Name: Chirurgische Retrieval, Isolierung und In-vitro- Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Erfahren Sie die chirurgische Isolierung und Erweiterung menschlicher Zellen aus dem vorderen Kreuzband für Tissue-Engineering-Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung von Gewebepflastern zur Reparatur partieller ACL-Risse.

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Die Autoren möchten die Start-up-Fonds und Abteilung für Chirurgie Forschungsstipendium an der Southern Illinois University, School of Medicine zu bestätigen; und das Memorial Medical Foundation Grant.

1. Chirurgische Retrieval Hinweis: Ein IRB-Zulassung erhalten, um die ACL Stumpf während ACL-Rekonstruktion Chirurgie zu sammeln. IRB-Befreiung gegeben wurde, wie die ACL-Stumpf verwendet wurden, in der Regel als Operationsmüll. 20 Patienten wurden verwendet, um die ACL-Stumpf zu sammeln. <ol><li> Verwalten allgemeine Anästhesie und präoperative Antibiotika als Per-Protokoll-Instituts für den Patienten. </li><li> Bewerben Tourniquet und pumpen 100 mg über den systolischen Blutdruck. </li><li> Situate den Patienten in der Rückenlage. Machen Sie eine horizontale anterolaterale Inzision mit Knie in 30-45 ° Beugung für ein 5-mm-Portal und legen Sie die arthroskopische Trokar und Kamera in die Tasche suprapatellaris bei 30 °. </li><li> Führen Sie eine der Routinediagnostik Arthroskopie. </li><li> Geben Sie eine Kerbe und debride die membranöse Gelenkinnenhaut über den Kreuzbandriss. </li><li> Verwenden Sie einen 4,5 mm Rasierer und Ablator die ACL Stumpf zu identifizieren. </li><li> Verwenden Sie einen Entenschnabel gerade bitter, mehrere spe sammelncimens von der verbliebenen ACL-Stumpf. </li><li> Aufrechterhaltung der Probe in normaler Kochsalzlösung in einem sterilen Behälter. </li><li> Senden Sie die Proben zur Pathologie zum Decodieren und Auslieferung an die Laboranlage. </li><li> Recover Patienten und durchzuführen, post-operative Betreuung laut Protokoll Institution. </li></ol> 2. Tissue Verdauung und HACL Isolation <ol><li> Übertragung der aus der Pathologie empfangenen ACL menschlichen Gewebes in eine Petrischale mit einer sterilen Kochsalzlösung / PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). </li><li> Hackfleisch mit sterilen Schere das Gewebe in 1-2 mm 3 Stücke und waschen Sie die zerkleinerte Gewebe mit Kochsalzlösung mindestens 3 Mal. </li><li> Digest des zerkleinerten Gewebes mit 0,4% Collagenase in DMEM/F-12 (50/50, 1x) Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt für 4-6 h bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 1000 × g für 5 Minuten und Resuspendieren der Zellen in dem Medium dann. </li><li> Waschen der Zellen mit dem Medium für 2-3 mal und dann seed / Kultur in T-25-Kolben für 2-3 Tage. </li></ol> 3. Cellular Expansion, Einfrieren und Auftauen <ol><li> Verwenden eines Lichtmikroskops, die Zellen für 2-3 Tage kultiviert, in einem T-25-Kolben visualisieren. </li><li> Pflegen der Zellen bei 37 ° C in DMEM/F-12 (50/50, 1x) Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) ergänzt. Hinweis: Ändern Sie die Medien, wenn die Zellen zeigen Einhaltung und Standard-Morphologie. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen zu beobachten. </li><li> Waschen der konfluenten Zellen mit PBS am Tag 7 (~ 1,3 × 10 6 Zellen / Kolben). Hinzufügen Trypsin (0,5 g / l) und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 5 min. In Medien suspendierten Zellen Trypsin zu neutralisieren. Teilen Sie die Medien-Zellgemisch zwischen drei T-25-Kolben. </li><li> Waschen der konfluenten Zellen mit PBS, fügen Trypsin (0,5 g / l) und resuspendieren sie in Gefriermedium enthält, DMSO, FBS und das Vollmedium (DMEM/F-12 Medium + 10% FBS + 1% P / S) in der Verhältnis 01.02.07. </li><li> SpeicherDie kryogene Fläschchen bei -80 ° C, wenn die Zellen innerhalb eines Monats verwendet werden und in flüssigem Stickstoff, wenn die Zellen für längere Laufzeiten gespeichert werden. </li><li> Tauen Sie die Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad