Name: Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Herstellung von mehrdimensionalen Sphäroiden für die Lebendzellmikroskopie mit FLIM. Diese Technik ermöglicht die Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung in 3D-Modellen.

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Diese Arbeit wurde durch die Stipendien des Sonderforschungsfonds (BOF) der Universität Gent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), der Forschungsstiftung Flandern (FWO, I001922N) und der Europäischen Union, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN Nr. 101073507.

Multizelluläre Sphäroidbildung für FLIM-basierte Stoffwechsel- und Hypoxieanalytik

Nichts offenzulegen.

Multizelluläre Sphäroide werden zu einer Methode der Wahl bei der Untersuchung von Tumor- und Stammzell-Nischenmikroumgebungen, der Arzneimittelforschung und der Entwicklung der "Gewebebausteine" für die Biofabrikation. Die heterogene innere Architektur der Sphäroide, die Gradienten der Nährstoffe und die Sauerstoffversorgung können die von in vivo-Geweben und Tumoren in einer relativ vereinfachten und zugänglichen Umgebung nachahmen. Mit dem Bedarf an mehr methodischer Transparenz 26,28 und Standardisierung71 wird erwartet, dass diese Protokolle den Forschern helfen, die beste Methode zur Sphäroidbildung für die Live-Experimente der quantitativen Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie auszuwählen. Die vorgestellten Methoden nutzen die Vorteile von Nanopartikelsensoren für die Zellfärbung und der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz, die sich leicht mit der Färbung des Zelltods kombinieren lassen.
Die kritischsten Schritte sind das Protokoll zur Sphäroidbildung; Für das Hochdurchsatz-Agarose-basierte Verfahren ist es daher unerlässlich, die Agaroseformen für die Kulturmedien ausreichend auszugleichen. Eine unzureichende Äquilibrierungszeit führt zu einer Verdünnung der Nährstoffe im verbleibenden PBS und bringt zusätzliche Faktoren für die Heterogenität der Sphäroide mit sich 21,26,72,73. Die frisch hergestellte Agaroseform muss auch visuell auf das Vorhandensein von Luftblasen, Mikrorissen und anderen Defekten überprüft werden.
Obwohl die Suspension von Nanopartikeln für die Bildgebung effizient ist, kann sie eine Selbstaggregation aufweisen und die Bildung von unregelmäßig geformten Sphäroiden bei Methoden zur Bildung geringer Bindungen verursachen. Dies kann häufig durch die Zugabe von Serum zu den Kulturmedien oder durch Vorfärben der Monolayer-Zellkultur vor der Sphäroidbildung gemildert werden. Häufig kann bei der Sphäroidverdichtung auch die Zugabe einer kleinen Menge Nanopartikel (z. B. 10 % der anfänglichen Färbekonzentration) dazu beitragen, die proliferierende Zone der Sphäroide zu färben. Schließlich ist es wichtig, bei allen Formationsmethoden "staubfreie" sterile Pipettenspitzen zu verwenden.
Die möglichen Auswirkungen der Beleuchtung auf die Lebensfähigkeit der Zellen müssen bei bildgebenden Experimenten immer berücksichtigt werden. Daher ist es wichtig, die Risikofaktoren zu kennen, die sich negativ auf jedes Live-Imaging-Experiment auswirken. Im Allgemeinen umfasst die Lichtschädigung mehrere Mechanismen: (1) einen hohen lokalen Temperaturanstieg, (2) mechanischen Stress und (3) photochemischen Stress (oxidative und freie Radikale-Reaktion)74. Abhängig von der Bildgebungsmodalität (z. B. konfokale Ein-Photonen- vs. Multiphotonen-Bildgebung, kontinuierliche vs. Pulsbeleuchtungsmodi, die Empfindlichkeit der Detektoren und die Leistung der Lichtquelle bei verschiedenen Wellenlängen, wenn die Anregungsabstimmung möglich ist), Zell- und Gewebetyp (z. B. gewebetypabhängige Akkumulation von effizient lichtabsorbierenden Pigmenten oder anderen Autofluoreszenzmolekülen, 3D- vs. 2D-Organisation, B. Wachstum und Zusammensetzung der Bildgebungsmedien), die Herkunft der Fluoreszenzsonde (z. B. photosensibilisierende Eigenschaften) können unterschiedliche Kombinationen von Risikofaktoren Phototoxizität während der Bildgebung hervorrufen. Selbst wenn nach der Beleuchtung keine Zunahme des Zelltods beobachtet wird, können lichtleistungsabhängige frühere Auswirkungen vor dem Tod auf die Mitochondrien und den Stoffwechsel möglicherweise die Analyse und Interpretation des Experiments beeinträchtigen55.
