Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Züchten Sie die gewünschte Zelllinie als adhärente 2D-Monoschicht. Entfernen Sie das Nährmedium und waschen Sie es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Dann wird Trypsin hinzugefügt und inkubiert, während sich die Zellen von der Kolbenoberfläche lösen und rund werden. Fügen Sie frische Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen zu suspendieren. Füllen Sie die Mischung in ein konisches Rohr und verwenden Sie eine Zentrifuge, um die Zellen zu pelletieren.

Ersetzen Sie den Überstand durch frisches Medium und resuspendieren Sie das Pellet der Zelle. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu zählen und eine Arbeitskonzentration zu berechnen. Übertragen Sie dann die richtige Menge der Zellmischung in eine Well-Platte mit rundem Boden und extrem geringer Adhäsion und inkubieren Sie. Die Zellen setzen sich am Boden ab und aggregieren. Sie werden schließlich aneinander aneinander anheften und eine kompakte 3D-Zellanordnung, das Sphäroide, bilden.

Im Beispielprotokoll sehen wir, wie man 3D-Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie generiert und wie Live-Bildgebung angewendet wird, um ihre Entstehung zu verfolgen. Beginnen Sie damit, die interessierende Darmkrebszelllinie mit fünf Millilitern PBS zu waschen und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 0,5 Millilitern Trypsin aus dem Kolbenboden zu entfernen. Nachdem Sie die Ablösung unter einem Mikroskop bestätigt haben, neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym mit 10 Millilitern vollständigem Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Das Pellet wird zur Zählung in fünf Millilitern frischem Vollmedium resuspendiert und die Zellen in einer Konzentration von 1,5 mal 10 bis zur dritten Zelle pro Milliliter resuspendiert.

Säen Sie dann 20 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und platzieren Sie die Platte in einem automatisierten Bildgebungsgerät in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Melden Sie sich bei der Erfassungssoftware des Geräts an und wählen Sie "Zeitplan für die Erfassung", "Schiff hinzufügen", "Nach Zeitplan scannen" und "Schiff erstellen, neu". Wählen Sie als Nächstes Scan-Typ, Sphäroid und wählen Sie die entsprechenden Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle aus. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 10-fache ein und wählen Sie das Plattenmodell und seine Position in der Schublade des Bildgeräts aus. Wählen Sie die Position der Wells aus, die abgebildet werden sollen, und geben Sie die Beschreibung des Experiments ein, einschließlich des Namens, des Zelltyps und der Anzahl der Zellen.

Wählen Sie für die Analyseeinrichtung die Option Analyse auf später verschieben aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitachse, wählen Sie Ausgewähltes Scangruppenintervall festlegen aus, und legen Sie Scans hinzufügen Alle auf vier Stunden und Für insgesamt auf 24 Stunden fest. Dann wird die Startzeit auf mindestens eine Stunde nach der Inkubation in der automatisierten Bildgebungsapparatur eingestellt. Um den Fortschritt des Sphäroidwachstums zu überprüfen, melden Sie sich alle zwei Tage bei der Bildgebungssoftware an und wählen Sie "Letzte Scans anzeigen". Doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment und wählen Sie im Bedienfeld "Bildkanäle" die Option "Hellfeld". Verwenden Sie dann das Werkzeug Bild-Features messen, um den Durchmesser der Sphäroide zu messen. Zugabe von 50 Mikrolitern des kompletten Mediums pro Vertiefung am vierten Tag, um die Auswirkungen des Erscheinungsmediums zu begrenzen.