zur Wiederverwendung. Hinweis: In der Regel 90-95% der Zellen überleben. </li></ol> 4. Herstellung von Tissue Engineered 2-D-Milch Poly-co-Glykolsäure (PLAGA) Gerüst <ol><li> Man löst 1 g PLAGA in 12 ml Dichlormethan in einem 20 ml-Szintillations-Fläschchen und verwirbeln die Lösung für 8 h bei einer konstanten Geschwindigkeit (800 UpM). Hinweis: Detaillierte Beschreibung in Gupta et al 15. </li><li> Übertragen Sie die gelöste Lösung auf eine Glaspetrischale mit Fluorierte Schutzpapier ausgekleidet. </li><li> Legen Sie die Petrischale unter einer Vakuumhaube für 30 min. Verlassen die Petrischale bei 20 ° C über Nacht und dann bei Raumtemperatur. Platzieren Sie die Petrischalen in den Lyophilisator vollständige Verdampfung des Lösungsmittels zu gewährleisten, dünne Filme des Polymers zu erhalten. </li><li> Legen Sie das Polymer fiLMS in einem Exsikkator für 24 Stunden. </li><li> Schneiden Sie die Polymerfilme in 12 mm Durchmesser Kreisscheiben und speichern sie in einem Exsikkator, bis sie benötigt. </li></ol> 5. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) <ol><li> Waschen Sie die Zellen (50.000 Zellen / Platte) ausgesät auf der Steuer TCPS und dem PLAGA Gerüst mit PBS 7 Tage im Anschluss an Aussaat. </li><li> Verwenden von 1,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, um die Zellen zu fixieren und 2,5% OsO 4 in 0,1 M Cacodylatpuffer für Postfixierung. </li><li> Mit 0,1 M Cacodylatpuffer Waschen der fixierten Zellen. Trocknen der fixierten Zellen mit seriellen Ethanol-Dehydratisierung (50%, 70%, 80%, 90% und 100%) für 15 min jeweils, und ferner trocken in Hexamethyldisilazan (HMDS) über Nacht. </li><li> Entlüften Sie die Kammer des SEM-Sputter-Beschichtungssystem mit Knopfventil und heben Sie die obere Platte. </li><li> Legen Sie die getrockneten Proben in der Kammer. Senken Sie die Deckplatte. </li><li> Schalten Sie den Drehknopf an der Pumpe zu starten Evakuieren der Kammer. </li><li> Offene Argon Leckventil. Warten Siefür das Vakuum auf 0,05 mbar fallen zu lassen. </li><li> Bestreichen Sie die getrockneten Proben mit einer dünnen Schicht (0,13 nm) Gold / Palladium. </li><li> Liefert die Argon Leckventil in seine geschlossene Position. </li><li> Schalten Sie den Steuerknopf auf aus. </li><li> Entlüften Sie die Kammer mit Knopfventil und heben Sie die obere Platte. </li><li> Entfernen Sie die Proben und speichern sie in einem Exsikkator für 24 Stunden. </li><li> Beachten Sie die Proben unter einem Rasterelektronenmikroskop. </li></ol> 6. Immunfluoreszenzfärbungen <ol><li> Waschen Sie die Zellen (50.000 Zellen / Platte) ausgesät auf der Steuer TCPS und dem PLAGA Gerüst mit PBS 7 Tage im Anschluss an Aussaat. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit 70% Ethanol (kalt) für 10 min. </li><li> Die fixierten Zellen bei Raumtemperatur in PBS mit 0,05% Triton X-100 für 20 min inkubieren, mit 1% Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Tauchen der Proben in 1% Tween bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> In monoklonalen Maus-Anti-β-Aktin-Antikörper (1:400) und Inkubation der Zellen Overnight bei 4 ° C. </li><li> Mit 0,05% Tween waschen der Zellen. Hinzufügen sekundärer Antikörper (Ziege-anti-Maus-F (ab &#39;) 2-Fragment von IgG mit einer Fluoreszenzsonde, 1:400 konjugiert) zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Mit dem PBS Waschen Sie die Zellen. Färben der Zellen mit Kernfärbung und montieren mit 80% Glycerin. </li><li> Beachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Das primäre Ziel dieser Studie war hACL/2D Gerüst, um die erhaltenen Zellen in einem Patch zu verwenden, um primäre Reparatur von Teil ACL Tränen zu erweitern. Konservative Behandlung von Teil ACL Tränen kann eine kurze Zeit der Ruhigstellung, Verstrebungen, einer fortschreitenden Sanierungsprogramm und regelmäßige Nachuntersuchungen 13,16,17 gehören. Doch viele Studien zeigen, dass die konservative Behandlung bei Sportlern hat mit schlechten Ergebnissen und Versagen in Zusammenhang gebracht. Buckley et a...

