Chirurgische Retrieval, Isolierung und In-vitro- Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung eines Tissue Engineering für das vordere Kreuzband oder ACL-Pflaster für ein Paar teilweise gerissener ACL. Dies wird erreicht, indem zunächst das menschliche VKB-Gewebe vom Patienten gewonnen und in Kochsalzlösung gelagert wird. Die erhaltene ACL-Probe wird zerkleinert und mit Kollagenase verdaut, um ACL-abgeleitete Zellen zu erhalten.

Die isolierten Zellen werden dann kultiviert und expandiert. Der nächste Schritt besteht darin, ein zweidimensionales polymilchtisches Co-Glykolsäure-Gerüst herzustellen. In einem letzten Schritt werden die Zellen dann auf diese Polymerfolie ausgesiedelt.

Schließlich werden die Rasterelektronenmikroskopie und die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Biokompatibilität auf der Gerüstoberfläche nachzuweisen. Heute sind wir hier, um unsere Technik bei der Entwicklung eines Pflasters für einen teilweisen ACL-Riss zu demonstrieren. Wichtig dabei ist die Tatsache, dass ACLS nicht von selbst heilen.

Dies ist eine neue, innovative Technik, die wir entwickelt haben, um die Heilung des ACL zu unterstützen. Zu Beginn wird das aus der Pathologie erhaltene menschliche ACL-Gewebe mit steriler Kochsalzlösung und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in eine Petrischale übertragen, das Gewebe mit einer sterilen Schere in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke zerkleinert und das Hackgewebe mindestens dreimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Verdauen Sie sie im Gewebe mit 0,4% Kollagenase in einer vollständig ergänzten ECCOs-modifizierten Adlermedium-Nährstoffmischung.

F 12 mittel für vier bis sechs Stunden. Bei 37 Grad Celsius zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 Käse für fünf Minuten. Wir suspendieren die Zellen in Medium, bevor wir die Zellen zwei- bis dreimal mit Medium waschen, dann säen wir sie in T 25-Kolben aus und kultivieren sie zwei bis drei Tage lang.

Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen zu visualisieren, die zwei bis drei Tage lang in einem T 25-Kolben kultiviert wurden. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im supplementierten DMEM-Medium. Wechseln Sie das Medium, wenn die Zellen Adhärenz und Standardmorphologie zeigen, wie am siebten Tag unter einem Lichtmikroskop beobachtet.

Waschen Sie die Konfluenzzellen mit PBS, fügen Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann Medium zu den suspendierten Zellen, um das Trypsin zu neutralisieren, bevor Sie das mittlere Zellgemisch auf drei T 25-Kolben aufteilen. Waschen Sie die Konfluenzzellen mit PBS und fügen Sie Trypsin hinzu, bevor Sie sie in einem Gefriermedium suspendieren, das DMSO-Rinderserum enthält, und das gesamte Medium in einem Verhältnis von eins zu zwei bis sieben.

Lagern Sie die Kryofläschchen bei minus 80 Grad Celsius. Wenn die Zellen innerhalb eines Monats oder in flüssigem Stickstoff verwendet werden. Wenn die Zellen über einen längeren Zeitraum gelagert werden, lösen Sie ein Gramm Polymilchsäure oder P-L-A-G-A in 12 Millilitern Dichlormethan in einem 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen auf und wirbeln Sie die Lösung acht Stunden lang bei einer konstanten Geschwindigkeit von 800 U/min.

Die gelöste Lösung in eine mit fluoriertem Schutzpapier ausgelegte Glaspetrischale geben. Stellen Sie dann die Petrischale für 30 Minuten unter eine Vakuumhaube, bevor Sie die Petrischale über Nacht bei minus 20 Grad Celsius stehen lassen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur, um die Verdunstung des restlichen Lösungsmittels sicherzustellen und dünne Schichten des Polymers zu erhalten.

Legen Sie anschließend die Polymerfolien für 24 Stunden in ein Trockenmittel. Schneiden Sie die Polymerfolien in kreisförmige Scheiben mit einem Durchmesser von 12 Millimetern und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einem Trockenmittel. Nach der Aussaat der Zellen auf die kontrollierte Gewebekultur, Polystyrol oder TCPS und das P-L-A-G-A-Gerüst bei 50.000 Zellen pro Scheibe.