Um den phototoxischen Einfluss auf die experimentellen Ergebnisse auszuschließen, sollte der Forscher eine allgemeine Überwachung der Zellviabilität und Veränderungen der Zellmorphologie im Vergleich zur intakten Kontrolle durchführen oder Zelltodsonden verwenden, um den Anstieg der Zelltodrate nach Beleuchtung abzuschätzen. Wenn die metabolischen Experimente durchgeführt werden, sollte die Optimierung der bildgebenden Parameter entsprechend in den Pilotversuchen erfolgen, um den Einfluss der Bildgebung auf die gemessenen Stoffwechselparameter abzuschätzen und zu minimieren. Bei sauerstoffempfindlichen Sonden kann die Lichtüberdosierung leicht durch eine plötzliche Erhöhung der Phosphoreszenzlebensdauer und -intensität desO2-empfindlichen Farbstoffs (entsprechende Änderungen des Intensitätsverhältnisses der Referenz zum O2-empfindlichen Farbstoff) aufgrund des sogenannten "photoinduziertenO2-Verbrauchs" verfolgt werden 53,75. Dies kann leicht durch kinetische Kurvenanalyse von Zeitrafferexperimenten mit unterschiedlichen Lichtleistungsparametern erfolgen, z. B. unter Verwendung des folgenden veröffentlichten Protokolls25. Zur "Verteidigung" der Pulsbeleuchtung (z. B. in der TCSPC-F(P)LIM Mikroskopie gezeigt) zeigten die jüngsten Studien ihren minimalen Einfluss auf die ROS-Produktion und das Sonden-Photobleaching im Vergleich zu stationären Beleuchtungsmessungen76,77, was auf einen zusätzlichen Vorteil von TCSPC-FLIM gegenüber herkömmlichen intensitätsbasierten Bildgebungsansätzen hinweist.
Die Haupteinschränkung der vorgestellten Methoden zur Sphäroidbildung liegt in direkten und langfristigen Überwachungsanwendungen. Die Agarose-Formen erfordern aufgrund der dicken Agaroseschicht ein Objektiv mit großem Arbeitsabstand (oder ein zusätzliches aufrechtes Mikroskop oder Fluoreszenz-Stereomikroskop) und das Material der 5D-Sphärizette kann Messungen in roten Fluoreszenzkanälen (O 2-Sonde) beeinträchtigen. Die mit Hochdurchsatzverfahren erzeugte Sphäroidgröße ist durch den Mikrotiterdurchmesser begrenzt und erfordert einen häufigen Medienwechsel, um eine Erschöpfung und Versauerung des Mediums zu vermeiden. Mit all diesen Einschränkungen empfehlen wir die 3D-Petrischalen (Mikrogewebe) für Experimente, die einen hohen Durchsatz (z. B. für 3D-Bioprinting-Anwendungen) und Methoden mit geringer Bindung für Grundlagenstudien mit "mittlerem Durchsatz" erfordern, die auch eine geringere Zellzahl erfordern.
Die Überwachung der ratiometrischen Oxygenierung und konventionelle Mikroskopieexperimente auf der Basis von Lebendzellfluoreszenzfarbstoffen sind auf weit verbreiteten inversen Mikroskopen erschwinglich, wenn sie mit einer Nahinfrarot-empfindlichen (NIR)-empfindlichen Kamera, einer auf Leuchtdioden (LED) basierenden Anregung und einem geeigneten Objektivausgestattet sind 25. Für geeignetere optische Schnitte und FLIM werden handelsübliche konfokale Mikroskopsysteme (wie hier beschrieben) empfohlen. Während wir auch eine Methode zum Nachweis der NAD(P)H-Autofluoreszenz beschreiben, die ein teureres Zwei-Photonen-FLIM-Mikroskop erfordert, gibt es viele verschiedene Ansätze, die für konfokale FLIM-Systeme kompatibel und nützlich sind, die idealerweise mit Weißlichtlasern und Hybrid- oder SPAD-Detektoren ausgestattet sind. Dazu gehören die Beurteilung des Zellstoffwechsels, FRET-FLIM-Biosensorproteine, die Bildgebung der Zell- und Gewebemechanik, die Autofluoreszenz bestimmter Zell- und Gewebetypen und Rezeptor-Wirkstoff-Wechselwirkungen, die mit FLIM-FRET31 sichtbar gemacht werden.
