Name: Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie 3D-Ligamentkonstrukte mit menschlichem Serum nach körperlicher Belastung behandelt werden, um Kollagengehalt und mechanische Eigenschaften zu analysieren. Dieses translative Gewebe-Engineering-Modell ermöglicht die Untersuchung von Bindegewebe-Funktion.

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Diese Arbeit wurde von einem NSERC Postdoktorandenstipendium (DWDW), einem ARCS Foundation Stipendium (AL) und einem UC Davis College of Biological Sciences Grant (KB) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das vorliegende Manuskript beschreibt ein Modell des Bandgewebes, das eine nützliche experimentelle Plattform für Forscher mit einem breiten Spektrum von Forschungsthemen ist, von der Gewebeentwicklung bis hin zu translationalen / klinischen Fragen. Das hier beschriebene Konstruktionsband basiert auf einem vielseitigen Protokoll, das an verschiedenen Stellen während des gesamten Workflows angepasst werden kann ( Abbildung 1 und Diskussionsteil ). Weiterhin kann die inhärent reduktionistische Natur der in vitro Umgebung dem physiologischen Bereich durch Ergänzung von Futtermittelmedien mit konditioniertem menschlichem oder tierischem Serum näher gebracht werden. Konstrukte können mit Fibroblasten aus einer Vielzahl von Quellen gebildet werden Während die hier gezeigten Methodik- und Repräsentativresultate auf der Verwendung von primären ACL-Fibroblasten basieren, kann das Zellisolationsprotokoll angepasst werden, um andere Arten von primären Fibroblasten zu sammeln. Wie beschriebenIn Fig. 4 zeigen die mit den primären Zellen, die von jungen menschlichen Spendern isoliert wurden, gebildeten Liganden eine niedrige Donorvariabilität. Primärzellen sind durch anfängliche Isolations- und Durchgangsbeschränkung begrenzt; Die Verwendung von Zelllinien kann die Reproduzierbarkeit von Experimenten verbessern. Die Verwendung anderer Zelltypen kann Modifikationen in Zellkulturmedien und Fibringelformulierungen erfordern. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass menschliche mesenchymale Stammzellen (MSCs) nicht in der Lage sind, lineare Gewebe zwischen den Brushit-Zement-Anker im Laufe von 2 Wochen zu bilden, während equine überlegene digitale Flexor Sehnenfibroblasten, pferdeartige Knochenmark-Stromazellen, Küken embryonale Sehnenfibroblasten , Und murine C3H10T1 / 2 MSCs schnell zusammenziehen und verdauen das Fibrin Gel zu einem linearen Gewebe (unveröffentlichte Beobachtungen) zu bilden. Dieser Kontrast kann eine Folge von Unterschieden in der Zellkontraktilität, Proliferation und fibrinolytischen Enzymproduktion sein. Anwendung von ChemikalienUnd mechanische Stimulation Bei dem hier beschriebenen Verfahren bildet sich Fibrin-basiertes Gewebe um Brushit-Zement-Anker herum, was die Anwendung der mechanischen Stimulation über einen Streck-Bioreaktor 11 sowie für die Endpunkt-Zugversuche ermöglicht. Die Anwesenheit von Brushit-Zement-Weichgewebe-Grenzfläche (Enthesis) bietet auch eine Gelegenheit für weitere Untersuchungen und Verbesserungen 22 , 26 (siehe Abschnitt Klinische Anwendungen unten). In diesem in vitro- Umfeld kann der Beitrag der chemischen und mechanischen Faktoren leichter identifiziert werden; Ein Beispiel dafür ist in Fig. 5 gezeigt , wobei die Wirkung der Nach-Übungs-Serumumgebung von den mechanischen Stimuli der Übung getrennt wurde. Pilotstudien können erforderlich sein, um den Zeitrahmen der experimentellen Interventionen, die Zusammensetzung der Behandlungen und die entsprechenden Endpunkte zu bestimmen, um eine beobachtbare Veränderung zu erwarten. FoR Beispiel, in der Nach-Übungs-Serum-Studie 1 , wurde die Länge der experimentellen Behandlung durch die Bereitstellung von Serum zur Ergänzung von Medien, von denen Konstrukte wurden jeden zweiten Tag gezwungen wurde eingeschränkt. Weiterhin wurde während der zweiten Kulturwoche Kulturmedien mit Rest- oder Nachübungsserum mit Ascorbinsäure und L-Prolin ergänzt, während TGF-β1 entfernt wurde. TGF-β1 ist ein bekannter pro-fibrotischer Wachstumsfaktor, der nach dem Training 27 im Serum zunimmt. Um diese TGF-β1-bezogenen Effekte des Nach-Übungs-Serums zu verdecken, wurde dieses Cytokin daher nicht in den Kulturmedien aufrechterhalten. Dieses konstruierte Ligamentmodell kann auch verwendet werden, um den Effekt der mechanischen Dehnung zu testen. Durch die Konstruktion von umgekehrt modellierten Griffen, um die Brushit-Zement-Ankerenden zu halten (ähnlich dem in Fig. 1 dargestellten uniaxialen Zugprüfgerät), können Streckbioreaktoren entworfen werden, um eng aufzunehmen<html> Ineered bänder Unser Labor hat dieses Modell bisher verwendet, um die molekulare Signalisierungsreaktion von konstruierten Bändern auf eine uniaxiale Zugdehnung in einem maßgeschneiderten Bioreaktor 11 zu untersuchen, der ein besseres Verständnis für die rationale Gestaltung eines in vitro -Streckparadigmas oder sogar potentiell in vivo bietet Stretch / Aktivität / therapeutische Anwendungen. Bewertung von konstruierten Bändern Wie bei der traditionellen Monolayer-Kultur können 3D-Konstrukte für die Gen / Protein-Expression untersucht werden. Darüber hinaus bietet ihre 3D-Morphologie auch die Möglichkeit, funktionale und morphologische Veränderungen zu beurteilen und Konstrukte können in Kultur für Langzeitstudien gehalten werden (Abbildung 3 ). Während konstruierte Bänder nicht gleichbedeutend mit einheimischen, reifen Bändern sind, haben sie Ähnlichkeit mit der Entwicklung von Sehnen / Bändern und verhalten sich ähnlich wie natives Gewebe als Reaktion auf Nährstoffe&quot;&gt; 26, Wachstumsfaktoren 10 , Hormone 25 und Übung 11 , 28. Während die Vorsicht vor einer breiten Verallgemeinerung aus jedem in vitro- Modell gerechtfertigt ist, können die Ergebnisse der Ligamentenkonstruktionstests einen bestimmten physiologischen Mechanismus aufdecken oder informieren, der sonst sein könnte Unmöglich in vivo zu untersuchen . Ergänzen Sie Feedmedien mit konditioniertem Serum für ein flexibles und dynamisches Modell mit breiten Anwendungen Das menschliche Serummetabolom ist ein Milieu von ~ 4.500 Verbindungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glykoproteine, Lipoproteine, Lipidderivate, Energiesubstrate, Metabolite, Vitamine, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und eine Fülle von Bausteinen / Zwischenprodukten. 