Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Das übergeordnete Ziel dieser Zell-Microarray-Plattform ist es, Messungen sowohl der Zelldifferenzierung als auch der Zugkräfte in Abhängigkeit vom Mikroumgebungskontext zu korrelieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten und ermöglicht sowohl grundlegende Untersuchungen der Stammzellbiologie als auch die Optimierung von Differenzierungsprotokollen. Zu den Hauptvorteilen dieser Technik gehören der Durchsatz, die Möglichkeit, biochemische und biophysikalische Signale zu variieren, und die Endpunktauslesung sowohl durch Immunfluoreszenz als auch durch Traktionskraftmikroskopie (TFM).

Obwohl diese Methode verwendet wurde, können diejenigen, die die Differenzierung von Lebervorläufern verstehen, leicht auf andere arterielle Zelltypen und Gewebekontexte angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der experimentelle Erfolg von der Integration des Arraying-Protokolls sowohl mit hochwertigen Hydrogel-Substraten als auch mit der Zugkraftmikroskopie abhängt. Zur Herstellung von fluoreszierenden Kügelchen, die Polyacrylamid-Hydrogele enthalten, auf einer silanisierten 35-mm-Petrischale mit Glasboden für die Live-Bewertung von Zellsubstratinteraktionen unter Verwendung von TFM werden zunächst Glassubstrate in Lösungen hergestellt, wie im Textprotokoll beschrieben.

Legen Sie silanisierte 35-mm-Petrischalen mit Glasboden in eine Glastrocknungsschale und pipettieren Sie 20 Mikroliter 9-zu-1-Präpolymerkügelchen in die Photoinitiatorlösung in die Mitte jeder Schale. Decken Sie jede Schale vorsichtig mit einem 12 mm dicken kreisförmigen Deckglas ab und vermeiden Sie dabei die Bildung von Blasen. Um die fluoreszierenden Kügelchen auf der Oberfläche des Hydrogels zu verteilen, drehen Sie die Schalen um und lassen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Setzen Sie die Schale im invertierten Zustand 10 Minuten lang 365 Nanometern UVA aus. Optimieren Sie die Polymerisationszeit nach Bedarf. Tauchen Sie anschließend die Hydrogele in 1 molaren HEPES-Puffer und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen.

Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einem Rasiermesser und achten Sie darauf, die polymerisierten Hydrogele nicht zu beschädigen. Die Hydrogele bei 50 Grad Celsius auf einer heißen Platte dehydrieren, bis sie trocken sind. Hydrogele können bei Raumtemperatur im Dunkeln drei Monate gelagert werden.

Bereiten Sie Puffer für den Druck der Biomoleküle und für die Quellplatte vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Laden der sauberen Pins, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie den Microarrayer vor und programmieren Sie ihn mit der Herstellersoftware. Schalten Sie anschließend die Luftbefeuchtereinheit ein.

Stellen Sie den Sollwert auf 65 % relative Luftfeuchtigkeit ein und warten Sie, bis das Rheometer den Sollwert erreicht hat. Setzen Sie die Quellplatte in den entsprechenden Adapter ein. Legen Sie dann die dehydrierten Hydrogel-Substrate in den entsprechenden Adapter ein.

Passen Sie die Parameter des Programms an, um das Layout der Quellplatte, das Array-Design und das gewünschte Format genau widerzuspiegeln. Starten Sie die Array-Herstellung. Überprüfen Sie mindestens einmal pro Stunde, ob die Luftfeuchtigkeit nicht unter 65 % relative Luftfeuchtigkeit gefallen ist und dass die Stifte nicht verstopft sind.

Wenn die Luftfeuchtigkeit unerwartet gesunken ist, unterbrechen Sie die Anordnung, um den Luftbefeuchter zu füllen und die zugehörigen Rohre von Kondenswasser zu befreien. Wenn die Pins verstopft sind, unterbrechen Sie das Arraying, um die Pins zu reinigen, oder ersetzen Sie sie anderweitig durch vorgereinigte Pins. Sobald das Programm abgeschlossen ist, legen Sie die hergestellten Arrays in eine mit Aluminiumfolie bedeckte Objektträgerbox oder Mikroplatte.

Lassen Sie die Arrays über Nacht bei Raumtemperatur bei 65 % relativer Luftfeuchtigkeit. Unserer Erfahrung nach hängen die häufigsten Schwierigkeiten mit der Herstellung von Arrays zusammen. Wir empfehlen, die technische Qualität und Robustheit von hergestellten Arrays mit fluoreszenzmarkierten Molekülen, allgemeinen Proteinfärbungen und Immunfluoreszenzen zu bestätigen.

Tauchen Sie die 35-mm-Petrischalen des Arrays am Tag nach der Herstellung in 3 ml Penicillin-Streptomycin mit 1 Vol.-% in PVS. Setzen Sie die angeordneten Substrate 30 Minuten lang UVC aus. Tauschen Sie dann die Penicillin-Streptomycin-Lösung gegen Zellkulturmedien aus.

Nachdem Sie die Zellen gesammelt und gezählt haben, säen Sie die Zellen auf Arrays mit 3 ml pro 35-mm-Petrischale. Inkubieren Sie die Array-Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für zwei bis 24 Stunden oder bis zur Bildung gut besiedelter Zellinseln. Die Aussaatdichte und -zeit kann je nach Zellen und Anwendung angepasst werden.