Die vom Anbieter bereitgestellte FLIM-Erfassungs- und Analysesoftware kann den Erfolg des Experiments beeinträchtigen, da es nicht immer möglich ist, die IRF oder die Bilder in einem Format zu exportieren, das mit der nachgelagerten Open-Source-Analyse kompatibel ist. Die Nachbearbeitung ist ein wichtiger Bestandteil des FLIM-Analyse-Workflows und immer noch nicht universell standardisiert oder akzeptiert. Die Kurvenanpassung erfordert eine höhere Anzahl von Photonen und mehr Rechenleistung im Vergleich zum Phasor-Ansatz. FLIMfit45 (globales und pixelweises Fitting) und Flimview78 gehören zu den offenen Softwares, die für die Kurvenanpassungsanalyse verwendet werden, während PAM79, FLUTE64 und AlliGator80 für die Phasoranalyse verwendet werden. FLIMJ46 ist ein nützliches ImageJ-Plugin, das mit beiden Ansätzen funktioniert. Insgesamt tragen diese Optionen dazu bei, die Nachbearbeitungsroutine zu verbessern und sie schneller, vielseitiger und benutzerfreundlicher zu machen.

Mehrzellige Sphäroide stellen eine Gruppe von 3D-Gewebemodellen dar, die durch die Selbstaggregation von Zellen erhalten werden und eine kugelförmige Form aufweisen. Sie werden häufig verwendet, um Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen in vitro nachzuahmen und einen 3D-Kontext in einer Vielzahl von Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Konstrukten zu reproduzieren. Es werden verschiedene Techniken eingesetzt, um die Zelladhäsion zu reduzieren und die Aggregation zu fördern. Dazu gehören das Hanging-Drop-Verfahren, das sich auf die Oberflächenspannung1 stützt; Methoden zur Abwehr von Zellanhaftungen, wie z. B. Platten mit extrem geringer Anhaftung, Mikroformen und Mikrovertiefungen 2,3; akustischer wellenbasierter Ansatz4; strömungsinduzierte Aggregationsmethoden (Spinnerkolben, Bioreaktoren und mikrofluidische Geräte)5; magnetische partikelgestützte Bildung6 und Verwendung der aggregationsfördernden synthetischen und EZM-basierten Matrizen und Gerüste 7,8,9.
In der Krebsforschung, -entwicklung und -validierung neuer medikamentöser Therapien sind Sphäroide ein attraktives Modell, da sie in der Lage sind, die räumlich diffusionsbegrenzten Gradienten von Nährstoffen, Abfallprodukten und O2 zu rekapitulieren, was häufig zur Bildung eines nekrotischen Kerns führt, wie er für die soliden Tumoren typisch ist10,11. Diese zuverlässigeren und ausgefeilteren In-vitro-Modelle stellen die Notwendigkeit einer umfassenden Verwendung von Tiermodellen (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012) gemäß dem 3R-Prinzip der Tierversuche (Replacement, Reduction und Refinement) in Frage. Neben Krebs finden Sphäroide ihre Anwendung in der Stammzellforschung. Zum Beispiel haben pluripotente Stammzellen die Fähigkeit, Embryoidkörper (EB) zu bilden, die für die Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu spezialisierten Zelltypen verwendet werden können, die nur schwer direkt von Patienten zu gewinnen sind, wie z. B. neurale Vorläuferzellen13 oder ovarielle Granulosazellen 13,14. Darüber hinaus ist die Bildung eines EB oft der erste Schritt bei der Entwicklung komplexerer Organoidmodelle, z. B. neuronale15, retinale16, kardiale17, Leber18, Magen19 und intestinale Organoide20. Faktoren wie Größe, Reproduzierbarkeit, Durchsatz und nachgelagerte Anwendungen sollten bei der Auswahl einer geeigneten Methode zur Sphäroidbildung für die Experimente berücksichtigt werden.
