Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in Xenopus tropicalis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Gefäßsystem von Xenopus tropicalis-Kaulquappen sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der kardiovaskulären Biologie zu beantworten, z. B. wie die Angiogenese reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Blutgefäße in einem Embryo vom intakten Well-Typ durch eine einfache Fluoreszenzfarbstoffinjektion sichtbar gemacht werden können.

Beginnen Sie mit der Verwendung eines Mikroladers, um eine konische Glasmikropipette mit etwa fünf Mikrolitern klarer diI-acetylierter LDL-Lösung zu füllen, und achten Sie darauf, dass keine ausgefällten Partikel geladen werden. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine feine Pinzette mit der Nummer 55, um die Spitze der Pipette zu beschneiden, um das Volumen des hochgeladenen Komplexes einzustellen, und stellen Sie das druckgesteuerte Injektionssystem so ein, dass etwa fünf Nanoliter Lösung pro Injektion ausgestoßen werden. Tauchen Sie dann die Pipettenspitze in 0,04 % MS-222 in 0,1-fach modifizierte Barth-Kochsalzlösung oder MBS in eine speziell angefertigte Sylgard-Form.

Als nächstes übertragen Sie den Xenopus tropicalis-Embryo in die Sylgard-Form und bestätigen Sie die vollständige Sedierung mit fehlender Reaktion auf die Rückenflossenstimulation. Unter dem Präpariermikroskop wird der Embryo mit der Bauchseite nach oben in die V-förmige Vertiefung der Form in einer leicht schrägen Position geladen. Stecken Sie zwei 0,1 Millimeter große Stifte fest in einen Stifthalter und stechen Sie mit einem Stift in die Haut über dem Herzen, die sichtbar pulsieren sollte.

Führen Sie den Stift durch das Loch im Raum zwischen Herz und Haut ein, ohne das Herz zu punktieren, und positionieren Sie die eingeführte Spitze in dem Bereich, in dem der Schnitt vorgenommen wird. Reiben Sie dann den zweiten Stift gegen den eingeführten Stift, um einen linearen Schnitt zu machen, und verwenden Sie beide Stifte zusammen, um den Schnitt sanft zu erweitern und das Herz freizulegen. Um die DiI-acetylierte LDL-Lösung zu injizieren, führen Sie die Glaspipettenspitze in das Herz ein und injizieren Sie 50 bis 60 Nanoliter des acetylierten DiI-LDL in etwa 10 Ausstoßimpulsen.

Wenn die gesamte Farbstofflösung abgegeben wurde, bestätigen Sie, dass das Herz noch schlägt, und übertragen Sie den Embryo in eine neue Petrischale, die 0,1X MBS enthält. Nach fünf bis 10 Minuten sollte sich die Kaulquappe von der Narkose erholen und sich zu bewegen beginnen. Nachdem eine angemessene Anzahl von Embryonen injiziert wurde, untersuchen Sie die korrekt markierten anästhesierten Embryonen visuell unter einem Fluoreszenzmikroskop und verwerfen Sie alle Tiere, bei denen andere Organe markiert sind.

Embryonen, die unzureichend markiert wurden, können erneut injiziert werden. Nehmen Sie dann Bilder der korrekt gekennzeichneten Embryonen auf. Für eine gründlichere Bildgebung der Blutgefäße fixieren Sie re-anästhesierte Embryonen eine Stunde lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt und zur Visualisierung durch konfokale Mikroskopie.

Wenn eine ausreichende Menge acetyliertes DiI-LDL in das Herz injiziert wird, sollte die hintere Kardinalvene (PCV) unter einem Fluoreszenzmikroskop sofort sichtbar sein. Die intersomitischen Venen (ISVs) treten dorsal aus dem PCV in einer vorderen bis hinteren Welle aus, die im Stadium 36 beginnt und um das Stadium 40 bis 41 endet und um das Stadium 43 herum leicht verzweigt wird. Die PCVs und ISVs wachsen in einem stereotypen angiogenen Muster, das unter strenger Entwicklungskontrolle steht.

Interessanterweise verringert der Knockdown des TIE-2-Signalwegs durch Antisense-Morphalinos die Länge und Komplexität der ISVs, während die Expression der konstitutiv aktiven Form von TIE-2 eine übermäßige ISV-Verzweigung induziert. Es kann ein Venenkomplexitätsindex berechnet werden, um die Komplexität der ISVs zu bewerten, und es können gerenderte Pfade generiert werden, um die Gesamtarchitektur des embryonalen Xenopus tropicalis-Gefäßsystems zu visualisieren. Das ursprüngliche Protokoll wurde von Levin und Colics für die Verwendung von Xenopus laevis beschrieben und für Xenopus tropicalis angepasst.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vor diesem Eingriff können genetische und pharmakologische Manipulationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene und Signalwege die Gefäßentwicklung regulieren. Mit diesem Verfahren kann das markierte Gefäßsystem in Echtzeit in einem intakten Tier abgebildet werden, was ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der Gefäßentwicklung darstellt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diI-acetyliertes LDL in das Herz einer Xenopus tropicalis-Kaulquappe injiziert, um ihr Gefäßsystem zu visualisieren.