassen Sie dann eine der kleinen Membranen mit einer Filterzange mit flachem Ende und platzieren Sie sie auf einer Seite der Säule.

Schrauben Sie anschließend den Flachbodenverbinder mit dem Schlauch fest und ziehen Sie ihn fest. Zeichnen Sie dann einen Pfeil auf den Körper der Säule, der auf das Ende zeigt, an dem die Membran platziert wurde. Befestigen Sie an dieser Stelle die Säule an der Halterung, wobei der Pfeil nach unten zeigt.

Befestigen Sie eine leere 10-Milliliter-Einwegspritze mit den unteren Lock-Konnektoren am Ende des Schlauchs der Säule. Rühren Sie die Sorptionsmittelsuspension mit dem Wirbelmischer und pipettieren Sie schnell 100 Mikroliter in der Mitte der Säule. Während der Injektion die pipettierte Lösung vorsichtig durch die Membran aspirieren, indem Sie die Spritze mit der anderen Hand verwenden.

Die Vorbereitung der SPE-Säule ist sehr wichtig. Sie müssen sicherstellen, dass Sie die Lösung mit der Spritze richtig durch die Membran aspirieren, während Sie die Partikelsuspension in die Säule injizieren. Andernfalls werden die Partikel nicht dicht gepackt.

Wiederholen Sie den vorherigen Vorgang noch zwei weitere Male, indem Sie die Stammsuspension zwischen allen Pipettierschritten bewegen, um eine homogene Suspension der Partikel in der Lösung zu gewährleisten. Nachdem die gesamte Suspension geladen und durch Ansaugen mit einer Spritze getrocknet wurde, halten Sie die Spritze in Position und legen Sie die zweite Nylonmembran mit der anderen Hand mit der Pinzette darauf. Schrauben Sie dann den zweiten Konnektor mit einem Schlauch fest und entsorgen Sie die Spritze.

Ziehen Sie an dieser Stelle die Säule an der SPE-Vorrichtung mit den unteren Verriegelungsverbindern fest. Verbinden Sie die Flasche mit der Probe mit dem Gerät, indem Sie die mitgelieferte Sicherheitskappe GL 45 darauf schrauben. Laden Sie 200 Mikroliter Eluent in das Eluentenreservoir.

Laden Sie dann 800 Mikroliter entionisiertes Wasser in das Verdünnungsreservoir. Vergewissern Sie sich, dass sich der Druckregler in der geschlossenen Position befindet, indem Sie ihn rückwärts im Uhrzeigersinn drehen, bis eine weitere Bewegung nicht mehr möglich ist. Geben Sie nach dem Einschalten des Prototyps die Werte 580 für pset und 30 für delta pset ein.

Um den Druckregler einzustellen, starten Sie die Pumpe. Drehen Sie dann den Druckregler manuell, bis der für preg abgelesene Wert unterlegen, aber nahe 320 Millibar liegt. Starten Sie nach dem Stoppen der Pumpe den SPE-Vorgang, indem Sie in der Ecke des automatisierten Modus auf Start drücken.

Sobald das SPE-Verfahren abgeschlossen ist, verschließen Sie die kleine Probe und lagern Sie sie bis zur ELISA-Analyse bei vier bis fünf Grad Celsius im Dunkeln. Zur Reinigung des Systems wird eine 10-Milliliter-Lösung mit 70 Volumenprozent Methanol in einer Glasflasche mit GL 45-Gewinde hergestellt. Ziehen Sie die SPE-Säule ab, und stecken Sie die Schläuche mit Steckern ein.

Wählen Sie im automatisierten Modus die Reinigungsdatei aus und starten Sie sie mit den gleichen Druckeinstellungen, die zuvor für pset, delta pset und preg verwendet wurden. Die Reproduzierbarkeit der Sorptionsmittelpackung wurde durch Trocknen und Wiegen des pipettierten Sorptionsmittels in Glasgefäßen bewertet. Die Reproduzierbarkeit des Injektionszeitpunktes wurde für die 100-Milliliter-Proben getestet.

Die Konzentrationen der anfänglichen und vorkonzentrierten Spike-Proben wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit mit 17 Beta-Östradiol bestimmt. Aus den Kalibrierkurven geht hervor, dass das Methanolverhältnis aus der angereicherten Probe die Empfindlichkeit des Immunoassays nicht beeinflusst. Für deionisiertes Wasser bzw. künstliches Meerwasser wurden Wiederfindungsraten von 128 plus oder minus 22 Prozent und 107 plus oder minus sechs Prozent berechnet.

Einmal gemeistert, kann die Vorbereitung einer SPE-Säule in weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Das gesamte SPE-Verfahren kann in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Umweltwissenschaften, um die Entwicklung von Immunnachweismethoden zur Überwachung kleiner organischer Schadstoffe zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Wasserproben mit unserem kostengünstigen, automatisierten Instrument für die Analyse von Schadstoffen durch Immunoassays vorbereiten können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Schadstoffen und Lösungsmitteln gefährlich sein kann, und dass bei diesem Vorgang immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Handschuhe und Schutzbrillen getroffen werden sollten.