29 Eine weitere Inspektion des menschlichen Serummetaboloms nach den Compoundklassen 29 zeigt,Vorteile der Integration von experimentellem Serum in in vitro Experimente. Das heißt, die Mehrheit der ~ 4500-Verbindungen im Serum ist hydrophob oder lipid-abgeleitet und unterstreicht die Bedeutung der Bindung von Proteinen für den Transport / die Solubilisierung. Daraus folgt, dass die experimentelle Rekapitulation der endogenen Verbundtransportdynamik und damit der Bioverfügbarkeit und der Compound-Ziel-Wechselwirkungen nahezu unmöglich wäre. So ist das experimentelle Serum besonders wirksam für die Untersuchung von Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie von den Zusatzmolekülen für die Solubilisierung, den Transport, die Zielbindung und den Wirkmechanismus abhängen. Unser Labor hat ein langjähriges Interesse an den gesundheitlichen Vorteilen der Übung. Übung verbessert die Zell- und Organfunktion in einer Vielzahl von Geweben im ganzen Körper 12 , was auf eine Vielzahl von Faktoren zurückzuführen ist (z. B. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Exosomen 16 , 17 ), die in den systemischen Kreislauf freigesetzt werden. Das biochemische Milieu nach der Übung spiegelt die Faktoren wider, die sowohl von der Verabreichung von Skelettmuskel-Übungsempfindlichen Hormonen als auch von Faktoren, die als Ergebnis der sympathischen Nervensystemstimulation von Sekretionsdrüsen freigesetzt werden ( z. B. Cortisol und Katecholamine aus der Nebenniere 18 und Wachstum, freigesetzt werden Hormon aus der anterioren Hypophyse 19 ). Wir haben vor kurzem ein Modell des Pre- und Post-Trainings-Serums verwendet, um die Effekte des ausübung-induzierten biochemischen Milieus auf Gewebe zu untersuchen. 1 Während zahlreiche wichtige Übungsfragen bestehen bleiben, ist das Modell auf diese Weise keineswegs eingeschränkt. Beispielsweise könnte das Serum entweder aus tierischen oder menschlichen Quellen nach diätetischen oder pharmakologischen Interventionen oder aus verschiedenen Altersgruppen oder klinischen Populationen gewonnen werdenS 30 Auf diese Weise werden exogene oder endogene Verbindungen von Interesse in den Serum- und Behandlungsmedien in bioverfügbaren Mengen vorhanden sein und mit dem Zielgewebe zusammen mit dem endogenen Milieu ( dh in einem physiologischeren Kontext) interagieren. Dieser Ansatz ist dynamisch, da es höchstwahrscheinlich ist, dass eine gegebene Intervention einen Multiorgan (und Multi-Compound) -Effekt ausübt und somit das physiologische Milieu co-modifiziert wird. Während dieser Ansatz gewisse Herausforderungen stellt, da mehrere systemische biochemische Variablen gleichzeitig verändert werden, ist es ein Ansatz, der dazu beitragen kann, Nachteile einer rein reduktionistischen experimentellen Methodik zu überwinden 31 , 32 . Zusammenfassend kann die Implementierung von konditioniertem Serum zusammen mit einem gewebetechnischen ( in vitro biomimetischen ) Gewebe als Werkzeug für Physiologie, Ernährung und klinische Forschungsfragen verwendet werden. <stronG&gt; Klinische Anwendungen sind zahlreich Das hier vorgestellte Tissue Engineering-Modell kann verwendet werden, um anatomische und klinische Forschungsfragen zu untersuchen, die traditionelle In-vitro- Modelle nicht können. Ein Ligament oder Sehne in vivo enthält eine weiche bis harte Gewebeübergangsregion, die die Enthesis genannt wird. Die auf die mechanische Belastungsverletzung 33 anfällige Enthesis kann im Querschnitt über histochemische und Elektronenmikroskopietechniken 22 , 26 untersucht werden . Diese einzigartige Schnittstelle ist für diejenigen mit geringer oder eingeschränkter Beweglichkeit doppelt wichtig, da die physikalische Inaktivität die Fähigkeit des Bindegewebes beeinträchtigt, die Belastung in Regionen mit niedriger bis hoher Compliance 34 zu übertragen, was letztlich zu einer Gesamtabnahme der Gewebe-Compliance und einem erhöhten Verletzungsrisiko führt. Unser Labor hat vor kurzem dieses Tissue Engineering Modell 25 verwendet/ Sup&gt;, um eine andere Population zu modellieren, weibliche Athleten, die für Bindegewebsverletzungen gefährdet sind: Die Inzidenz von ACL-Verletzungen ist etwa fünfmal größer als ihre männlichen Pendants 35 . Potenzielle Mechanismen, die diese sexbasierte Disparität bei der Verletzung untermauern, wurden untersucht, indem sie Ligamentenkonstrukte mit physiologischen Konzentrationen des weiblichen Sexualhormons, Östrogen, in Konzentrationen behandelt wurden, die die Stadien des Menstruationszyklus nachahmen. Interessanterweise hemmten hohe Östrogenkonzentrationen die Genexpression und -aktivität der Lysoloxidase, das primäre Enzym, das für die Bildung von Lysin-Lysin-Quervernetzungen in der Kollagenmatrix von Bändern und Sehnen verantwortlich ist. Wichtig ist, dass 48 h des hohen Östrogens (um die Follikelphase zu simulieren) die Ligamentenkonstruktionssteifigkeit verringert, ohne die Kollagendichte der Konstrukte zu verändern. Aus physiologischer Perspektive deutet dies darauf hin, dass die Zunahme der Ligament-Laxheit bei Frauen zumindest teilweise zurückgehen kannVernetzungsbildung. Aus einer experimentellen Perspektive heben diese Erkenntnisse 25 den Nutzen des 3D-Konstruktmodells hervor, das eine funktionale Vernetzungsaktivität untersucht hat. Aus klinischer Perspektive kann dieses Modell nun verwendet werden, um schnell Interventionen zu screenen, die die negativen Effekte von Östrogen der Ligamentfunktion verhindern können. Schlußbemerkungen Hier haben wir eine detaillierte Methodik für die Bildung von konstruierten Bändern und deren Nutzen als 3D- In-vitro- Gewebemodell vorgestellt. Das Modell ist sehr anpassungsfähig für eine breite Palette von Zielen, die Flexibilität in der Zell-Typ, Interventionen und Ergebnis Maßnahmen von Interesse. Die Ergänzung von Futtermedien mit konditioniertem Serum fügt einen physiologischen Kontext hinzu, der in einer traditionellen in vitro Umgebung nicht erreicht werden kann, wodurch die Modellierung der in vivo Physiologie verbessert wird. Kurz gesagt, wir glauben, dass dies ein breit anwendbarer Modus istL mit spannenden Implikationen für die Förderung der Bereiche Physiologie und Tissue Engineering.

