Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell
11. Juni 2017
Wir präsentieren ein Modell des Bandgewebes, in dem dreidimensionale Konstrukte mit dem menschlichen Übungskonditionierten Serum behandelt und auf Kollagengehalt, Funktion und Zellbiochemie analysiert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, den Einfluss von Bewegung und Ernährung auf die Synthese und Funktion des Bindegewebes zu bestimmen. Bei dieser Technik wird menschliches Serum verwendet, das vor und nach dem Training entnommen wird, um 3D-Gewebe zu behandeln, damit wir verstehen können, wie sich Bewegung auf die Funktion von Bändern und Sehnen auswirkt. 3D Tissue Ensuring kombiniert die Vorteile gut charakterisierter in vitro Assays mit der Funktion, Morphologie und biochemischen Eigenschaften von in vivo Geweben.
Nachdem Sie siliziumbeschichtete 35-Millimeter-Platten im Voraus gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, bereiten Sie Ankerformen vor, indem Sie in der Mitte jeder zylindrischen Vertiefung in den Formen einen winzigen Stift platzieren. Kombinieren Sie Beta-Tricalciumphosphat und orthophosphorische Zitronensäurelösung mit ein bis drei Gramm pro Milliliter in einer Plastikwaage auf Eis. Verwenden Sie einen Kunststoffzellenschaber, um den Zement kräftig zu mischen.
Zerreiben Sie den Zement, um mit dem Mischen fortzufahren, pipettieren Sie die Mischung in die Formen, dann zentrifugieren Sie die gefüllte Form fünf Minuten lang bei 2.250 g g. Lassen Sie die Brushit-Zementanker nach der Zentrifugation über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Am nächsten Morgen nehmen Sie die Anker aus der Form und stecken Sie zwei Anker im Abstand von 12 Millimetern in jede silikonbeschichtete Platte.
Sterilisieren Sie die Platten, indem Sie sie mit 70 % Ethanol besprühen, sowohl die Platten als auch die Deckel füllen, und legen Sie die Platten dann in eine biologische Sicherheitswerkbank (BSC). Nach mindestens 30 Minuten aspirieren Sie die Platten und lassen sie im BSC ausprobieren. Setzen Sie die Deckel wieder auf und bewahren Sie sie bis zur Verwendung im BSC auf.
Befolgen Sie die örtlichen Vorschriften für die ordnungsgemäße Verwendung und Entsorgung von biologisch gefährlichem Material. Bewahren Sie die Sterilität und führen Sie Konstruktbildungsschritte in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch. Nach der Vorbereitung von primären Fibroblasten, Reagenzien und siliziumbeschichteten Platten mit nadelförmigen Brushit-Ankern gemäß dem Textprotokoll werden die Zellen in 15 Zentimeter großen Platten auf 70 % Konfluenz kultiviert.
Als nächstes bereiten Sie einen Mastermix vor, der aus Folgendem besteht: 681 Mikroliter pro Konstrukt Zellsuspension, 29 Mikroliter pro Konstrukt Thrombin, zwei Mikroliter pro Konstrukt Aprotinin und zwei Mikroliter pro Konstrukt Aminohexansäure. Nachdem Sie die Lösung gut gemischt haben, fügen Sie 714 Mikroliter zu jeder Nadelplatte in einem Achtermuster um die Brushit-Zementanker hinzu und stellen Sie sicher, dass die Mastermischung direkt mit den Seiten der Anker in Kontakt kommt. Klopfen Sie vorsichtig auf jeden Teller, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen.
Der kritischste Schritt ist die Bildung des zellsitzenden Fibringels. Stellen Sie sicher, dass der Mastermix direkt mit den Ankern in Kontakt kommt, und klopfen Sie auf die Platte, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie Platte für Platte 286 Mikroliter Fibrinogen tropfenweise gleichmäßig auf die Platte.
Schieben Sie die Platte sofort hin und her und von einer Seite zur anderen, um das Fibrinogen zu verteilen und die in die Zellen eingebetteten Fibringele zu bilden, und fahren Sie dann mit der nächsten Platte fort. Legen Sie die Konstrukte in einen sterilen Inkubator, der bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird, und inkubieren Sie sie mindestens 15 Minuten lang, um die Polymerisation des Fibrinogens zu ermöglichen. Bereiten Sie zwei Milliliter pro Konstrukt des Futtermediums vor, indem Sie das Wachstumsmedium mit 200 Mikromol Ascorbinsäure, 50 Mikromol Prolen und fünf Nanogramm pro Milliliter TGF beta 1 ergänzen.
