Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Das übergeordnete Ziel dieses schnellen postmortalen Zellkulturprotokolls ist es, haltbare, von Patienten stammende Zellkulturen des diffusen intrinsischen Ponsglioms zu erzeugen, um die Experimente zu erleichtern, die zum Verständnis und letztendlich zur Entwicklung wirksamer Therapien für DIPG erforderlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur grundlegenden Biologie und zu therapeutischen Strategien des diffusen intrinsischen Ponsglioms zu beantworten, z. B. ob bestimmte Medikamente in verschiedenen patienteneigenen Kulturen wirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Untersuchung der Biologie von Patientenzellen ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von DIPG, da sie die Erprobung verschiedener therapeutischer Strategien für verschiedene genetische Subtypen der Krankheit ermöglicht. Obwohl diese Methode Einblicke in die DIPG geben kann, kann sie auch auf andere Krankheiten angewendet werden, wie z. B. andere hochgradige Gliome bei Kindern, adulte Glioblastome oder andere Tumoren des zentralen Nervensystems. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, Autopsieproben effizient zu beschaffen und schnell zu verarbeiten.

Sterilisieren Sie vor der Probenvorbereitung die Gewebekulturhaube zusammen mit Rasierklingen, gebogenen Hämostaten und anderen unsterilen Werkzeugen eine Stunde lang unter UV-Licht und führen Sie alle folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen durch. Als nächstes überführen Sie das Gewebe in eine hochwandige, 100 Millimeter x 20 Millimeter große Zellkulturschale. Entfernen Sie die vom Versand übrig gebliebenen Medien und ersetzen Sie sie durch 10 bis 15 Milliliter Kaltkulturmedien.

Greifen Sie dann mit den gebogenen Hämostaten nach einer Rasierklinge und hacken Sie das Gewebe fein, während Sie die Blutgefäße oder Hirnhäute entfernen. Die endgültigen Gewebefragmente sollten kleiner als ein Millimeter sein. Übertragen Sie anschließend das Tuch in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Zellkulturschale mit weiteren fünf Millilitern Kaltkulturmedium und geben Sie die Probe in das konische Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt bei Bedarf, um das restliche Gewebe zu übertragen. Zerreiben Sie die Probe mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette vier- bis fünfmal vorsichtig.

Lassen Sie größere Gewebefragmente am Boden des Röhrchens absetzen. Falls erforderlich, zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang kurz. Um die dissoziierte Fraktion aufzufangen, entfernen Sie den Überstand und filtratieren Sie durch einen 100-Mikron-Filter in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Mechanische Dissoziation.

Drehen Sie den Filter über das ursprüngliche konische Rohr und waschen Sie es mit Nährmedien, um die Gewebefragmente zurückzugewinnen. Anschließend zentrifugieren Sie die mechanische Dissoziationsfraktion fünf Minuten lang. Entfernen Sie anschließend den Überstand aus der pelletierten mechanischen Dissoziationsfraktion und suspendieren Sie das Gewebe wieder in kalten Kulturmedien.

Wenn sich mehr als fünf Milliliter Gewebe in dem konischen Röhrchen mit mechanischer Dissoziation befinden, teilen Sie das Gewebe in andere konische 50-Milliliter-Röhrchen auf, so dass kein Röhrchen mehr als fünf Milliliter Gewebe enthält. Lagern Sie dann die mechanisch dissoziierte Fraktion bis zum Schritt der Saccharosegradientenzentrifugation auf Eis. Bei diesem Verfahren zentrifugieren Sie das konische Röhrchen mit den restlichen Gewebefragmenten fünf Minuten lang.

Danach wird der Überstand entfernt und die vorgewärmte enzymatische Aufschlusslösung hinzugefügt, so dass fünf Milliliter Aufschlusslösung auf jeden Milliliter Gewebe kommen. Verschließen Sie dann den konischen Röhrchendeckel mit Laborfolie und inkubieren Sie die Reaktion auf einem Rotator bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Proben vorsichtig zerreiben.

