Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Das übergeordnete Ziel dieser Zell-Mikroarray-Plattform besteht darin, Messungen der Zelldifferenzierung und Zugkräfte in Abhängigkeit vom mikroumgebungsbedingten Kontext miteinander zu korrelieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Gewebeingenieurwesens zu beantworten, indem sie sowohl grundlegende Untersuchungen der Stammzellbiologie als auch die Optimierung von Differenzierungsprotokollen ermöglicht. Zu den Hauptvorteilen dieser Technik zählen ihre Durchsatzleistung, die Möglichkeit, biochemische und biophysikalische Reize zu variieren, sowie Endpunkt-Analysen mittels Immunfluoreszenz und Traktionskraftmikroskopie (TFM).

Obwohl diese Methode verwendet wurde, kann sie von Personen, die die Differenzierung von Leberprogenitorzellen verstehen, leicht auf andere arterielle Zelltypen und Gewebeumgebungen übertragen werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der experimentelle Erfolg von der Integration des Array-Protokolls sowohl mit hochwertigen Hydrogel-Substraten als auch mit der Traktionskraftmikroskopie abhängt. Um fluoreszierende Kügelchen enthaltende Polyacrylamid-Hydrogele auf einer silanisierten 35-mm-Glasboden-Petrischale zur lebenden Beurteilung von Zell-Substrat-Wechselwirkungen mittels TFM herzustellen, bereiten Sie zunächst die Glas-Substrate in Lösungen gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.

Legen Sie silanisierte 35-mm-Glasboden-Petri-Schalen in ein Glas-Trockengefäß und pipettieren Sie 20 Mikroliter einer 9:1-Vorpolymer-Perlen-zu-Photoinitiator-Lösung in die Mitte jeder Schale. Decken Sie jede Schale vorsichtig mit einem 12-mm-runden Deckglas ab, wobei Sie die Bildung von Blasen vermeiden sollten. Um die Verteilung der fluoreszierenden Perlen auf der Oberfläche des Hydrogels zu gewährleisten, drehen Sie die Schalen um und lassen Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Während die Schale weiterhin invertiert ist, 10 Minuten lang mit 365 Nanometer UVA bestrahlen. Die Polymerisationszeit gegebenenfalls optimieren. Anschließend die Hydrogels in 1 molarem HEPES-Puffer einlegen und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln belassen.

Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einem Rasiermesser, wobei darauf geachtet werden muss, die polymerisierten Hydrogelen nicht zu beschädigen. Trocknen Sie die Hydrogelen bei 50 Grad Celsius auf einer Heizplatte, bis sie vollständig trocken sind. Die Hydrogelen können drei Monate lang bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert werden.

Bereiten Sie die Puffer zum Auftragen der Biomoleküle und für die Quellplatte wie im Textprotokoll beschrieben vor. Nachdem Sie die sauberen Pins wie im Textprotokoll beschrieben geladen haben, bereiten Sie den Mikroarrayer vor und programmieren Sie ihn mithilfe der Hersteller-Software. Schalten Sie anschließend die Befeuchtungseinheit ein.

Stellen Sie den Sollwert auf 65 % relative Luftfeuchtigkeit ein und warten Sie, bis das Rheometer den Sollwert erreicht hat. Legen Sie die Quellplatte in den entsprechenden Adapter ein. Anschließend werden die dehydrierten Hydrogelsubstrate in den entsprechenden Adapter gegeben.

Passen Sie die Parameter des Programms an, um das Layout der Quellplatte, das Array-Design und das gewünschte Format genau widerzuspiegeln. Starten Sie die Array-Herstellung. Überprüfen Sie mindestens einmal pro Stunde, ob die Luftfeuchtigkeit nicht unter 65 % relativer Luftfeuchtigkeit gesunken ist und ob die Pins verstopft sind.

Wenn die Luftfeuchtigkeit unerwartet abgesunken ist, unterbrechen Sie das Arraying, um den Luftbefeuchter nachzufüllen und die zugehörigen Schläuche von Kondensat zu befreien. Wenn die Pins verstopft sind, unterbrechen Sie das Arraying, um die Pins zu reinigen, oder ersetzen Sie sie durch vorgereinigte Pins. Sobald das Programm abgeschlossen ist, legen Sie die hergestellten Arrays in eine Objektträgerbox oder Mikrotiterplatte, die mit Aluminiumfolie abgedeckt ist.

Lassen Sie die Arrays über Nacht bei Raumtemperatur und 65 % relativer Luftfeuchtigkeit. Nach unserer Erfahrung treten die häufigsten Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Array-Herstellung auf. Wir empfehlen, die technische Qualität und Robustheit der hergestellten Arrays mithilfe fluoreszenzmarkierter Moleküle, allgemeiner Protein-Färbungen und Immunfluoreszenzen zu überprüfen.

Am Tag nach der Herstellung die Array-35-mm-Petrischalen in 3 mL 1 % (Volumen pro Volumen) Penicillin-Streptomycin in PVS eintauchen. Die angeordneten Substrate 30 Minuten lang UVC aussetzen. Anschließend die Penicillin-Streptomycin-Lösung durch Zellkulturmedium ersetzen.

Nach der Sammlung und Zählung der Zellen werden diese auf Arrays mit je 3 mL pro 35-mm-Petrischale ausgesät. Die Array-Kulturen werden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für zwei bis 24 Stunden inkubiert oder bis zur Bildung gut besiedelter Zellinseln. Die Aussaatdichte und Inkubationsdauer können je nach Zelltyp und spezifischer Anwendung angepasst werden.