Das vordere Kreuzband (ACL) ist ein häufig verletzt intraartikuläre Bandes des Knies. Rund 200.000 (ACL) Verletzungen werden jährlich in den Vereinigten Staaten berichtet. Über 75% der Patienten mit ACL-Verletzung opt für orthopädische rekonstruktive Chirurgie 1,2,3,4. Der chirurgische Eingriff wird häufig aufgrund einer von Natur aus schlechter Heilungspotential 3 angegeben. ACL-Rekonstruktion wird typischerweise mittels eines autologen oder allogenen Sehnen erreicht. Autograft und Allograft stellen den Goldstandard für die Rekonstruktion, wie sie rühmen, hohe Erfolgsquoten und primäre Naht zu reparieren, die andere Behandlungsoption hat Ausfallraten von bis zu 94% 5,6,7 dargestellt. Teilweise Tränen der ACL repräsentieren 10% bis 28% aller ACL Tränen 8. In einer prospektiven Studie, Noyes et al. Geschätzt, dass 50% der Patienten mit teilweise Tränen, die mehr als die Hälfte der ACL ACL fortgeschritten Insuffizienz abgeschlossen, nachdem nicht-operativen Behandlung 9. Andere Studien berichten von anhaltenden Instabilität und verminderte Funktion mit weniger als 30% der Patienten in der Lage, ihre vor der Verletzung Aktivität 9,10,11,12,13 zurückzukehren. Die Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt und umfassen konservative Modalitäten, thermische Schrumpfung der restlichen ACL, ACL oder Wiederaufbau. Kürzlich gab, wurde erhöht Zinsen in Augmented primären Reparatur. Diese Techniken verwenden, um Biologika primäre Naht Reparaturen 14 zu verbessern. Die neuere Forschung hat versucht, ernten mesenchymalen artigen HACL Stammzellen zu Transplantat Einschränkungen zu umgehen, 31,32 aber die Gültigkeit und Wirksamkeit dieser Zellen ist noch unbekannt. Die ideale Zellquelle für das Tissue Engineering-Anwendungen scheint nicht mesechymal HACL abgeleitet Fibroblasten-Zellen sein. Die aktuelle Forschung auf die Identifizierung eines geeigneten Matrixmaterial und Zellquelle für das Gerüst entwickelt, konzentriert. Es ist das übliche Verfahren für einen Kreuzbandriss als su verworfen werdenrgical Abfälle während der Wiederherstellungschirurgie, aber diese beschädigten Band kann eine hochwertige Quelle für den Erwerb von Zellen für die Entwicklung und Verbesserung der ideale Gewebezüchtungen ACL-Ersatz. Unser Labor hat ein Protokoll für die in vitro-Expansion dieser Zellen geerntet HACL abgeleitet entwickelt. Mit einer 2D-Matrix entwickelt, mit HACL abgeleiteten Zellen infundiert haben wir einen Patch, der potenziell verstärken könnte teilweise ACL Reparatur und stärken Bänderriss entworfen.