Sehnen- und Bandverletzungen sind häufig und können schwächende Konsequenzen für die normale Mobilität und Lebensqualität haben. Chirurgische Eingriffe sind oft notwendig, können aber einen begrenzten und vielfältigen Erfolg haben 4 , 5 . Das gegenwärtige Verständnis davon, wie sich Sehnen und Bänder entwickeln, reifen und auf Verletzungen reagieren, ist unvollständig, und so sind wirksame Forschungsmodelle erforderlich, um einen Einblick in die Entwicklung effektiverer Behandlungen zu geben. Um diese Wissenslücke zu bewältigen, können Tiermodelle verwendet werden, aber in vivo Studien sind inhärent komplex mit Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Umwelt und direkt auf Interventionen auf das beabsichtigte Gewebe. Im Gegensatz dazu kann die experimentelle Umgebung in vitro mit der traditionellen Monolayerzellkultur leicht kontrolliert und überwacht werden . Diese Technik kann jedoch die chemische und mechanische Umgebung übertreffen und kann daher nicht rekapitulierenSpät das in vivo Verhalten der Zellen. Tissue Engineering ist in der Lage, die Vorteile der komplexen in vivo Umgebung in Tiermodellen mit der Kontrolle der in vitro Umwelt zu heiraten und bietet ein zusätzliches Werkzeug, um Physiologie zu studieren. Darüber hinaus, bewaffnet mit einem besseren Verständnis der Ligament-Entwicklung, Tissue Engineering kann auch eine Quelle von Transplantat Gewebe, wenn chirurgische Rekonstruktion erforderlich ist 6 . Somit validiert das hier beschriebene Verfahren ein in vitro 3D-konstruiertes Gewebe, das verwendet werden kann, um die Bandfunktion und die Morphologie zu untersuchen. Fibrin-basierte Sehnen- oder Ligamentenkonstrukte wurden als In-vitro- Modell verwendet, um physiologische Prozesse einschließlich Kollagenfibrillogenese 7 und Sehnenentwicklung 8 sowie Translationsanwendungen zu untersuchen, bei denen ihre Nützlichkeit als Pfropfgewebe in einem Schafmodell von anterior cru ausgewertet wurdeLigament (ACL) Rekonstruktion 9 . Unser Labor hat zuvor ein 3D-konstruiertes Ligamentmodell mit zwei Brushit, einem Calciumphosphat-Knochenersatzmaterial, Zementankern, hergestellt. Dieses Modell kann durch einfache Ergänzung des Kulturmediums mit biologischen Faktoren 10 oder durch Anwendung mechanischer Stimulation 11 verschiedenen experimentellen Bedingungen unterworfen werden. Wichtig ist, dass dieses Knochen-zu-Knochen-Ligament-Modell die eingehende Analyse der Enthesis, der Schnittstelle zwischen Boney- und Sehnenelementen, ermöglicht, die anfällig für Verletzungen ist. In der Studie, die hier gezeigt wurde, um diese Methodik zu präsentieren, interessierten wir uns für die Wirkung von trainationsbedingten Veränderungen im biochemischen Milieu auf die Bandfunktion. Übung verbessert die Zell- und Organfunktion in einer Vielzahl von Geweben im ganzen Körper 2 , 3 , </suP&gt; 12 , ein Effekt, der auf die Freisetzung verschiedener bekannter (z. B. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-artiger 15 , Exosomen 16 , 17 ) und anderer unbekannter biochemischer Faktoren zurückzuführen ist, die in den systemischen Kreislauf freigesetzt werden . Darüber hinaus ist das biochemische Nachjoch-Milieu mit übung reaktionsfähigen Hormonen angereichert, deren Freisetzung durch sympathische Nervensystemstimulation von Sekretionsdrüsen stimuliert wird ( zB Cortisol und Katecholamine aus der Nebenniere 18 und Wachstumshormon aus der anterioren Hypophyse) ). Allerdings ist es unmöglich, die Auswirkungen des mechanischen Stimulus der Übung von ausübung-induzierten biochemischen Veränderungen zu unterscheiden. Während einige Studien den erwarteten Anstieg von bestimmten zirkulierenden Hormonen und Zytokinen als Reaktion auf Übungen charakterisiert habenE wie oben erwähnt, gibt es zu viele Faktoren, sowohl bekannt als auch unbekannt, um in vitro genau zu rekapitulieren . Das heißt, die Isolierung einiger Faktoren für eine In-vitro- Studie adressiert die Komplexität der biochemischen Antwort unzureichend. In dieser Studie haben wir untersucht, wie sich Veränderungen im serumbiochemischen Milieu, angetrieben durch Übung, auf die entwickelte Ligamentfunktion auswirken. Um die Effekte der biochemischen Veränderungen zu isolieren, erhielten wir Serum von menschlichen Teilnehmern vor und nach einem Kampf der Resistenz-Übung und verwendeten es behandeln 3D-konstruierte Bänder, die mit menschlichen vorderen Kreuzbandlibament (ACL) Fibroblasten gebildet wurden. Mit diesem Modell können wir funktionale Daten erhalten, einschließlich Auswirkungen auf die mechanischen Eigenschaften und den Kollagengehalt sowie die quantitativen Effekte auf die molekulare Signalisierung.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Insektenstifte, minutien Edelstahl, Größe 0,20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>Für Brushit-Zementanker</td></tr><tr><td>&beta;-Tricalciumphosphat</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td><td>N/A</td><td>Für Brushit-Zementanker</td></tr><tr><td>o-Phosphorsäure, 85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>Für Brushit-Zementanker</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>Für Brushit-Zementanker</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Gewebekulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>Für silikonbeschichtete</td></tr><tr><td>Platten Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>Für silikonbeschichtete Platten</td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Für Zellisolierung und -expansion</td></tr><tr><td>100x Antibiotikum/ Antimykotische Lösung</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>Für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Thermo Fisher Scientific 17101015</td><td></td><td>Für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>100x Penicillin/Streptomycin-Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22&nbsp; &Mikro; m Poren, Polyethersulfon, gammabestrahlt</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Für die Reagenziensterilisation</td></tr><tr><td>DMEM hohe Glukose mit Natriumpyruvat und L-Glutamin</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Für Zell- und Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>Bestandteil von Gewebeverdauungsmedien und Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Penicillin G Kaliumsalz</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>Bestandteil von Wachstumsmedien. In Wasser auf 100.000 U/ml