Nachdem Sie die Bildung von Zellinseln ermöglicht haben, waschen Sie die Array-Kulturen zweimal mit 3 mL vorgewärmtem Zellkulturmedium. An diesem Punkt können die geeigneten Kontrollen und Behandlungen, die für das biologische System von Interesse sind, hinzugefügt werden. Wechseln Sie die Medien der Arrays alle ein bis zwei Tage, um die Konzentration aller Behandlungen aufrechtzuerhalten.

Führen Sie innerhalb von ein bis fünf Tagen nach der Initiierung von Array-Kulturen eine Live-Bewertung der Zellsubstratinteraktionen mit TFM durch. Bewegen Sie die 35-mm-Petrischalen mit den Array-Kulturen in ein inkubiertes inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem Robotertisch für TFM-Messungen. Markieren Sie in einer Schale die Positionen und Fokusebenen der einzelnen Zellinseln mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie.

Wechseln Sie zur dunkelroten Fluoreszenzmikroskopie, um die Kügelchen sichtbar zu machen. Kehren Sie dann zu jeder der im vorherigen Schritt gespeicherten Positionen zurück und korrigieren Sie die Z-Koordinate der Fokusebene, sodass nur die erste Schicht der Perlen unterhalb der Zellinsel scharf ist. Speichern Sie die neuen Koordinaten und fahren Sie mit der automatischen Bildgebung aller Zellinseln fort, um den Phasenkontrast vor der Dissoziation und fernrote Fluoreszenzbilder zu erfassen.

Geben Sie dann vorsichtig 150 Mikroliter BSA/SDS-Lösung in die Schale und warten Sie fünf Minuten, bis die Zellen vollständig vom Substrat getrennt sind. Überwachen Sie die Zelldissoziation mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie. Nachdem die Zellinseln vom Substrat dissoziiert wurden, kehren Sie zu den markierten Positionen zurück und überprüfen Sie, ob die erste Schicht der Kügelchen noch scharf ist.

Wenn sich diese Kügelchen aufgrund von Verformungen, die durch zellerzeugte Traktion induziert werden, außerhalb der Ebene befinden, korrigieren Sie die z-Koordinate der fokussierten Ebene, sodass sie wieder scharf sind. Speichern Sie die korrigierten Z-Koordinaten und wiederholen Sie die automatische Bildgebung aller Inseln, um die fernroten Fluoreszenzbilder nach der Dissoziation aufzunehmen. Wiederholen Sie diese Schritte für die restlichen Gerichte.

Protein A/G-konjugierte Kerbliganden zeigten eine gezackte und deltaartige Liganden eine verbesserte Retention in Hydrogelen. Die Präsentation des Kerbliganden führte auch zu einer Differenzierung der Lebervorläuferzellen in Richtung eines Schicksals der Gallengangszellen, wie das Vorhandensein des grünen Gallengangszellmarkers zeigt. Die Reaktion auf Kerbliganden wurde für fünf extrazelluläre Matrix- oder EZM-Proteine quantifiziert und zeigte, dass die Reaktion der Lebervorläufer auf Liganden vom EZM-Kontext abhängt.

Der RNA-Knockdown in kleinen Haarnadeln wurde verwendet, um Vorläuferzellen ohne die Liganden Delta Like One und Jagged Ligand zu erzeugen. Die Zellen wurden dann mit den Kerbliganden gezackt eins und delta wie eins und delta wie vier präsentiert. Das Ansprechen auf den Array-Notch-Liganden variierte in Abhängigkeit von der zellintrinsischen Expression eines der beiden Liganden.

Diese Bilder zeigen die Differenzierung der Lebervorläuferzellen in Abhängigkeit sowohl von der Substratsteifigkeit als auch von der EZM-Zusammensetzung. Die quantitative Analyse ergab, dass Kollagen vier die Differenzierung sowohl auf weichen als auch auf steifen Substraten unterstützt, während Fibronektin die Differenzierung nur auf steifen Substraten unterstützt. Repräsentative Heatmaps deuten darauf hin, dass anhaltende Zugbelastung bei geringer Substratsteifigkeit auf Kollagen vier die Differenzierung in Gallengangszellen fördert.

Dieser Befund wurde durch die Quantifizierung der durchschnittlichen quadratischen Mittelwerte der Zugspannung bestätigt. Dieses Video und das dazugehörige Protokoll haben die wichtigsten Schritte für die Herstellung von Hydrogelen und Arrays für die Durchführung von Zellkulturen auf den angeordneten Substraten und für die Messung von Zellsubstratwechselwirkungen mit Hilfe der Zugkraftmikroskopie beschrieben. Nachdem man sich mit den Techniken vertraut gemacht hat, kann jedes Experiment in nur ein bis zwei Wochen abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

In Kombination mit dieser Methode sollten Zellkulturen verwendet werden, um Array-Bedingungen mit hoher Punktzahl unter Verwendung von qualitativer PCR, Immunblotting, Mechanobiologie-Achsen im Standardmaßstab oder anderen komplementären molekularbiologischen Techniken zu validieren. Diese vielseitige Plattform kann für die Hochdurchsatzuntersuchung von Zellfunktionen in einer Vielzahl von Zell- und Gewebekontexten eingesetzt werden, einschließlich der Stammzelldifferenzierung und der Krebszellbiologie.