<table><tbody><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-103C</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Gibco</td><td>17018-029</td><td>Bei 4 &#176 lagern; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Cellgro</td><td>10-092-CV</td><td>Bei 4 &#176;C lagern. Warm in 37 &#176; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>Bei -80 &#176 lagern; C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>Store at 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen - 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Kolben</td><td>BD Falcon</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene-Gemisch</td><td>Lonza</td><td>17-161E</td><td>Bei 4 &#176;C lagern. Warm in 37 &#176; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Brennbare Flüssigkeit. Kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen.</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Corning</td><td>430489</td><td></td></tr><tr><td>PLAGA</td><td>Purac Biomaterials</td><td>Purasorb PLG8523</td><td>Lagern bei -80 &#176; C</td></tr><tr><td>TCPS-Festplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36423-0010</td><td>Mögliche Krebsgefahr. An einem trockenen, kühlen Ort lagern.</td></tr><tr><td>Bytac Papier</td><td>Saint Gobin Performance Plastics</td><td>1420652</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-21G</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Store at 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-&beta;-Aktin-Antikörper (1&#176; Ab)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5441</td><td>Store at -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (2&#176; Ab)</td><td>Zell-Signalweg</td><td>4408</td><td>bei -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Hoechst Farbstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14530</td><td>Store at -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2547-1</td><td>Giftig beim Einatmen und Verschlucken. Verursacht Verbrennungen auf allen Expositionswegen.</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC43085-1000</td><td>Entzündbare Flüssigkeit und Dampf. Verursacht Verbrennungen auf allen Expositionswegen.</td></tr><tr><td>Sterile Schere</td><td>McKesson</td><td>25-716</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo scientific</td><td>2845</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>VX-200</td><td></td></tr><tr><td>Glas Petriplatten</td><td>fisher Scientific</td><td>S31473</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P1225</td><td>Acu-Punch wurde zum Schneiden von 12 mm Scheiben</td></tr><tr><td>Cacodylatpuffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>97068</td><td>Entzündbare Flüssigkeit, krebserregend und reizend.</td></tr><tr><td>Osmiumtetraoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td>Hochgiftig</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Gesundheitsschädlich bei Verschlucken</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td>Von Hitze, Funken, Flammen und anderen Formen der Entzündung fernhalten.</td></tr><tr><td>Allgemein-/Regionalanästhesie</td><td>Amphastar Pharmazeutika</td><td></td><td>1% Lidocain, 0,25% Bupivacain, Anästhetika zur Induktion und Aufrechterhaltung</td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Hospira</td><td>0409-0805-01</td><td>Ancef 1 g i.v.</td></tr><tr><td>Trokar für Arthroskopie</td><td>Smith und Neffe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arthroskopie Kamera</td><td>Smith und Neffe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arthroskopischer Greifer und Bitterer</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,5 mm Rasierer</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interferenzschrauben</td><td>Arthrex</td><td></td><td>Edelstahlschrauben</td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Polaron</td><td>E5400</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische retrieval, isolierung und<em&gt; in-vitro-</em&gt; erweiterung des menschlichen vorderen kreuzbandes abgeleiteten zellen für tissue engineering anwendungen

