Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

In dieser Arbeit stellen wir Methoden zur Sphäroidbildung vor und vergleichen sie, die zur Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung mittels Lebendzellmikroskopie verwendet werden können. In den letzten Jahren wurde die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie ausgiebig eingesetzt, um metabolische Biomarker wie NADPH und FAD in lebenden Zellen zu untersuchen, und es wurden mehrere fluoreszierende Nanopartikel entwickelt, um solche Messungen mit der Bildgebung der Zell- und Gewebeoxygenierung zu multiplexen. Multizelluläre Sphäroide, Organoide und Organ-on-a-Chip können eine komplexe, in-vivo-ähnliche Mikroumgebung replizieren, wodurch der Bedarf an Tierversuchen minimiert wird.

Für die Herstellung von Sphäroiden zeigen wir verschiedene Bildungsmethoden, die von niedrigem bis hohem Durchsatz reichen können. Sie unterstreichen auch ihre optische Zugänglichkeit, die Kompatibilität mit einem Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskop und die Möglichkeit, extrazelluläre Matrixkomponenten einzubeziehen. Auch wenn 3D-In-vitro-Modelle im Vergleich zu 2D-Kulturen einen besseren Kontext bieten, bleiben ihre hohe Variabilität, geringe Reproduzierbarkeit und unvollständige experimentelle Berichterstattung ein Problem.

Parameter wie die Sphäroidgröße, die Nährstoffzusammensetzung, die extrazelluläre Viskosität und sogar Methoden zur Sphäroidbildung können zu einer erhöhten zellulären Heterogenität führen. Mit diesem Protokoll wollen wir die Methoden zur Herstellung von Sphäroiden harmonisieren und standardisieren und dabei Schlüsselaspekte hervorheben, die für die lebenskontinuierliche und multiparametrische Analyse von Sphäroiden mittels FLIM-Mikroskopie wichtig sind.