auflösen, filtrieren, sterilisieren, aliquotieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>CELLSTAR Polystyrol-Gewebekulturschalen (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Für die Zellisolierung</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Für Zellkulturen. Verdünnen auf 0,05 % in PBS</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Für Medien zum Einfrieren von Zellen</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Kryo-Gefrierbehälter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Zum Einfrieren von Zellen</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Roter Kunststoff 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>Für die Entnahme von Humanserum</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IV Katheter, 22 G x 1 Zoll Nadel</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>Für die Gewinnung von Humanserum</td></tr><tr><td>Thrombin, aus Rindern</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>Für die Bildung von künstlich hergestellten Bändern. Bei 200 U/ml in DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m, aliquot und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Fibrinogen, rinderischen Ursprungs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Für die künstliche Bänderbildung. Bei 20 mg/ml in DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m, aliquot und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Aprotinin aus der Rinderlunge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>Zur künstlichen Bänderbildung. Bei 10 mg/ml in Wasser auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m, aliquot und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>6-Aminohexansäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>Für die Bildung von künstlich hergestellten Bändern. Bei 0,1 g/ml in Wasser auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m, aliquot und bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure, 2-Phosphat, Sesquimagnesiumsalzhydrat,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Bestandteil von Aufgabemedien. In DMEM-Medien mit hohem Glukosegehalt bei einer Konzentration von 50 mM auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m und bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Bestandteil von Aufgabemedien. In PBS bei einer Konzentration von 50 mM auflösen. Filtern bei 0,22 &mu; m und bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Transformation des Wachstumsfaktors-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Komponente des Vorschubmediums. Rekonsistenz gemäß Herstellerangaben in einer Konzentration von 10 &mu; g/ml. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0,22&nbsp; &Mikro; M, Polyethersulfon, 250&nbsp; ml, radiosterilisiert</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Für die Sterilisation von Reagenzien</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>In Wasser auf 6 M verdünnen</td></tr><tr><td>4-Dimethylaminobenzaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>Für den Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Chloramin-T-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>Für den Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>trans-4-Hydroxy-L-prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>Für Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>1-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>Für Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Perchlorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>Für Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Essigsäure, Eiszeit</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>Für Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>Scientific S318-500</td><td>Für den Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Toluol, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>Für den Hydroxyprolin-Assay</td></tr><tr><td>Corning Costar Klare Polystyrol-96-Well-Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>Für den Hydroxyprolin-Assay</td></tr></tbody></table>

behandlung von ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem serum: ein translations-gewebe-engineering-modell

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In-vitro- Experimente sind essentiell, um biologische Mechanismen zu verstehen; Allerdings ist die Kluft zwischen der monolayer Gewebekultur und der menschlichen Physiologie groß, und die Übersetzung der Befunde ist oft schlecht. So gibt es genügend Gelegenheit für alternative experimentelle Ansätze. Hier stellen wir einen Ansatz vor, in dem menschliche Zellen aus menschlichen vorderen Kreuzband-Geweberesten isoliert, in Kultur erweitert und zur Bildung von konstruierten Bändern verwendet werden. Übung ändert das biochemische Milieu im Blut, so dass die Funktion vieler Gewebe, Organe und Körperprozesse verbessert wird. In diesem Experiment wurde das Ligamentenkonstruktionskulturmedium mit experimentellem Humanserum ergänzt, das durch Übung &quot;konditioniert&quot; wurde. Somit ist die Intervention biologisch relevanter, da ein experimentelles Gewebe dem vollen endogenen biochemischen Milieu ausgesetzt ist, einschließlich bindender Proteine ​​und ergänzender Verbindungen, die im Zusammenhang mit der Aktivität von a verändert werden könnenUnbekannter Agent von Interesse. Nach der Behandlung können konstruierte Bänder für mechanische Funktion, Kollagengehalt, Morphologie und zelluläre Biochemie analysiert werden. Insgesamt gibt es vier große Vorteile gegenüber herkömmlichen Monolayer-Kultur- und Tiermodellen, dem hier vorgestellten physiologischen Modell des Bandgewebes. Zuerst sind die Ligamentenkonstrukte dreidimensional, so dass mechanische Eigenschaften ( dh Funktion), wie z. B. Zugspannung, maximale Zugbelastung und Modul, quantifiziert werden können. Zweitens kann die Enthesis, die Schnittstelle zwischen boney und sinew elements, im Detail und im funktionalen Kontext untersucht werden. Drittens ermöglicht die Vorbereitung von Medien mit Post-Übungs-Serum die Auswirkungen des ausübung-induzierten biochemischen Milieus, das für das breite Spektrum der gesundheitlichen Vorteile der Übung verantwortlich ist, in einer unvoreingenommenen Weise zu untersuchen. Schließlich schreitet dieses experimentelle Modell die wissenschaftliche Forschung auf eine humane und ethische Weise vor, indem sie die Verwendung vonTiere, ein Kernmandat der National Institutes of Health, das Center for Disease Control und die Food and Drug Administration.

