Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden
August 9th, 2024
In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.
In dieser Arbeit stellen wir Methoden zur Sphäroidbildung vor und vergleichen sie, die zur Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung mittels Lebendzellmikroskopie verwendet werden können. In den letzten Jahren wurde die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie ausgiebig eingesetzt, um metabolische Biomarker wie NADPH und FAD in lebenden Zellen zu untersuchen, und es wurden mehrere fluoreszierende Nanopartikel entwickelt, um solche Messungen mit der Bildgebung der Zell- und Gewebeoxygenierung zu multiplexen. Multizelluläre Sphäroide, Organoide und Organ-on-a-Chip können eine komplexe, in-vivo-ähnliche Mikroumgebung replizieren, wodurch der Bedarf an Tierversuchen minimiert wird.
Für die Herstellung von Sphäroiden zeigen wir verschiedene Bildungsmethoden, die von niedrigem bis hohem Durchsatz reichen können. Sie unterstreichen auch ihre optische Zugänglichkeit, die Kompatibilität mit einem Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskop und die Möglichkeit, extrazelluläre Matrixkomponenten einzubeziehen. Auch wenn 3D-In-vitro-Modelle im Vergleich zu 2D-Kulturen einen besseren Kontext bieten, bleiben ihre hohe Variabilität, geringe Reproduzierbarkeit und unvollständige experimentelle Berichterstattung ein Problem.
Parameter wie die Sphäroidgröße, die Nährstoffzusammensetzung, die extrazelluläre Viskosität und sogar Methoden zur Sphäroidbildung können zu einer erhöhten zellulären Heterogenität führen. Mit diesem Protokoll wollen wir die Methoden zur Herstellung von Sphäroiden harmonisieren und standardisieren und dabei Schlüsselaspekte hervorheben, die für die lebenskontinuierliche und multiparametrische Analyse von Sphäroiden mittels FLIM-Mikroskopie wichtig sind.
Überblick
Dieser Artikel stellt verschiedene Methoden zur Bildung mehrzelliger Sphäroide zur Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung mittels Live-Zellmikroskopie vor. Die Studie hebt die Verwendung der Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zur Untersuchung von metabolischen Biomarkern in lebenden Zellen hervor.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Live-Zell-Bildgebung
Hintergrund
- Mehrzellige Sphäroide und Organoide replizieren in-vivo-ähnliche Mikroumgebungen.
- Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebungsmikroskopie wird zur Untersuchung von metabolischen Biomarkern verwendet.
- Hohe Variabilität und geringe Reproduzierbarkeit sind Herausforderungen in 3D-In-vitro-Modellen.
- Verschiedene Sphäroidbildungsmethoden können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden.
Zweck der Studie
- Um Sphäroidbildungsmethoden für die Live-Zellmikroskopie zu vergleichen.
- Um Zellstoffwechsel, Hypoxie und Zelltod in 3D-Modellen zu analysieren.
- Um das Verständnis der Sauerstoffverteilung in mehrzelligen Systemen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebungsmikroskopie (FLIM)
- Zelluläre Autofluoreszenzanalyse
- Verwendung von Färbefarbstoffen und fluoreszierenden Nanopartikeln
- Verschiedene Sphäroidbildungstechniken
Hauptergebnisse
- Demonstrierte Methoden zur Analyse des Zellstoffwechsels in 3D-Sphäroden.
- Zeigte die Kompatibilität von Sphäroiden mit FLIM für metabolische Studien.
- Hob die Bedeutung von extrazellulären Matrixkomponenten bei der Sphäroidbildung hervor.
- Adressierte Herausforderungen bei der Reproduzierbarkeit und Variabilität von 3D-Kulturen.
Schlussfolgerungen
- Verschiedene Sphäroidbildungsmethoden können die Live-Zellanalyse verbessern.
- FLIM liefert wertvolle Einblicke in metabolische Prozesse in 3D-Modellen.
- Die kontinuierliche Entwicklung dieser Methoden kann die Abhängigkeit von Tiermodellen reduzieren.
Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