Verwenden Sie zwei Milliliter Futtermedium, um jedes Konstrukt abzudecken, und kultivieren Sie die Konstrukte in einem sterilen Inkubator, der insgesamt 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird, oder bis zum gewünschten Endpunkt, indem Sie das Medium jeden zweiten Tag mit zwei Millilitern Futtermedium auffrischen. Um menschliches Serum zu entnehmen, entnehmen Sie eine Ruheblutprobe gemäß dem Textprotokoll und lassen Sie die Teilnehmer dann einen Übungsmodus ausführen, der Ihrem Forschungsziel entspricht. Hier ist ein 30-minütiges hochintensives Widerstandstraining zu sehen.
Entnehmen Sie 15 Minuten nach der Trainingseinheit eine Blutprobe und drehen Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1.500 g und nachdem Sie das Blut gerinnen gelassen haben. Übertragen Sie das Serum unter sterilen Bedingungen in sterile Röhrchen zur Medienvorbereitung. Im Anschluss an die Aufbereitung der Bandkonstrukte ist der Zugversuch mit einem Zugprüfgerät in einem PBS-Bad mit umgekehrt geformten Griffen durchzuführen, die mit dem Kraftaufnehmer gekoppelt sind.
Dadurch werden die Brushit-Zementanker während des Tests an Ort und Stelle gehalten. Bestimmen Sie mit Hilfe von digitalen Messschiebern die Länge und Breite der Bandkonstrukte und berechnen Sie die Querschnittsfläche des Gewebes. Lösen Sie das Bandkonstrukt von der Platte, und platzieren Sie die Anker in den umgekehrt geformten Griffen, stellen Sie sicher, dass das Konstrukt in PBS eingetaucht ist, und passen Sie dann den Abstand zwischen den Griffen an, indem Sie die Länge des Konstrukts auf seine ursprüngliche Länge einstellen.
Beginnen Sie den Test, und belasten Sie das Konstrukt bis zum Versagen mit einer Dehnungsrate von 0,4 Millimetern pro Sekunde oder 3 % pro Sekunde. Verarbeiten Sie nach dem Test das Gewebe und führen Sie die Kollagenquantifizierung der manipulierten Bänder gemäß dem Textprotokoll durch. Nach ein bis zwei Tagen in Kultur haben sich die ACL-Fibroblasten an das Fibringel angeheftet, die Zellprozesse verlängert und begonnen, Zugkräfte auszuüben.
Zwischen den beiden Ankerpunkten wird Spannung erzeugt, und die Zellen richten sich parallel zu dieser Achse aus und beginnen, Kollagen abzulagern. Hier ist ein repräsentatives Spannungsdehnungsdiagramm für ein bis zum Versagen getestetes Band dargestellt. In diesen Experimenten wurde humanes Serum aus Blutproben vor und nach dem Training isoliert und anstelle von FBS verwendet, um Medien zu erzeugen, die mit dem trainingsinduzierten biochemischen Milieu angereichert waren.
Wie in dieser Grafik gezeigt, zeigten die Bandkonstrukte nach einer 14-tägigen Kulturperiode einen signifikanten Anstieg sowohl der maximalen Zugbelastung als auch des Kollagengehalts als Reaktion auf das Serum nach dem Training. Sobald sie gemeistert sind, können Bänderkonstrukte im Laufe von zwei Tagen hergestellt werden und sind in zwei Wochen für Zugtests, die Quantifizierung des Kollagengehalts und andere biochemische Analysen bereit. Dieses translationale in vitro in vivo-Modell ist Teil einer umfassenderen Mission, um zu verstehen, wie Bewegung die Funktion von Bändern, Sehnen und eigentlich fast jedem Gewebe im Körper verbessert.
Dies ist also eine wirklich robuste und starke Technik, mit der wir den Kollagengehalt und die Bindegewebsfunktion nach Behandlungen mit Bewegung, Ernährung, Belastung, allen Arten von Wachstumsfaktoren und allen Arten von verschiedenen Eingriffen, die wir bei Menschen oder Tieren durchführen können, bestimmen können.
Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Modell von Bändergewebe, das mit menschlichem, durch Training konditioniertem Serum behandelt wurde, um den Kollagengehalt, die Funktion und die zelluläre Biochemie zu analysieren. Das Ziel ist es zu verstehen, wie Bewegung und Ernährung die Synthese und Funktion des Bindegewebes beeinflussen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Gewebe-Engineering
Hintergrund
- Bindegewebe wie Bänder und Sehnen sind entscheidend für die muskuloskelettale Funktion.
- Es ist bekannt, dass Bewegung die Gewebegesundheit und -regeneration beeinflusst.
- Menschliches Serum kann Einblicke in die biochemische Umgebung nach dem Training geben.
- 3D-Gewebe-Konstrukte ahmen die In-vivo-Bedingungen für bessere experimentelle Ergebnisse nach.
Zweck der Studie
- Um die Auswirkungen von Bewegung auf die Funktion von Bändern und Sehnen zu bestimmen.
- Um die biochemischen Veränderungen im Bindegewebe nach dem Training zu analysieren.
- Um ein zuverlässiges Modell für die Untersuchung von Gewebereaktionen auf Training zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Herstellung von 3D-Gewebe-Konstrukten unter Verwendung menschlichen Serums.
- Zentrifugation und Kultur von Fibroblasten in einer kontrollierten Umgebung.
- Zughärtung der Konstrukte zur Bewertung der mechanischen Eigenschaften.
- Kollagenquantifizierung zur Bewertung der Gewebezusammensetzung.
Hauptergebnisse
- Erhebliche Zunahme der maximalen Zuglast und des Kollagengehalts beobachtet.
- Menschliches Serum, angereichert mit durch Training induzierten Faktoren, verbesserte die Gewebeergebnisse.
- Konstrukte zeigten Ausrichtung und Kollagenablagerung durch Fibroblasten.
- Das Modell ahmte erfolgreich die In-vivo-Bedingungen für die Bindegewebsanalyse nach.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen neuartigen Ansatz zum Verständnis der Auswirkungen von Bewegung auf Bänder.
- Menschliches Serum kann effektiv eingesetzt werden, um Gewebe-Engineering-Ergebnisse zu verbessern.
- Dieses Modell kann weitere Forschung zur Gesundheit des Bindegewebes erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This model addresses the translational gap in connective tissue research by using human exercise-conditioned serum to treat 3D ligament constructs, enabling physiologically relevant assessment of tissue function. It supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical programs focused on exercise-mimetic therapeutics or nutritional interventions. The approach provides quantitative mechanical and biochemical readouts that improve predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of exercise-induced biochemical milieu on ligament function and collagen synthesis.
- Operational Value: Provides a human-relevant system to validate targets involved in mechanotransduction and tissue adaptation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing for compounds or nutrients that mimic exercise benefits on connective tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized 3D ligament constructs with quantifiable outputs including tensile load and collagen content.
- Operational Value: Enables reproducible, serum-mediated conditioning to assess compound effects in a disease-relevant system.
- Assay Readiness: Supports screening workflows requiring functional, morphologic, and biochemical analysis of engineered tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges in vitro findings to human physiology by incorporating post-exercise serum factors.
- Preclinical Model: Offers a non-animal, human-cell-based system for evaluating connective tissue responses to interventions.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on functional tissue outcomes rather than surrogate markers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for programs targeting musculoskeletal health or exercise-mimetic agents.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how exercise-induced factors influence ligament synthesis and alignment.
- Screening: Delivers quantitative, functional readouts (tensile strength, collagen deposition) for compound or serum fraction comparison.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as ultimate tensile stress and collagen quantification to compare experimental conditions.
- Translational Research: Uses human cells and exercise-conditioned serum to enhance relevance to human tissue responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse interventions (exercise, nutrition, loading, growth factors) on connective tissue.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling human tissue responses to physiologically relevant stimuli.
- Operational Value: Standardizes construct formation and conditioning with defined serum inputs for reproducible outcomes.
- Strategic Value: Reduces reliance on animal models and improves early assessment of connective tissue efficacy.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of exercise-mimetic or nutritional candidates based on functional tissue improvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, 3D tissue engineering, and sterile tissue culture techniques.
- Dependent on access to human serum samples collected pre- and post-exercise under standardized protocols.
- Needs tensile testing equipment and collagen quantification assays for functional and biochemical analysis.
- Must account for donor variability in exercise response when designing comparative studies.
- Limited to in vitro assessment; does not capture systemic or neurological contributions to tissue function.