Pipettieren Sie die Probe mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette sechs- bis achtmal auf und ab und vermeiden Sie die Bildung übermäßiger Luftblasen. Fügen Sie als Nächstes eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze an das Ende der Pipette hinzu und zerreiben Sie die Probe weitere sechs bis acht Mal. Lassen Sie alle verbleibenden Stücke am Boden des Rohrs absetzen.

Entfernen und filtrieren Sie dann den Überstand, wobei die Zellen noch durch einen 100-Mikron-Filter schweben, in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Enzymatische Dissoziation und lagern Sie es auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend das enzymatische Dissoziationsröhrchen fünf Minuten lang und fahren Sie mit der Saccharosegradientenzentrifugation fort. Wenn die Probe noch in Lösung suspendiert ist, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und suspendieren Sie das Gewebe in 20 Millilitern kaltem HBSS ohne Kalzium und Magnesium wieder. Bringen Sie dann das Volumen mit kaltem HBSS auf 25 Milliliter. Fügen Sie langsam 25 Milliliter 1,8 molare Saccharoselösung hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen.

Daraus ergibt sich ein Saccharosegradient von 0,9 molaren Zähnen. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang ohne Pause. Aspirieren Sie die Myelinreste vorsichtig in so viel Saccharose-Saccharose-Lösung wie möglich.

Waschen Sie dann die Probe, indem Sie 30 Milliliter kaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzufügen und vorsichtig mischen. Danach zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang. Entfernen Sie bei diesem Vorgang den Waschüberstand.

Fügen Sie fünf Milliliter ACK-Lysepuffer hinzu und suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig wieder, indem Sie das Röhrchen eine Minute lang bei Raumtemperatur schwenken. Beenden Sie dann die Lyse, indem Sie 30 Milliliter kaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium hinzufügen. Anschließend zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang.

Suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in 10 bis 15 Millilitern warmem vollständigem TSM mit Wachstumsfaktoren und quantifizieren Sie die Dichte lebensfähiger Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses. Anschließend wird die endgültige Zellsuspension in einen neuen T75-Kulturkolben überführt. Fügen Sie jeden zweiten Tag zusätzliche Wachstumsfaktoren hinzu, um den Gesamtwert der Wachstumsfaktoren aufrechtzuerhalten, und überwachen Sie die Entwicklung der Neurosphären der Tumorzellen.

Hier sind verschiedene Beispiele dafür, wie die Proben von den frühen Stadien der Kultivierung bis hin zu einer dauerhaften Kultur aussehen können. Anfangs scheinen plattierte und frühe Kulturen oft nicht viele überlebende Zellen zu enthalten. Darüber hinaus weisen frühe Zellcluster oft nicht den Kontrastgrad auf, der typischerweise mit Neurosphären verbunden ist.

Die anfängliche Passage dieser Zellcluster, kombiniert mit einer umgekehrten Filterung von Zellclustern, kann jedoch gesunde Tumorzellen isolieren, die in der Lage sind, Kugeln zu bilden. Das Filtrat enthält in der Regel Reste. Diese von Patienten stammenden Proben können dann für mehrere Passagen in Kultur aufbewahrt werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probe bei jedem Schritt mit Ausnahme der enzymatischen Dissoziation bei kalter Temperatur gehalten wird, und die traumatische Handhabung der Probe zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Studien durchgeführt werden, wie z. B. ein In-vitro-Wirkstoffscreening oder eine orthotope Xenotransplantation, um spätere Fragen zur DIPG-Pathobiologie zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung hat diese Kulturtechnik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der pädiatrischen Neuroonkologie geebnet, um neue therapeutische Wege für Kinder mit DIPG zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie schnelle postmortale Zellkulturprotokolle an Hirntumorproben durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und steriler Technik immer getroffen werden sollten.