Übersicht über die entwickelte Ligamentbildung und experimentelle Intervention Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Bildung von Konstruktionsbändern. Brushit-Zement wird ein Knochenersatzmaterial 22 durch Kombination einer Orthophosphorsäure / Zitronensäurelösung mit β-Tricalciumphosphat in zylindrischen Vertiefungen hergestellt. Alternativ können, wenn nicht direkt mechanische Funktion der Gewebe gemessen werden, 3-0 Seidennähte als Anker bei der Bildung eines Gewebes verwendet werden. Diese werden in silikonbeschichteten 35-mm-Schalen 12 mm auseinander gehalten und durch Einweichen in 70% Ethanol sterilisiert. Fibroblasten werden aus den vorderen Kreuzbandresten isoliert, die während der ACL-Rekonstruktionsoperation erhalten wurden. Nach der Expansion werden 2,5 x 10 &amp; sup5; Zellen in einem Fibrin-Gel eingekapselt, das in der Brushit-Zement-Anker-gepinnten Schale gebildet wird. Nach der bildung, ligament constrKönnen auf Veränderungen der mechanischen Eigenschaften, des Kollagengehalts, der Zellproliferation, der Genexpression, der Proteinspiegel und der Gewebemorphologie untersucht werden. Während der Kultur kontrahieren die Zellen das Fibringel und bilden ein lineares Gewebe zwischen den beiden Anker (Abbildung 2A ). Nach 1-2 Tagen in Kultur haben sich die Zellen an das Fibringel gebunden, verlängerte Zellprozesse und begannen, Zugkräfte auszuüben (Abbildung 2B ). Da das Fibringel durch Zugkräfte kontrahiert und durch zelluläre Enzyme zerlegt wird, wird zwischen den beiden Ankerpunkten eine Spannung erzeugt und unsere Zellen parallel zu dieser Achse ausgerichtet ( Abb. 2B ) und beginnen Kollagen zu deponieren. Nach 4-5 Tagen haben sich die Konstrukte um die Anker, die ein lineares zylindrisches Gewebe bilden, zusammengezogen ( Fig. 2A , an diesem Punkt können externe Reize auf das System angewendet werden (IntervEntion zu diesem Zeitpunkt vermeidet die Störung des linearen Gewebebildungsprozesses). Interventionen können die Ergänzung der Kulturmedien mit menschlichem oder tierischem Serum nach einer gegebenen Intervention, exogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die mechanische Stimulation oder die Veränderung anderer Umweltfaktoren wie Sauerstoffspannung, umfassen. Unter Verwendung von Wachstumsmedien (DMEM mit 10% FBS und 100 U / ml Penicillin), ergänzt mit 200 &amp; mgr; M Ascorbinsäure, 50 &amp; mgr; M L-Prolin und 5 ng / ml TGF-β1, haben wir festgestellt, dass die Zellproliferation während einer 2-wöchigen Kultur fortgesetzt wird ( Abb. 2C ) und in der Tat zeigt die Lichtmikroskopie ein dichtes Gewebe, das hochgradig ausgerichtete Zellen an 14 Tagen Kultur enthält (Abbildung 2B ). Bewertung von konstruierten Bändern Am Ende der Kulturperiode können konstruierte Bänder in einer Varietät beurteilt werdenY von Weisen Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems ist die Fähigkeit, funktionelle Veränderungen des Gewebes durch mechanische Tests zu bestimmen, eine wichtige Beurteilung angesichts der mechanischen Rolle des nativen Bandes. Uniaxiale Zugversuche können verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften einschließlich der Last zum Ausfall, der Zugfestigkeit und des Elastizitätsmoduls zu messen. Viskoelastische Eigenschaften können auch mit Spannungsrelaxation und Kriechversuchen gemessen werden. Fig. 3A zeigt ein konstruiertes Ligament, das in umgekehrt geformten Griffen in einem kundenspezifischen uniaxialen Zugprüfgerät gehalten wird. Der rechte Griff ist an einem Kraftaufnehmer angebracht, um die Last über dem Band zu messen, wenn das Gewebe zum Versagen belastet wird. Fig. 3B zeigt eine repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurve für einen Test zum Versagen Nach einer mechanischen Prüfung können dieselben Konstrukte getrocknet und für einen Hydroxyprolin-Assay 23 verarbeitet werden, um den gesamten Kollagengehalt sowie andere Biochs zu beurteilenMische Assays Mit einer ausreichenden Anzahl von zusätzlichen Proben pro Bedingung kann eine gründliche Untersuchung eines experimentellen Eingriffs durchgeführt werden, einschließlich seiner Auswirkungen auf die Zellproliferation, die Gen- und Proteinexpression und die histologische Morphologie. Während 14 Tage ein typischer Endpunkt für unsere Studien sind, verbessern die konstruierten Bänder ihre mechanischen Eigenschaften und ihren Kollagengehalt durch 28 Tage Kultur, wie in Abbildung 3C gezeigt, und kann für mindestens 3 Monate in Kultur 24 überleben. Spendervariabilität ist ein wichtiger Aspekt für die experimentelle Wiederholbarkeit. Fig. 4 zeigt ein repräsentatives Experiment, das von Lee et al. 25 Vergleich von 7 verschiedenen ACL-Donoren (n = 3 männlich und n = 4 weiblich), die typische Zugeigenschaften und Kollagengehalt nach einer 2-wöchigen Kultur in der zuvor beschriebenen zeigen<html> Ergänzte Wachstumsmedien. Mit Hilfe von Zellen aus ähnlichen ACL-Sammlungen, Alter des Spenders, Zeit nach Verletzung, Geschlecht usw. zeigen die entwickelten Bänder eine geringe Variabilität zwischen Spendern und ähnlichen Eigenschaften zwischen männlichen und weiblichen Spendern mit Ausnahme des Unterschieds in der Kollagenfraktion. In der oben erwähnten Studie wurden konstruierte Bänder als In-vitro- Modell verwendet, um zu untersuchen, warum Frauen ein signifikant größeres Risiko für ACL-Verletzungen haben als Männer und zeigten, dass ACL-Fibroblasten, die von weiblichen Spendern isoliert wurden, nicht inhärent schwächere und weniger kollagene konstruierte Bänder bilden. Die Auswirkung des Nach-Übungs-Serum-Milieus auf die In-vitro- Ligamentfunktion Wir haben bisher die Fähigkeit von konstruierten Bändern gezeigt, um physiologische Prozesse 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25 In dem folgenden repräsentativen Experiment, wie von West et al. 1 , haben wir die biochemischen Effekte der Übung auf die Bandfunktion bestimmt und die Methodik und die Ergebnisse hier hervorgehoben. Wir bildeten konstruierte Bänder mit menschlichen ACL-Zellen und wandten eine Intervention an Tag 7 der Kultur, bestehend aus Kulturmedien, die mit menschlichem Serum konditioniert wurden, vor und nach der Übung. Kurz