Die erhöhte Komplexität der 3D-Kultur kann zu einer höheren Variabilität im Vergleich zur 2D-Kultur führen. Faktoren wie die Nährstoffzusammensetzung21, die Verdunstung des Mediums22, die Viskosität23, die pH-Kontrolle24, das Verfahren zur Sphäroidbildung und sogar die Zeit in der Kultur25,26 können dazu führen, dass Sphäroide unterschiedlicher Morphologie, Größe, Lebensfähigkeit und unterschiedlicher Chemoresistenz erhaltenwerden 27,28. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass sphäroide Sauerstoffgradienten nicht immer statisch sind und von der Bildungsmethode, der Sphäroidgröße und der extrazellulären Viskosität beeinflusst werden, was sich auf die Sphäroidheterogenität auswirkt29. Um die Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit von Daten zu Sphäroiden zu verbessern, wurde die MISpheroID-Wissensdatenbank26 entwickelt, in der die Zelllinie, das Kulturmedium, die Bildungsmethode und die Größe der Sphäroide als minimale Informationen für ein reproduzierbares Ergebnis identifiziert werden. Aus diesem Grund wurde ein detaillierter Vergleich mehrerer Methoden mit hohem Durchsatz (SphericalPlate 5D, im Labor hergestellte Mikroformen und Mikrogewebeformen) und Methoden mit geringer Befestigung (d. h. Biofloat- und Lipidure-beschichtete 96-Well-Platten, sowohl gerüstfrei als auch gerüstbasiert) durchgeführt (Abbildung 1 und Tabelle 1), einschließlich der Well-Größe (bei einer Schätzung der maximalen Sphäroidgröße), der verwendeten Verbrauchsmaterialien, der Vorbereitungszeit und der Möglichkeit, Sphäroide zu überwachen, ohne sie in Mikroskopieschalen zu transportieren. Letzteres ermöglicht Langzeitstudien, während Sphäroide, die mit Hochdurchsatzmethoden hergestellt werden, oft zu Endpunktexperimenten führen. Alle Methoden mit Ausnahme der Gitter der 5DspheriPlate bringen keine unerwünschte Autofluoreszenz mit sich, was ihren direkten Einsatz in der Mikroskopie ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Abbildung 1: Erläuterung der Methoden zur Sphäroidbildung. Hochdurchsatzverfahren wie die SphericalPlate 5D, bei der patentierte Mikrowells in die Platte integriert sind, während die im Labor hergestellten Mikroformen und die MicroTissue-Formen Stempel verwenden, um mehrere Mikrowells in Agarose (blau) herzustellen. Platten mit geringer Bindung wie Lipidure (Amsbio) und Biofloat (Sarstedt) verwenden eine nicht haftende Beschichtung, die die Adhäsion der Zelloberfläche hemmt und die Selbstaggregation der Zellen fördert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Selbst hergestellte Mikroformen</td>
			<td>Mikrogewebe</td>
			<td>Methoden mit geringer Befestigung</td>
		</tr><tr><td>Anzahl der Sphäroide/Vertiefung</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Durchmesser gut</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr><tr><td>Kulturvolumen</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Sonstige Verbrauchsmaterialien</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL 3% Agarose</td>
			<td>500 μL 2 % Agarose</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Zubereitungszeit</td>
			<td>ca. 10 Minuten</td>
			<td>2 h + 3 Tage Medienadaption</td>
			<td>0,5 h + 15 min Medienadaption</td>
			<td>10–30 min + 1 h Trocknung</td>
		</tr><tr><td>Überwachung</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nein**</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr><tr><td>Autofluoreszierend</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nein</td>
			<td>Nein</td>
			<td>Nein</td>
		</tr><tr><td>Mehrweg</td>