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Eine Verletzung des ACL ist ein häufig auftretendes Problem in aktive Menschen. Selbst eine teilweise Tränen dieser intraartikuläre Kreuzbandriss führen zu biomechanischen Mängel, die Funktion und Stabilität beeinträchtigen. Aktuelle Optionen für die Behandlung von partiellen ACL Tränen reichen von nicht-operative, konservative Behandlung, mehrere chirurgische Optionen, wie: thermische Änderung, Single-Bundle Reparatur, komplette Rekonstruktion und Wiederaufbau des beschädigten Teil der einheimischen Band. Nur wenige Studien, wenn überhaupt, haben jede einzelne Methode für das Management konsequent überlegen gezeigt, und in vielen Fällen Patienten weiterhin anhaltende Instabilität und andere Begleiterkrankungen zu demonstrieren. Das Ziel dieser Studie ist, um eine mögliche Zellquelle für die Verwendung in der Entwicklung eines mittels Tissue Engineering Patch, der bei der Reparatur einer teilweise abgerissen ACL implementiert werden könnten. Ein neuartiges Protokoll wurde für den Ausbau von Zellen aus patie abgeleitet entwickeltnts ACL-Rekonstruktion unterzogen. Um die Zellen zu isolieren, wurde gehackt während ACL-Rekonstruktion erhalten HACL Gewebe in einer Collagenase-Lösung verdaut. Expansion wurde unter Verwendung von DMEM/F12 Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) ergänzt. Die Zellen wurden dann bei -80 º C oder in flüssigem Stickstoff in einem Gefriermedium, bestehend aus DMSO, FBS und dem Expansionsmedium gespeichert. Nach dem Auftauen wurden die HACL abgeleiteten Zellen dann auf ein Gerüst aus Gewebezüchtungen, PLAGA (Poly Milch-co-Glykolsäure) und Steuergewebekultur-Polystyrol (TCPS) ausgesät. Nach 7 Tagen wurde SEM durchgeführt, um die zelluläre Adhäsion zu der PLAGA TCPS gegenüber der Kontrolle zu vergleichen. Zellmorphologie wurde mit Immunfluoreszenzfärbung ausgewertet. SEM (Rasterelektronenmikroskop) Mikroaufnahmen zeigten, dass Zellen wuchsen und auf beiden PLAGA und TCPS Oberflächen haften und wurden von Tag 7 über die gesamten Oberflächen konfluent. Immunfluoreszenzfärbung zeigten normale, unbelastete morphologischenal Muster auf beiden Oberflächen. Diese Technik ist vielversprechend für Anwendungen in der ACL Regeneration und Rekonstruktion.

Das Arbeitsmodell für die chirurgische Wiederherstellung, Gewebe Verdauung und Isolierung des menschlichen vorderen Kreuzbandes (HACL) abgeleiteten Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die aus den Explantaten migriert und an die T-25-Kolben eingehalten Zellen. Diese Zellen wurden für 3 Tage und dann wurden unter einem Lichtmikroskop (2) sichtbar gemacht. Ein Monolayer wurde von Tag 7 erhalten. Die Anwesenheit von gesunden, lebensfähigen Zellen zeigten die erfolgreichen Abruf und Kultu...