gesagt, wir rekrutierten gesunde junge männliche Teilnehmer und sammelten Blutproben vor und nach einem akuten Kampf der Resistenz-Übung, die zirkulierende Hormone und Zytokine einschließlich menschliches Wachstumshormon (GH) erhöht. Das menschliche Serum wurde aus Vor- und Nach-Übung-Blutproben isoliert und anstelle von fötalem Rinderserum in den Kulturmedien für die zweite Woche der konstruierten Ligamentenkultur verwendet (Abbildung 5A ). Vor- und Nach-Übungs-Serumproben wurden unter Verwendung von ELISA für Änderungen in GH und insulinähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) analysiertDeren Konzentration durch Übung verändert werden kann (Abbildung 5B ). Diese Information wurde verwendet, um Serum-Effekte auf die konstruierten Bänder mit Veränderungen im Serum als Reaktion auf Übung zu korrelieren. Nach einer 14-tägigen Kulturperiode wurden die Ligamentenkonstrukte unter Verwendung eines mechanischen Tests und einer Hydroxyprolin-Bestimmung des Kollagengehalts bewertet und zeigten eine signifikante Zunahme sowohl der maximalen Zugbelastung als auch des Kollagengehalts in Reaktion auf das Nachübungsserum. Um zu beurteilen, ob dieser Effekt mit Übungs-induzierten Freisetzungen von GH oder IGF-1 zusammenhängt, wurden in einem separaten Experiment konstruierte Bänder gebildet und mit einer Dosisantwort von entweder humanem rekombinantem GH oder IGF-1 behandelt. Interessanterweise erhöhte die fortschreitende rekombinante GH-Konzentration im Kulturmedium, während das Serum GH im Blut zunahm (Abbildung 5B- i), den Kollagengehalt (Abbildung 5D- i) oder mechanisch nichtEigenschaften (Daten nicht gezeigt) in konstruierten Bändern. Im Gegensatz dazu zeigten die Serum-IGF-1-Spiegel nach dem Training nicht, aber ein Dosis-Wirkungs-Experiment zeigte, dass die Erhöhung der Konzentrationen in den Kulturmedien den Kollagengehalt von Ligamentenkonstrukten verbesserte (Abbildung 4D- ii). Während also die Ausübung zu einer robusten Zunahme des Nachbehandlungs-GH führte, erweckt das Dosis-Response-Experiment mit rhGH Zweifel daran, ob GH direkt für die phänotypische Verstärkung der konstruierten Bänder verantwortlich ist (zumindest die 22 kDa-Isoform allein nicht Scheinen verantwortlich zu sein). Umgekehrt, während Serum IGF-1 nicht bei 15 min nach der Übung verändert wurde, zeigte das RHIGF-1 über ein breites Spektrum von Konzentrationen, dass IGF-1 in der Lage ist, den Kollagengehalt zu verbessern; Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Erhöhung der rhIGF-1-Konzentrationen durch einen Bereich, der die physiologischen Konzentrationen schätzte, den Kollagengehalt nicht signifikant erhöhte. So ist das einzigartige Post-Trainings-Serum enviroWar wichtig für die Verbesserung der Mechanik und des Kollagens von konstruierten Bändern. In der hier betrachteten Studie war das Volumen des experimentellen Serums aufgrund ethischer Erwägungen begrenzt; So wurden kurzfristige 2D-Bioassays, die niedrigere Serumanforderungen hatten, verwendet, um die molekularen Mechanismen, die für die beobachtete Zunahme des Kollagens verantwortlich waren, weiter zu untersuchen. ACL-Fibroblasten wurden bis zur Konfluenz in 6-Well-Platten kultiviert und für 1 Stunde mit Ruhe- oder Nachübungsserum behandelt und mit Dosisreaktionen von rekombinantem GH, IGF-1, TGF-β1 und der Aktivierung von Targets im PI3K / mTORC1 verglichen , ERK1 / 2 und Smad-Signalwege bestimmt. In Gegenwart von Post-Trainings-Serum zeigte der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Weg eine stärkere Aktivierung, wie durch Phosphorylierung von S6K (Abbildung 5D- i) bzw. ERK1 / 2 (Abbildung 5D- ii) beurteilt.Im Vergleich zu den Hormon- und Zytokin-Dosisreaktionen, während GH einen kleinen positiven Effekt auf die mTOR-Signalisierung hatte (Abbildung 5D- i) und IGF-1 zeigten eine positive Wirkung bei der niedrigsten Dosis, die drei Behandlungen von GH, IGF-1 und TGF -β1 nicht für den Anstieg der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Signalisierung verantwortlich war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser 3D-konstruiertes Ligamentmodell und 2D-Bioassay-Daten darauf hindeuten, dass die Post-Trainings-Serum-Umgebung durch die Aktivierung der PI3K / mTORC1- und ERK1 / 2-Wege in der Lage ist, die Ligamentfunktion und den Kollagengehalt zu verbessern. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass man ein konstruktives Ligamentmodell mit ausübungsbedingtem Serum kombiniert hat. Wir konnten die Wirkung der Post-Trainings-Serumumgebung auf die konstruierte Ligamentfunktion und das Kollagen untersuchen, ii) die Veränderungen des Ligament-Phänotyps mit Veränderungen der Serum-Hormon-Konzentration korrelieren, Mit dem Ziel zu bestimmen, welche Veränderungen im Serum zu chang geführt habenEs in konstruierten Bändern und iii) weiter den Umfang der Arbeit unter Verwendung von 2D-Bioassays, um molekulare Ziele des serumbiochemischen Milieus zu untersuchen, um molekulare Mechanismen zu bestimmen, die durch Nachübungsserum aktiviert werden, die zu Verbesserungen der Ligamentfunktion führen. <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Abbildung 1: Überblick über die Entstehung und Verwendung von konstruierten Bändern. Brushit-Zementanker werden in silikonbeschichtete Platten gefertigt und fixiert. Primäre Fibroblasten werden isoliert und aus ACL-Resten erweitert. Konstruktive Bänder werden durch Einkapselung von Fibroblasten in einem Fibringel um zwei Brushit-Zementanker gebildet. Konstruktive Bänder werden kultiviert und mit jeglichem spezifischen chemischen oder mechanischen ( zB über einen Bioreaktor) stimuliert. Am gewünschten Endpunkt können konstruierte Bänder gesammelt und für Mechanica beurteilt werdenL Eigenschaften, Genexpression, Kollagengehalt, Proteinexpression und Histologie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Abbildung 2. Primäre Ligamentfibroblasten bilden ein Fibrin-basiertes Knochen-zu-Knochen-konstruiertes Band, das zwei Brushit-Zement-Anker umfasst. ( A ) Im Laufe der Zeit verteilen die Fibroblasten das Fibringel um die Brushit-Zement-Anker, die ein lineares Gewebe bilden. ( B ) In den ersten drei Tagen