			<td>Nein</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Nein**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Kosten</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Beschichtung und Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Kommerzielle 96-Well-Platte</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Einige Zelllinien benötigen eine Zugabe von EZM (d. h. 2 % bis 5 % Matrigel), um kompakte Sphäroide zu bilden.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Die Beschichtung ist wiederverwendbar, bis sie aufgebraucht ist. Jede Platte verbraucht jedoch eine kleine Menge an Medien und Staub kann sich im Laufe der Zeit ansammeln. Eine Filtersterilisation ist regelmäßig erforderlich.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Vergleich mehrerer Methoden zur Sphäroidbildung29. "Monitoring": die Möglichkeit, das Sphäroid zu überwachen, ohne dass es zu einer Übertragung in eine Mikroskopieschüssel kommen muss. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Überwachung der wichtigsten biologischen Aspekte in Sphäroiden, einschließlich Zelltod, Lebensfähigkeit, Proliferation, Stoffwechsel, Viskosität und sogar mechanischer Eigenschaften30. Die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) bietet eine zusätzliche quantitative Dimension für die Untersuchung der Wechselwirkungen von Fluoreszenzsonden in ihrer (Mikro-)Umgebung 31,32,33,34 und ermöglicht die Auflösung der überlappenden Emissionsspektren entsprechend unterschiedlicher Emissionslebensdauern35,36 und Untersuchung des Zellstoffwechsels auf der Grundlage der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz. So können so weit verbreitete zelluläre autofluoreszierende Verbindungen wie Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NAD(P)H), Flavin-Mononukleotid (FMN), Flavinadenin-Dinukleotid (FAD), Protoporphyrin IX und andere mit Ein- und Zwei-Photonen-FLIM gemessen werden und dienen als intrinsische "Sensoren" des Glukoseabbaus, der oxidativen Phosphorylierung (OxPhos) und bieten einen allgemeinen Überblick über den Redoxzustand der Zelle. NAD(P)H liegt in freier zytoplasmatischer oder in proteingebundener mitochondrialer Form vor37,38. In ähnlicher Weise ist der oxidierte Zustand von FAD fluoreszierend mit einer längeren Lebensdauer der freien Form. NAD(P)H- und FAD-Mikroskopie wird in der Regel mit Zwei-Photonen-angeregtem FLIM durchgeführt, um Photoschäden an der Probe zu verhindern39. Häufig kann die "optische metabolische Bildgebung" FLIM mit der Verwendung von farbstoffbasierten Sonden, genetisch kodierten Biosensoren, Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (PLIM) und ratiometrischen intensitätsbasierten Messungen kombiniert werden, um ein vollständigeres Bild des Sphäroid- oder Organoidstoffwechsels, der Sauerstoffversorgung, der Proliferation und der Zellviabilität zu erhalten 29,30,31. Darüber hinaus kann FLIM auch mit der Förster-Resonanzenergietransfer-Methode (FRET) kombiniert werden, um die Lebensdauervariation des Donorfluorophors zu messen, wenn es in engem Kontakt mit dem Akzeptor steht, um die Bindung eines Wirkstoffs an seine Zieldomäne 33,40,41 zu untersuchen.
Die erfassten FLIM-Bilder werden in der Regel analysiert, um die Lebensdauer Pixel für Pixel zu berechnen. Derzeit gibt es mindestens 3 gängige Strategien, um die Fluoreszenzlebensdauer zu erhalten: semiquantitatives "schnelles FLIM"42 (manchmal auch als "Tau-Sinn" bezeichnet43,44), Zerfallskurvenanpassung unter Verwendung von ein-, zwei- oder dreiexponentieller Anpassung und "anpassungsfreier" Ansatz mit Phasortransformation und Phasorplot-Analyse. Je nach Anbieter kann entweder die bereitgestellte (LAS X, Symphotime, SPCImage usw.) oder Open-Source-Software (z. B. FLIMfit45, FLIMJ46 oder andere47) verwendet werden, um gemessene FLIM-Daten zu verarbeiten. In der Regel ist vom Anbieter bereitgestellte Software für die vorläufige Datenanalyse nützlich, während Open-Source-Lösungen genauere Studien ermöglichen können, z. B. mit Hilfe von Phasordiagrammen und 3D-Visualisierung.