Für zukünftige Anwendungen als Patch zu Teil Tränen des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu reparieren, wurden menschliche ACL abgeleitet von Zellen während rekonstruktive Verfahren, in vitro erweitert und Tissue Engineering Scaffolds gewachsen erhalten Gewebe isoliert. Zelladhäsion und Morphologie wurde dann durchgeführt, um die Biokompatibilität auf Gerüstoberfläche bestätigen.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein gewebeengineeringbasiertes vorderes Kreuzband oder ACL-Pflaster für ein Paar teilweise gerissener ACLs zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst das humane ACL-Gewebe vom Patienten entnommen und in Kochsalzlösung aufbewahrt wird. Die gewonnene ACL-Probe wird zerkleinert und mit Kollagenase verdaut, um aus dem ACL stammende Zellen zu erhalten.Die isolierten Zellen werden anschließend kultiviert und vermehrt. Der nächste Schritt besteht in der Herstellung eines zweidimensionalen Polylactid-co-Glycolid-Scaffolds. Im letzten Schritt werden die Zellen dann auf diesen Polymerfilm ausgesät.Schließlich werden Rasterelektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Biokompatibilität auf der Oberfläche des Gerüsts nachzuweisen. Heute sind wir hier, um unsere Technik zur Entwicklung eines Pflasters für partielle ACL-Risse zu demonstrieren. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der Tatsache, dass ACLs von selbst nicht heilen.Dies ist eine neuartige, innovative Technik, die wir entwickelt haben, um die Heilung des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu unterstützen. Überführen Sie das vom Pathologieinstitut erhaltene humane ACL-Gewebe zunächst in eine Petrischale mit steriler Kochsalzlösung und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zerkleinern Sie das Gewebe mit sterilen Scheren in Stücke von ein bis zwei Kubikmillimeter Größe und waschen Sie das zerkleinerte Gewebe mindestens dreimal mit Kochsalzlösung. Verdauen Sie das Gewebe anschließend mit 0,4 %iger Kollagenase in vollständig supplementiertem, modifiziertem Eagle-Nährmedium (ECCO).F 12-Medium für vier bis sechs Stunden. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 1000 cheese für fünf Minuten. Wir suspendieren die Zellen in Medium, bevor wir die Zellen zwei- bis dreimal mit Medium waschen und anschließend in T-25-Flaschen aussäen und zwei bis drei Tage kultivieren.Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die Zellen zu visualisieren, die zwei bis drei Tage in einem T25-Fläschchen kultiviert wurden. Pflegen Sie die Zellen bei 37 °C im supplementierten DMEM-Medium. Wechseln Sie das Medium, wenn die Zellen Adhärenz zeigen und eine standardmäßige Morphologie aufweisen, wie am Tag sieben unter dem Lichtmikroskop beobachtet.Waschen Sie die konfluenten Zellen mit PBS, geben Sie Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend Medium zu den suspendierten Zellen hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren, und die Zell-Medium-Mischung auf drei T-25-Flaschen verteilen. Die konfluenten Zellen erneut mit PBS waschen, Trypsin hinzufügen und sie dann in Gefriermittel suspendieren, das DMSO, fetalen Kälberserum und vollständiges Medium im Verhältnis 1:2:7 enthält.Lagern Sie die kryogenen Gefäße bei minus 80 Grad Celsius. Falls die Zellen innerhalb eines Monats verwendet werden oder in flüssigem Stickstoff. Wenn die Zellen über längere Zeiträume gelagert werden sollen, lösen Sie ein Gramm Polylactid-co-Glycolid oder P-L-A-G-A in 12 Milliliter Dichlormethan in einem 20-Milliliter-Scintillationsgefäß und wirbeln Sie die Lösung acht Stunden lang mit einer konstanten Geschwindigkeit von 800 U/min.Überführen Sie die gelöste Lösung in eine mit fluorierter Schutzpapier ausgelegte Glas-Petri-Schale. Stellen Sie die Petri-Schale anschließend 30 Minuten lang unter eine Vakuumhaube, bevor Sie die Petri-Schale über Nacht bei minus 20 Grad Celsius stehen lassen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur, um die Verdunstung des restlichen Lösungsmittels sicherzustellen und dünne Filme des Polymers zu erhalten.Stellen Sie anschließend die Polymerfilme 24 Stunden lang in einen Exsikkator. Schneiden Sie die Polymerfilme in kreisförmige Scheiben mit einem Durchmesser von 12 Millimetern und lagern Sie sie bis zur Verwendung im Exsikkator. Nach dem Ansäen der Zellen auf die kontrollierte Gewebekultur, Polystyrol oder TCPS und das P-L-A-G-A-Gerüst bei 50.000 Zellen pro Scheibe.Spülen Sie das Gerüst sieben Tage nach der Aussaat mit PBS. Fixieren Sie die Zellen über Nacht mit 1,5 % Glutaraldehyd in 0,1 molarer Caco-Pufferlösung. Führen Sie danach eine Nachfixierung mit 2,5 % Osmiumtetroxid in 0,1 molarer Caco-Pufferlösung für eine Stunde durch.Nachdem die fixierten Zellen mit 0,1 molarer Caco-Dilat-Pufferlösung gewaschen