hängen die Zellen an das Fibringel an und üben Zugkräfte aus, wobei die Zellen mit der langen Achse des Konstruktes ausgerichtet werden. Über 14 Tage bilden die Zellen ein hoch ausgerichtetes Gewebe. Maßstab = 160 μm. ( C ) Der DNA-Gehalt der konstruierten Bänder nimmt weiter zu oVer 14 Tage in der Kultur, während sich die Zellen vermehren. Die Daten werden als Mittelwert ± SD mit n = 3-4 Konstrukten pro Gruppe dargestellt. Gruppen <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Abbildung 3: Mechanische Eigenschaften des gewogenen Bands und der Kollagengehalt verbessern sich im Laufe der Zeit. ( A ) Ligamentenkonstrukte sind uniaxial spannungsgeprüft, um die Wirkung eines gegebenen Eingriffs auf die Ligamentfunktion zu bestimmen. Wie gezeigt, halten zwei umgekehrt geformte, 3D-bedruckte Griffe wechselseitig geformte Anker, die von der konstruierten Sünde überbrückt werden. Anker sind mit einem Schrittmotor und einem Kraftaufnehmer gekoppelt, um Spannungs- / Dehnungskurven des getesteten Gewebes zu erzeugen, wodurch mechanische Eigenschaften bestimmt werden können. ( B &lt;/ Strong&gt;) Repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurve von einem konstruierten Band, das zum Versagen gespannt ist. Im Laufe von 28 Tagen, ( C ) Endzugfestigkeit (UTS), ( D ) maximale Zugbelastung (MTL), ( E ) Elastizitätsmodul und ( F ) Kollagenfraktion weiter zu verbessern. Die Daten werden als Mittelwert ± SD mit n = 5 Konstrukten pro Gruppe dargestellt. * Zeigt signifikanten Unterschied zu allen anderen Gruppen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Abbildung 4: Konstruktive Bänder können auf Funktionalität und biochemischen Inhalt beurteilt werden und zeigen eine niedrige Donorvariabilität. Ausgearbeitete Bänder wurden 7 verschiedene Spender gebildet (n = 3 männlich, n = 4 weiblich). Nach 2 Wochen o( C ) Elastizitätsmodul, ( D ) Querschnittsfläche (CSA), ( E ) Gesamtkollagengehalt pro, Konstruieren und ( F ) Kollagen als Bruchteil der trockenen Masse. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit dem t-Test von Student * Zeigt einen signifikanten Unterschied zu anderen Gruppen (p &lt;0,05). Abbildung von Lee et al. 25 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Abbildung 5. Konstruktive Bänder zeigen mechanische und biochemische Veränderungen in Reaktion auf BioloGrafische Interventionen. ( A ) Serum wurde aus Blutspuren isoliert, die von den Probanden vor- (RestTx) und nach der Übung (ExTx) gesammelt wurden und zur Behandlung von Konstruktionsbändern während der zweiten Kulturwoche verwendet wurden. ( B ) (i) Das menschliche Wachstumshormon (GH) und (ii) Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (IGF) -1-Spiegel im Rest- und Übungsserum wurden durch ELISA quantifiziert. ( C ) Konstruierte Bänder, die mit ExTx behandelt wurden, zeigten einen verbesserten (i) Kollagengehalt und (ii) maximale Zugbelastung. Die statistische Signifikanz der gepaarten Vergleiche (RestTx und ExTx) wurde durch einen t-Test mit einem auf p &lt;0,05 eingestellten Signifikanzniveau analysiert. ( D ) Eine Dosis-Antwort von (i) GH und (ii) IGF-1 wurde verwendet, um mögliche Beiträge dieser Faktoren auf die Veränderungen des Kollagengehalts durch ExTx zu bestimmen. E) 2D-Bioassays wurden verwendet, um die Effekte von zunehmenden Dosen von GH, RestTx und ExTx auf molekulare Signalisierungsziele wie die Phosphorylierung von (i) S6K Thr38 zu vergleichen9 und (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Der statistische Vergleich von mehr als zwei experimentellen Gruppen erfolgte mit ANOVA und Tukey&#39;s HSD. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. * Zeigt einen signifikanten Unterschied zur Kontrolle an (p &lt;0,05) und § zeigt einen signifikanten Unterschied von 150 ng / mL und 300 ng / mL IGF-1 an. Abbildung von West et al. 1 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir präsentieren ein Modell des Bandgewebes, in dem dreidimensionale Konstrukte mit dem menschlichen Übungskonditionierten Serum behandelt und auf Kollagengehalt, Funktion und Zellbiochemie analysiert werden.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells besteht darin, den Einfluss von Bewegung und Ernährung auf die Synthese und Funktion von Bindegewebe zu ermitteln. Bei dieser Technik wird humanes Serum verwendet, das vor und nach körperlicher Betätigung entnommen wird, um dreidimensionale Gewebe zu behandeln, sodass wir verstehen können, wie sich körperliche Aktivität auf die Funktion von Bändern und Sehnen auswirkt. Dreidimensionale Gewebekulturen vereinen die Vorteile gut charakterisierter In-vitro-Assays mit der Funktion, der Morphologie und den biochemischen Eigenschaften von In-vivo-Geweben. Nach der Vorbereitung von silikonbeschichteten 35-Millimeter-Platten im Voraus gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie Ankerformen vor, indem Sie je einen Minutiennadel in die Mitte jedes zylindrischen Wells in den Formen platzieren. Kombinieren Sie Beta-Tricalciumphosphat und orthophosphorige Zitronensäurelösung im Verhältnis von ein bis drei Gramm pro Milliliter in einem Kunststoff-Wägeboot auf Eis. Mischen Sie das Zementgemisch kräftig mit einem Kunststoff-Zellabstreifer.Den Zement weiter durch Triturieren mischen, die Mischung in die Formen pipettieren und die befüllten Formen anschließend fünf Minuten lang bei 2.250 × g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Brushitzement-Anker über Nacht bei Raumtemperatur aushärten lassen. Am folgenden Morgen die Anker aus der Form nehmen und in jeder silikonbeschichteten Platte zwei Anker im Abstand von 12 Millimetern fixieren.Sterilisieren Sie die befestigten Platten, indem Sie sie mit 70 % Ethanol besprühen und sowohl die Platten als auch die Deckel damit füllen. Danach stellen Sie die Platten in einen biologischen Sicherheitswerkbank (BSC). Nach mindestens 30 Minuten saugen Sie die Flüssigkeit ab und lassen die Platten in der Sicherheitswerkbank trocknen. Setzen Sie die Deckel wieder auf und lagern Sie die Platten in der Sicherheitswerkbank, bis sie benötigt werden.Beachten Sie die örtlichen Vorschriften für biohazard-Potenziale bezüglich der