Trotz der Nützlichkeit und Attraktivität von FLIM als Methode zur Untersuchung von Sphäroiden stehen nur sehr wenige experimentelle Protokolle zur Verfügung, und es besteht ein allgemeiner Mangel an Wissen über die Auswahl der am besten geeigneten Bildungsmethode für erfolgreiche multiparametrische Live-Mikroskopie-Experimente mit FLIM. In dieser Arbeit wird ein detaillierter Vergleich der häufig verwendeten Sphäroidbildungsprotokolle auf der Grundlage ihrer Morphologie, Viabilität und Oxygenierung mit dem kürzlich validierten und charakterisierten Sauerstoffsensor-Nanosensor (MMIR1) für Fernrot und Nahinfrarot (NIR) vorgestellt. Das kationische Nanopartikel ist mit zwei Reporterfarbstoffen imprägniert, dem Referenz-O 2-unempfindlichen aza-BODIPY (Anregung 650 nm, Emission 675 nm) und dem NIR O2-empfindlichen Metalloporphyrin, PtTPTBPF (Anregung 620 nm, Emission 760 nm). Das MMIR1 ermöglicht die Echtzeitanalyse von Sauerstoffgradienten mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop (mittels ratiometrischer Analyse) oder einem Phosphoreszenz-Lebensdauermikroskop (PLIM) ohne zelluläre Toxizität und ermöglicht stabile Signale, Langzeitüberwachung und Multiplexing25,29. Abhängig von der Notwendigkeit, mit Farbstoffen oder Nanosensoren zu färben, dem Sphäroiddurchsatz oder dem Zelltyp kann das am besten geeignete Bildungsprotokoll ausgewählt werden. Da die Studien zur Lebensfähigkeit und Sauerstoffversorgung von Sphäroiden für Studien zu Krebs und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden relevant sind, enthalten die vorgestellten Protokolle auch Beispiele und erwartete typische Ergebnisse von NAD(P)H-FLIM und FAD-FLIM mit diesen Modellen. Die vorgestellten Bildgebungs- und Analysepipelines zielen auf die gängigsten zeitkorrelierten FLIM-Mikroskopieplattformen ab, die auf Einzelphotonenzählung basieren.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Auch von Sigma</td></tr><tr><td>10 mL serologischen Pipetten</td><td>erhältlich VWR</td><td>612-3700</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatten, steril</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning und anderen Unternehmen erhältlich.</td></tr><tr><td>12 Well Chamber Slide, abnehmbar</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Auch erhältlich bei Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific und anderen</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Firmen erhältlich</td></tr><tr><td>3D Petrischale Mikroformen Mikrogewebe</td><td></td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Zellkulturplatten, steril</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>70%</td><td>Ethanol ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Kommerziell verfügbar beschichtete 96-Well-Platte für die Sphäroidbildung</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>In Verdünnung 1:1000 auftragen</td></tr><tr><td>CellSens Dimension Software</td><td>Olympus</td><td>Version 3</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen aus menschlicher Plazenta, Typ IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Zur Aufbereitung von 0,07 mg/mL Kollagen und 0,03 mg/mL Poly-D-Lysin beschichtete Mikroskopieschalen</td></tr><tr><td>Konfokales FLIM-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falcon inverses Mikroskop mit Weißlichtlaser, HyD X Detektoren, Klima / T Kontrollkammer (OkoLab), 25x/0,95 W Objektiv</td></tr><tr><td>D(+)-Glukose</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Präparation 1 M Stammlösung, 1:100 zur Aufbereitung des Bildgebungsmediums (Endkonzentration 10 mM)</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), phenolrot-, glucose-, pyruvat- und glutaminfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Zur Herstellung des Bildgebungsmediums</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Auch bei Sigma erhältlich. Muss vor Gebrauch wärmeinaktiviert werden.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Verdünnung 1/100 zur Vorbereitung des Bildgebungsmediums (Endkonzentration 10 mM)</td></tr><tr><td>Menschliche Dickdarmkrebszellen HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>Version 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Auch bei Sigma erhältlich. In einer Verdünnung von 1:100 auftragen.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, Zugabe von 1 mM Natriumpyruvat und 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Standard-Wachstumsmedium für HCT116-Zellen</td></tr><tr><td>mikrostrukturierte 3D-gedruckte PDMS-Stempel</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Zur <td>Verfügung gestellt vom Zentrum für Mikrosystemtechnik, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universität Gent</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer couting</td><td>chamber Fisher Scientific</td><td>15980396 O2-Sonden</td><td></td></tr><tr><td>: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vollständige Charakterisierung, Validierung und einige Anwendungen finden Sie unter: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Lösen Sie die PBS-Tablette in 500 mL destilliertem Wasser auf.