Nachdem die Bildung von Zellinseln zugelassen wurde, waschen Sie die Array-Kulturen zweimal mit jeweils 3 mL vorgewärmtem Zellkulturmedium. An diesem Punkt können die geeigneten Kontrollen und die gewünschten Behandlungen zum biologischen System hinzugefügt werden. Wechseln Sie das Medium der Arrays alle ein bis zwei Tage, um die Konzentration der jeweiligen Behandlungen aufrechtzuerhalten.

Eine bis fünf Tage nach der Inokulation der Array-Kulturen die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat mittels TFM in lebenden Zellen bewerten. Die 35-mm-Petri-Schalen mit den Array-Kulturen auf ein inkubiertes inverses Fluoreszenzmikroskop mit robotischem Probentisch für TFM-Messungen übertragen. In einer Schale die Positionen und Fokusebenen einzelner Zellinseln mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie markieren.

Wechseln Sie zur langroten fluoreszierenden Mikroskopie, um die Kügelchen zu visualisieren. Kehren Sie dann zu jeder der in der vorherigen Phase gespeicherten Positionen zurück und korrigieren Sie die z-Koordinate der Fokusebene, sodass nur die erste Schicht der Kügelchen unterhalb der Zellinsel scharf ist. Speichern Sie die neuen Koordinaten und fahren Sie mit der automatisierten Bildaufnahme aller Zellinseln fort, um die Phasenkontrast- und langroten fluoreszierenden Bilder der Prädissoziationsphase aufzunehmen.

Fügen Sie anschließend vorsichtig 150 Mikroliter BSA/SDS-Lösung der Schale hinzu und warten Sie fünf Minuten, um eine vollständige Zellablösung vom Substrat zu ermöglichen. Überwachen Sie die Zellablösung mittels Phasenkontrastmikroskopie. Sobald die Zellinseln vom Substrat abgelöst sind, kehren Sie zu den markierten Positionen zurück und prüfen Sie, ob die erste Beads-Schicht weiterhin scharf gestellt ist.

Falls diese Kügelchen aufgrund von zellulär erzeugten Zugkräften aus der Ebene verschoben sind, korrigieren Sie die z-Koordinate der Fokusebene, sodass sie wieder scharf abgebildet werden. Speichern Sie die korrigierten z-Koordinaten und wiederholen Sie die automatisierte Aufnahme aller Inseln, um die Fluoreszenzbilder nach der Dissoziation im fernen Roten zu erfassen. Wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden Schalen.

Protein A/G-konjugierte Notch-Liganden Jagged-1 und Delta-ähnlich-1 zeigten eine verbesserte Retention in Hydrogelen. Die Präsentation der Notch-Liganden induzierte zudem die Differenzierung von Lebervorläuferzellen in Richtung einer Gallengangzell-Schicksalslinie, wie durch das Vorhandensein des grünen Markers für Gallengangzellen angezeigt. Die Reaktion auf Notch-Liganden wurde für fünf extrazelluläre Matrixproteine, oder ECM-Proteine, quantifiziert und zeigte, dass die Reaktion von Lebervorläuferzellen auf Liganden vom ECM-Kontext abhängt.

Die Knockdown-Methode mit kurzen Haarnadels-RNAs wurde verwendet, um Vorläuferzellen ohne die Liganden Delta-like 1 und Jagged 1 zu erzeugen. Anschließend wurden die Zellen den Notch-Liganden Jagged 1 sowie Delta-like 1 und Delta-like 4 präsentiert. Die Reaktion auf die verschiedenen Notch-Liganden variierte je nach der zelleigenen Expression eines der beiden Liganden.

Diese Bilder zeigen die Differenzierung von Lebervorläuferzellen in Abhängigkeit von der Substratsteifigkeit und der Zusammensetzung der ECM. Die quantitative Analyse ergab, dass Kollagen vier die Differenzierung sowohl auf weichen als auch auf steifen Substraten unterstützt, während Fibronectin die Differenzierung nur auf steifen Substraten fördert. Repräsentative Wärmekarten deuten darauf hin, dass anhaltende Zugspannung bei geringer Substratsteifigkeit auf Kollagen vier die Differenzierung in Gallengangzellen begünstigt.

Diese Beobachtung wurde durch die Quantifizierung der durchschnittlichen Effektivwerte der Zugspannung bestätigt. Dieses Video und das begleitende Protokoll haben die wichtigsten Schritte zur Herstellung von Hydrogelen und Arrays zur Zellkultur auf strukturierten Substraten sowie zur Messung der Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat mittels Zugkraftmikroskopie beschrieben. Nachdem man mit den Techniken vertraut ist, kann jedes Experiment bei sachgemäßer Durchführung in nur ein bis zwei Wochen abgeschlossen werden.

Im Gegensatz zu dieser Methode sollten Zellkulturen verwendet werden, um vielversprechende Array-Bedingungen mittels qualitativer PCR, Immunsouthern, standardmäßigen mechanobiologischen Assays oder anderen komplementären molekularbiologischen Techniken zu validieren. Diese vielseitige Plattform kann für die hochdurchsatzfähige Untersuchung von Zellfunktionen in einer Vielzahl von Zell- und Gewebekontexten eingesetzt werden, einschließlich der Differenzierung von Stammzellen und der Biologie von Krebszellen.