Waschen Sie die Gerüste sieben Tage nach der Aussaat mit PBS. Verwenden Sie 1,5% Glutaraldehyd in 0,1 molaren Cacodilatpuffer, um die Zellen über Nacht zu fixieren. Fügen Sie dann 2,5 % Osmiumtetroxid in 0,1 molaren Cacodilatpuffer für die Nachfixierung für eine Stunde hinzu.

Nachdem Sie die fixierten Zellen mit 0,1 molaren Cacodilatpuffer gewaschen haben, trocknen Sie die fixierten Zellen durch serielle Ethanol-Dehydratisierung für jeweils 15 Minuten. Trocknen Sie die Zellen über Nacht weiter in Hexamethyldilan. Entlüften Sie die Kammer der SEM-Sputterbeschichtungsanlage mit dem Knopfventil und heben Sie die Deckplatte an.

Legen Sie die getrockneten Proben in die Kammer und senken Sie die obere Platte ab. Schalten Sie den Bedienknopf der Pumpe um, um die Evakuierung der Kammer zu starten. Öffnen Sie das Argon-Leckageventil und warten Sie, bis das Vakuum auf 0,05 Millibar gesunken ist.

Beschichten Sie die getrockneten Proben mit einer dünnen Schicht Gold-Palladium mit einer Beschichtungsmaschine. Bringen Sie dann das Argon-Leckventil wieder in seine geschlossene Position. Schalten Sie den Bedienknopf aus, entlüften Sie die Kammer mit dem Knopfventil und heben Sie die obere Platte an.

Entnehmen Sie die Proben und lagern Sie sie 24 Stunden lang in einem Trockenmittel. Betrachten Sie abschließend die Proben unter einem Rasterelektronenmikroskop für die Immunfluoreszenzfärbung. Beginnen Sie auch damit, die Zellen, die auf dem kontrollierten TCPS und dem P-L-A-G-A-Gerüst sitzen, sieben Tage nach der Aussaat mit PBS zu waschen.

Befestigen Sie dann die Zellen 10 Minuten lang mit kaltem, 70%igem Ethanol. Inkubieren Sie die fixierten Zellen bei Raumtemperatur mit 1 % Rinderserumalbumin in PBS mit 0,05 % Triton X 100 für 20 Minuten. Tauchen Sie die Proben anschließend 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1%Tween.

Fügen Sie eine monoklonale Maus und einen Anti-Beta-Aktin-Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit 0,05% Tween. Geben Sie dann den Sekundärantikörper zu den Zellen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nach dem Waschen der Zellen mit PBS färben Sie die Zellen mit Kernfärbung und montieren sie mit 80% Glycerin. Beobachten Sie abschließend die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Humane ACL-abgeleitete Zellen wurden kultiviert und unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht.

Die spindelförmigen oder länglich geformten Zellen wuchsen auf der Oberfläche von T-25-Kolben nach dreitägiger Kultur, und am siebten Tag wurde eine konfluente Monoschicht erhalten. Das Vorhandensein gesunder lebensfähiger Zellen deutete auf die erfolgreiche Entnahme und Kultivierung der zellulären Bindung der Zellen an die Oberfläche von Polymilch- und Co-Glykolsäure-Gerüsten und die kontrollierte Gewebekultur hin. Polystyrol wurde qualitativ über REM bestimmt, die Adhärenz und Proliferation von humanen ACL-abgeleiteten Zellen kann hier auf jeder Polymeroberfläche sichtbar gemacht werden.

Es wurde auch eine zelluläre Konfluenz beobachtet. Die zelluläre Morphologie und Adhäsionsanalyse wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. Die Färbung von grünem Beta-Aktin zeigt, dass humane ACL-abgeleitete Zellen sowohl von P-L-A-G-A als auch von TCPS abgeleitet sind und ein normales, nicht gestresstes Aussehen aufweisen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein ziemlich gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Tissue-Engineering-Pflaster für partielle ACL-Risse mit Tissue-Engineering-Methoden für ACL-Zellen entwerfen, die aus menschlichem ACL-Gewebe gewonnen werden, sowie die Darmverträglichkeit mit Immunfluoreszenz und Färbung für diese Technik untersuchen. Vielen Dank.