wurden, trocknen Sie die fixierten Zellen durch serielle Ethanol-Dehydrierung jeweils 15 Minuten lang. Trocknen Sie die Zellen anschließend über Nacht in Hexamethylsilan. Entlüften Sie die Kammer des SEM-Sputter-Beschichtungssystems über das Ventil und heben Sie die obere Platte an.Platzieren Sie die getrockneten Proben in der Kammer und senken Sie die obere Platte ab. Schalten Sie den Pumpenregler ein, um die Evakuierung der Kammer zu starten. Öffnen Sie das Argon-Druckmindererventil und warten Sie, bis das Vakuum auf 0,05 Millibar abgesunken ist.Bestreichen Sie die getrockneten Proben mit einer dünnen Schicht aus Gold-Palladium mithilfe einer Beschichtungsmaschine. Danach schließen Sie das Argon-Druckleckventil wieder. Schalten Sie den Regler auf „Aus“, um die Kammer über das Tastventil zu entlüften und heben Sie die obere Platte an. Entfernen Sie die Proben und lagern Sie sie 24 Stunden lang in einem Exsikkator. Untersuchen Sie die Proben abschließend mittels Rasterelektronenmikroskopie auf Immunfluoreszenzfärbung. Beginnen Sie außerdem damit, die Zellen, die sieben Tage nach der Aussaat auf der kontrollierten TCPS und dem P-L-A-G-A-Gerüst sitzen, mit PBS zu waschen.Danach fixieren Sie die Zellen mit kaltem 70%igem Ethanol für 10 Minuten. Inkubieren Sie die fixierten Zellen bei Raumtemperatur mit 1 % Rinderserumalbumin in PBS mit 0,05 % Triton X-100 für 20 Minuten. Als Nächstes tauchen Sie die Proben bei Raumtemperatur für 20 Minuten in 1 % Tween ein.Fügen Sie monoklonalen mausischen Anti-Beta-Aktin-Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen mit 0,05 % Tween. Anschließend geben Sie den sekundären Antikörper zu den Zellen und inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur.Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, färben Sie die Zellen mit einer Kernfärbung und betten Sie sie mit 80 % Glycerin ein. Abschließend betrachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Vom menschlichen ACL stammende Zellen wurden kultiviert und unter einem Lichtmikroskop visualisiert.Spindel- oder länglich geformte Zellen waren drei Tage nach der Kultivierung auf der Oberfläche von T-25-Flaschen wachsend zu sehen, und bis zum siebten Tag wurde eine konfluente Zellschicht erreicht. Das Vorhandensein gesunder, vitaler Zellen wies auf eine erfolgreiche Gewinnung und Kultivierung der Zellen sowie auf die zelluläre Anheftung an der Oberfläche von Polylactid-co-Glycolid-Scaffolds und die kontrollierte Gewebekultur hin. Die Anwesenheit von Polystyrol wurde qualitativ mittels REM bestimmt, und die Adhärenz sowie Proliferation von menschlichen ACL-abstammenden Zellen ist hier auf jeder Polymeroberfläche sichtbar.Die zelluläre Konfluenz wurde ebenfalls beobachtet. Die Analyse der zellulären Morphologie und Adhäsion erfolgte mittels immunfluoreszenzbasierter Färbung. Die grüne Färbung von Beta-Aktin zeigt, dass die aus menschlichem vorderem Kreuzband (ACL) stammenden Zellen, sowohl auf P-L-A-G-A als auch auf TCPS, ein normales, nicht-stressbedingtes Erscheinungsbild aufweisen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein ziemlich gutes Verständnis dafür haben, wie man ein gewebetechnisch hergestelltes Pflaster für partielle ACL-Risse unter Verwendung von Gewebeengineering-Methoden mit aus menschlichem ACL-Gewebe gewonnenen ACL-Zellen entwirft sowie die Gewebekompatibilität mittels Immunfluoreszenz und Färbung für diese Technik untersucht. Vielen Dank.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation für Umbau und Reparatur von Knorpeldefekten in einem Kaninchen-Modell

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von...

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Tiermodelle sind wichtige Werkzeuge für die Bewertung von Tissue-Engineering-Transplantaten. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Herstellung eines elektrogesponnenen, biologisch abbaubaren Polymertransplantats für die Verwendung im Tissue Engineering des vorderen Kreuzbandes sowie ein chirurgisches Protokoll für die Implantation in ein Rattenmodell vorgestellt.

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Tissue Engineering umfasst oft in vitro-Expansion um Autotransplantate für die Geweberegeneration zu erstellen. In dieser Studie wurde ein Verfahren zur Gewebeexpansion, Regeneration, Rekonstruktion und in vivo wurde entwickelt, um die Verarbeitung von Zellen und biologischen Materialien außerhalb des Körpers zu minimieren.

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Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

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Chirurgische Retrieval, Isolierung und In-vitro- Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen (Video) | JoVE Journal

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