ordnungsgemäßen Verwendung und Entsorgung von biohazardhaltigen Materialien. Halten Sie Sterilität ein und führen Sie die Schritte zur Konstruktbildung in einem biologischen Sicherheitswerkbank durch. Kultivieren Sie die Zellen nach der Herstellung von primären Fibroblasten, Reagenzien und silikonbeschichteten Platten mit fixierten Brushit-Ankern gemäß dem Textprotokoll in 15-Zentimeter-Platten bis zu einer Konfluenz von 70 %.Bereiten Sie anschließend eine Master-Mix-Lösung vor, die pro Konstrukt folgende Bestandteile enthält: 681 Mikroliter Zellsuspension, 29 Mikroliter Thrombin, zwei Mikroliter Aprotinin und zwei Mikroliter Aminohexansäure. Nach gründlichem Mischen der Lösung werden 714 Mikroliter in jedes fixierte Plättchen in einer Acht-Form um die Brushit-Zementanker herum gegeben, wobei sichergestellt werden muss, dass die Master-Mix-Lösung direkt die Seiten der Anker benetzt. Klopfen Sie vorsichtig auf jedes Plättchen, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen.Der kritischste Schritt ist die Bildung des zellbesiedelten Fibrin-Gels. Stellen Sie sicher, dass die Zellansiedlungs-Master-Mix direkt mit den Ankern in Kontakt kommt, und klopfen Sie leicht auf die Platte, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie pro Platte 286 Mikroliter Fibrinogen tropfenweise gleichmäßig über die gesamte Platte hinweg hinzu. Verschieben Sie die Platte sofort vor und zurück sowie seitlich, um das Fibrinogen zu verteilen und die Zellen einbettenden Fibrin-Gele zu bilden, und fahren Sie dann mit der nächsten Platte fort. Stellen Sie die Konstrukte in einen sterilen Inkubator, der bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird, und inkubieren Sie sie mindestens 15 Minuten lang, um die Polymerisation des Fibrinogens zu ermöglichen. Bereiten Sie zwei Milliliter pro Konstrukt an Nährmedium vor, indem Sie das Wachstumsmedium mit 200 Mikromol Ascorbinsäure, 50 Mikromol Prolen und fünf Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 ergänzen.Verwenden Sie zwei Milliliter Kulturmedium, um jeden Konstrukt abzudecken, und kultivieren Sie die Konstrukte in einem sterilen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid insgesamt 14 Tage lang oder bis zum gewünschten Verschlusspunkt. Erneuern Sie das Medium alle zwei Tage mit zwei Millilitern frischem Kulturmedium. Um humanes Serum zu gewinnen, entnehmen Sie eine Ruheblutprobe gemäß dem schriftlichen Protokoll und lassen Sie anschließend die Teilnehmer eine Art von körperlicher Belastung durchführen, die Ihren Forschungszielen entspricht. Gezeigt ist hier eine 30-minütige Einheit hochintensiven Widerstandstrainings.Entnehmen Sie 15 Minuten nach der Trainingsession eine Blutprobe und lassen Sie das Blut gerinnen. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang mit 1.500 × g. Unter sterilen Bedingungen überführen Sie das Serum in sterile Röhrchen zur Medienzubereitung. Nach der Herstellung der Bandkonstrukte führen Sie eine Zugfestigkeitsprüfung mit einem Zugprüfgerät in einem PBS-Bad unter Verwendung umgekehrt geformter Klemmen durch, die mit dem Kraftaufnehmer gekoppelt sind.Dadurch werden Brushit-Zementanker während des Tests an Ort und Stelle gehalten. Bestimmen Sie mithilfe digitaler Messschieber die Länge und Breite der Ligamentkonstrukte und berechnen Sie die Querschnittsfläche des Gewebes. Lösen Sie das Ligamentkonstrukt von der Platte und platzieren Sie die Anker in den gegossenen Gegenklemmen, wobei sichergestellt werden muss, dass das Konstrukt in PBS eingetaucht ist. Anschließend stellen Sie den Abstand zwischen den Klemmen ein und justieren die Länge des Konstrukts auf seine Ausgangslänge. Beginnen Sie den Test und belasten Sie die Konstruktion bis zum Versagen mit einer Dehngeschwindigkeit von 0,4 Millimetern pro Sekunde oder 3 % pro Sekunde. Nach Abschluss des Tests verarbeiten Sie das Gewebe und führen Sie die Kollagenquantifizierung der hergestellten Bänder gemäß dem Textprotokoll durch. Nach ein bis zwei Tagen in Kultur haben sich die ACL-Fibroblasten an das Fibrin-Gel angeheftet, Zellfortsätze ausgebildet und begonnen, Zugkräfte auszuüben.Es entsteht eine Spannung zwischen den beiden Verankerungspunkten, und die Zellen richten sich parallel zu dieser Achse aus und beginnen, Kollagen abzulagern. Hier ist ein repräsentativer Spannungs-Dehnungs-Plot für ein bis zum Versagen getestetes Ligament dargestellt. In diesen Experimenten wurde humanes Serum aus Blutproben vor und nach körperlicher Belastung isoliert und anstelle von FBS verwendet, um ein Medium zu erzeugen, das mit dem durch körperliche Aktivität induzierten biochemischen Milieu angereichert ist.Wie in diesem Diagramm gezeigt, wiesen die Bandkonstrukte nach einer 14-tägigen Kultivierung eine signifikante Zunahme sowohl der maximalen Zugbelastung als auch des Kollagengehalts als Reaktion auf das post-exercise-Serum auf. Sobald die Methode beherrscht ist, können die Bandkonstrukte innerhalb von zwei Tagen hergestellt werden und sind nach zwei Wochen zur Zugfestigkeitsprüfung, Quantifizierung des Kollagengehalts und weiteren biochemischen Analysen bereit. Dieses translationale In-vitro-in-vivo-Modell ist Teil einer umfassenderen Mission, zu verstehen, wie Bewegung die Funktion von Bändern, Sehnen und tatsächlich nahezu jedem Gewebe im Körper verbessert.Daher handelt es sich um eine äußerst robuste und leistungsfähige Methode, mit der wir den Kollagengehalt und die Funktion des Bindegewebes nach Behandlungen mit Bewegung, Ernährung, Belastung, Wachstumsfaktoren jeglicher Art sowie sämtlichen anderen möglichen Interventionen bei Menschen oder Tieren bestimmen können.

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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Erfahren Sie, wie 3D-Ligamentkonstrukte mit menschlichem Serum nach körperlicher Belastung behandelt werden, um Kollagengehalt und mechanische Eigenschaften zu analysieren. Dieses translative Gewebe-Engineering-Modell ermöglicht die Untersuchung von Bindegewebe-Funktion.

Behandlung von Ligamentenkonstrukten mit ausüberschüssigem Serum: Ein Translations-Gewebe-Engineering-Modell

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