</td></tr><tr><td>Pen Strep :P Enicillin (10.000 U/ml) / Streptomycin (10.000 μm; g/mL) 100x Lösung</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Auch bei Sigma erhältlich. In einer Verdünnung von 1:100 auftragen.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Für die Herstellung von 0,07 mg/mL Kollagen und 0,03 mg/mL Poly-D-Lysin beschichtete Mikroskopieschalen</td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Zelltodfärbung, verwenden Sie 1 &micro; g/mL bei 1h Inkubation</td></tr><tr><td>PVDF-Spritzenfilter 0,22 & Mikro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Verdünnung 1/100 zur Aufbereitung von Bildgebungsmedium (Endkonzentration 1mM)</td></tr><tr><td>KugelicalPlate 5D 24-well</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>steril</td><td>Petridisch Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich.</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>Gewebekulturkolben (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, VWR und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>U-Boden 96-Well-Platte</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Ähnliche Produkte sind auch von Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one und anderen Unternehmen erhältlich</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Andere Arten von Agarose wie z.B. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (A-9414, Sigma), Agarose für den Routinegebrauch (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop IX81, mit motorisierter Z-Achsensteuerung, CoolLED pE4000 (16 Kanäle, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS-Kamera, Glaswarmhalteplatte Okolab, CellSens Dimension v.3 Software und Luftobjektive 4x/0,13 UPlanFLN und 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Optional, für hochauflösende Bildgebung) 60x/1,0 LUMPLFLN Wasser</td></tr></tbody></table>

herstellung und multiparameter-lebendzell-fluoreszenz-lebensdauer-bildgebungsmikroskopie (flim) von mehrzelligen sphäroiden

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multizelluläre Tumor-Sphäroide sind ein beliebtes 3D-Gewebe-Mikroaggregatmodell für die Reproduktion von Tumormikroumgebungen, die Erprobung und Optimierung von Arzneimitteltherapien und den Einsatz von Bio- und Nanosensoren im 3D-Kontext. Ihre einfache Produktion, ihre vorhersehbare Größe, ihr Wachstum und ihre beobachteten Nährstoff- und Metabolitengradienten sind wichtig, um die 3D-nischenartige Zellmikroumgebung zu rekapitulieren. Die Heterogenität der Sphäroide und die Variabilität ihrer Produktionsmethoden können jedoch den gesamten Zellstoffwechsel, die Lebensfähigkeit und das Ansprechen auf das Arzneimittel beeinflussen. Dies macht es schwierig, die am besten geeignete Methodik zu wählen, wenn man die Anforderungen an Größe, Variabilität, Anforderungen an die Biofabrikation und die Verwendung als In-vitro-3D-Gewebemodelle in der Stamm- und Krebszellbiologie berücksichtigt. Insbesondere kann die Sphäroidproduktion ihre Kompatibilität mit quantitativen Lebendmikroskopien beeinflussen, wie z. B. optische metabolische Bildgebung, Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), Überwachung der Sphäroidhypoxie mit Nanosensoren oder Viabilität. Hier wird eine Reihe konventioneller Protokolle zur Sphäroidbildung vorgestellt, die ihre Kompatibilität mit der Live-Weitfeld-, Konfokal- und Zwei-Photonen-Mikroskopie hervorheben. Die Follow-up-Bildgebung zur Analysepipeline mit Multiplex-Autofluoreszenz FLIM und unter Verwendung verschiedener Krebsarten und Stammzell-Sphäroide wird ebenfalls vorgestellt.

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Hier wird ein Protokoll für die Herstellung eines sphäroiden Bildgebungsgeräts vorgestellt. Dieses Gerät ermöglicht eine dynamische oder Längsfluoreszenzbildgebung von Krebszellsphäroiden. Das Protokoll bietet auch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse der Krebszellinvasion.

Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

Das Protokoll beschreibt die Hochdurchsatz-Sphäroiderzeugung für Bioprinting unter Verwendung der multiparametrischen Analyse ihrer Oxygenierung und ihres Zelltods auf einem Standardfluoreszenzmikroskop. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Lebensfähigkeit der Sphäroide zu kontrollieren und eine Standardisierung durchzuführen, die für die Modellierung von 3D-Gewebe, Tumormikroumgebung und erfolgreicher (Mikro-) Gewebebiofabrikation wichtig ist.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Erfahren Sie Methoden zur Herstellung von mehrdimensionalen Sphäroiden für die Lebendzellmikroskopie mit FLIM. Diese Technik ermöglicht die Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung in 3D-Modellen.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

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