Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in
25. Mai 2017
Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Gefäße von Xenopus tropicalis-Kaulquappen sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Biologie zu beantworten, beispielsweise wie die Angiogenese reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Blutgefäße in einem intakten, wildtypischen Embryo durch eine einfache Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs sichtbar gemacht werden können.
Beginnen Sie damit, mit einem Mikrolader etwa fünf Mikroliter einer klaren diI-azetylierten LDL-Lösung in eine konisch zulaufende Glas-Mikropipette zu füllen, wobei darauf geachtet werden sollte, dass keine präzipitierten Partikel aufgenommen werden. Benutzen Sie unter einem Stereomikroskop ein feines Paar Nr. 55 Pinzette, um die Spitze der Pipette abzuschneiden, um das Volumen des aufgenommenen Komplexes anzupassen, und stellen Sie das druckgesteuerte Injektionssystem so ein, dass etwa fünf Nanoliter Lösung pro Injektion ausgestoßen werden. Tauchen Sie anschließend die Pipettenspitze in 0,04 % MS-222 in 0,1X modifizierter Barth-Lösung (MBS) in einer speziell angefertigten Sylgard-Form ein.
Überführen Sie danach den Xenopus tropicalis-Embryo in die Sylgard-Form und überprüfen Sie die vollständige Sedierung durch das Fehlen einer Reaktion auf eine Stimulation der Rückenflosse. Laden Sie unter dem Stereomikroskop den Embryo mit der Bauchseite nach oben in die V-förmige Aussparung der Form in leicht schräger Position. Passen Sie zwei 0,1 Millimeter große Minutiennadeln fest in einen Nadelhalter ein und verwenden Sie eine Nadel, um die Haut über dem Herzen zu durchstechen, das sichtbar pulsieren sollte.
Führen Sie den Stift durch das Loch im Zwischenraum zwischen Herz und Haut ein, ohne das Herz zu verletzen, und positionieren Sie die eingeführte Spitze im Bereich, in dem der Einschnitt vorgenommen wird. Reiben Sie anschließend den zweiten Stift gegen den eingeführten Stift, um einen linearen Einschnitt zu erzeugen, und verwenden Sie beide Stifte gemeinsam, um den Einschnitt vorsichtig zu erweitern, wodurch das Herz freigelegt wird. Um die DiI-azetylierte LDL-Lösung zu injizieren, führen Sie die Glaspipettenspitze in das Herz ein und injizieren 50 bis 60 Nanoliter der DiI-azetylierten LDL-Lösung in etwa 10 Ausstoßimpulsen.
Wenn die gesamte Farbstofflösung verabreicht wurde, überprüfen Sie, ob das Herz noch schlägt, und überführen Sie das Embryo in eine neue Petrischale, die 0,1X MBS enthält. Nach fünf bis zehn Minuten sollte sich der Froschlaich von der Anästhesie erholen und sich zu bewegen beginnen. Nachdem eine geeignete Anzahl von Embryonen injiziert wurde, untersuchen Sie die korrekt markierten, anesthetisierten Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop und entsorgen Sie Tiere, bei denen andere Organe markiert sind.
Embryonen, die unzureichend markiert wurden, können erneut injiziert werden. Danach Bilder der korrekt markierten Embryonen aufnehmen. Für eine gründlichere Abbildung der Blutgefäße fixieren Sie reanesthetisierte Embryonen zur Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, in 4 % Paraformaldehyd.
Wenn eine ausreichende Menge an diI-azetyliertem LDL in das Herz, die hintere Kardinalvene oder PCV injiziert wird, sollte diese unter dem Fluoreszenzmikroskop sofort sichtbar sein. Die intersomitischen Venen, oder ISV, treten dorsal aus der PCV in einer von anterior nach posterior verlaufenden Welle hervor, die ab Stadium 36 beginnt und um die Stadien 40 bis 41 endet, wobei sie um Stadium 43 leicht verzweigt werden. Die PCV und die ISV wachsen in einem stereotypen angiogenen Muster, das einer strengen entwicklungsbedingten Kontrolle unterliegt.
Interessanterweise verringert die Herunterregulation der TIE-2-Signalübertragung durch Antisense-Morpholinos die Länge und Komplexität der ISVs, während die Expression der konstitutiv aktiven Form von TIE-2 eine übermäßige Verzweigung der ISVs induziert. Ein Index zur Beurteilung der Venenkomplexität kann berechnet werden, um die Komplexität der ISVs zu quantifizieren, und gerenderte Pfade können erzeugt werden, um die Gesamtarchitektur des embryonalen vaskulären Systems von Xenopus tropicalis zu visualisieren. Die ursprüngliche Protokollbeschreibung wurde von Levin und Colics für Xenopus laevis veröffentlicht, und wir haben es für Xenopus tropicalis angepasst.
Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Vor diesem Verfahren können genetische und pharmakologische Eingriffe vorgenommen werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Gene und Signalwege die Gefäßentwicklung regulieren. Mithilfe dieses Verfahrens kann die markierte Gefäßstruktur in einem intakten Tier in Echtzeit abgebildet werden, was ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der Gefäßentwicklung darstellt.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diI-azetyliertes LDL in das Herz eines Xenopus tropicalis-Kaulquappen injiziert, um dessen Gefäßsystem sichtbar zu machen.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert eine fluoreszenzbasierte Methode, um die Gefäßversorgung in Xenopus tropicalis sichtbar zu machen und ihre Komplexität zu quantifizieren. Die Technik ermöglicht die Abbildung von Blutgefäßen kurz nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das Herz des Embryos und erleichtert damit in-vivo-Untersuchungen zur kardiovaskulären Entwicklung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiovaskuläre Biologie
- Angiogenese
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Xenopus tropicalis ist ein Modellorganismus zur Untersuchung der Wirbeltierentwicklung.
- Das Verständnis der vaskulären Entwicklung ist entscheidend für Erkenntnisse über verschiedene Krankheiten.
- Fluoreszenzbildgebungsverfahren verbessern die Visualisierung biologischer Strukturen.
- Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung vaskulärer Veränderungen.
Zweck der Studie
- Die Visualisierung der Gefäßstruktur von Xenopus tropicalis-Kaulquappen.
- Die Untersuchung der Regulation der Angiogenese.
- Die Bereitstellung einer einfachen und effektiven Methode zur Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung.
Verwendete Methoden
- Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das Herz des Embryos.
- Verwendung eines Mikroladers und einer konisch zugeschliffenen Glas-Mikropipette für eine präzise Farbstoffapplikation.
- Sichtbarmachung der Blutgefäße mittels eines Stereomikroskops.
- Anwendung genetischer und pharmakologischer Manipulationen, um deren Auswirkungen auf das Gefäßsystem zu untersuchen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Blutgefäße in intakten Embryonen.
- Quantifizierung der vaskulären Komplexität mittels Bildgebung.
- Erkenntnisse über die Dynamik der kardiovaskulären Entwicklung gewonnen.
- Nachgewiesene Wirksamkeit der Methode zur Injektion fluoreszierender Farbstoffe.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung.
- Die fluoreszenzbasierte Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Echtzeitanalyse.
- Dieser Ansatz kann weitere Forschungen zur kardiovaskulären Biologie erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung der vaskulären Komplexität in einem Wirbeltiermodell und unterstützt so die Validierung von Zielstrukturen in frühen Stadien der Angiogenesewege. Durch die Bereitstellung quantitativer Messgrößen für die Aussprossung und Verzweigung von Gefäßen erleichtert sie die mechanistische Absicherung vaskulärer Zielstrukturen, bevor man sich auf Lead-Identifizierungskampagnen festlegt. Das Xenopus tropicalis-System bietet eine krankheitsrelevante Plattform zur Beurteilung angiogener Phänotypen mit vorhersagender Zuverlässigkeit in der präklinischen kardiovaskulären Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich angiogener Regulatoren wie der TIE-2-Signalübertragung durch direkte Beobachtung von Gefäßaussprossungsmustern.
- Operationaler Wert: Bietet einen schnellen, einwöchigen Arbeitsablauf zur Beurteilung des Einflusses von Genen oder Signalwegen auf die vaskuläre Entwicklung, ohne auf genetisch modellierte Systeme angewiesen zu sein.
- Prädiktiver Wert: Quantifizierbare Ergebnisgrößen wie der Venenkomplexitätsindex unterstützen die objektive Bewertung von Wirkstoffmodulationseffekten für Entscheidungen zur Portfolio-Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Gefäßmarkierungen, die mit nachgeschalteten Bildgebungs- und Analyse-Pipelines kompatibel sind.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Länge der Intersegmentalvenen und der Verzweigungskomplexität als dosisabhängige Endpunkte für die Wirkstoffscreening.
- Skalierbarkeit: Ein einfaches Farbstoffinjektions- und Bildverfahren ermöglicht die mittelhochdurchsatzfähige Bewertung pharmakologischer oder genetischer Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert stereotypische Angiogenese in Xenopus tropicalis und liefert Einblicke in menschliche Gefäßentwicklungswege.
- Translationale Kontinuität: Verbindet frühe Entdeckungsergebnisse mit präklinischer Validierung über konservierte angiogenetische Mechanismen.
- Mechanistische Ent风险reduktion: Ermöglicht schnelle Tests von Weginhibitoren oder -aktivatoren, um die Zielbiologie zu klären, bevor in Studien an Säugetiermodellen investiert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und liefert Daten zu vaskulären Phänotypen, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in auf Angiogenese ausgerichteten Programmen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit quantifizierbaren Veränderungen der vaskulären Architektur verknüpft werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare, bildbasierte Endpunkte, die zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die angiogene Ausbildung von Gefäßaussprossungen geeignet sind.
- Analytik: Bietet quantitative Metriken zur vaskulären Komplexität, die einen objektiven Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Nutzt konservierte Mechanismen der Angiogenese, um die Übertragbarkeit von embryonalen Modellen auf mammale vaskuläre Systeme zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur vaskulären Phänotypisierung, die in mehreren Projekten mit Angiogenese-Zielen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung angiogener Zielstrukturen durch direkte, quantitative Visualisierung vaskulärer Netzwerke.
- Operationaler Wert: Standardisiert die vaskuläre Beurteilung mittels einfacher Farbstoffinjektion und reproduzierbarer Bildgebung und minimiert so die Variabilität zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitiges Risikominimierung bei vaskulären Zielstrukturen ermöglicht wird, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in fortgeschrittenen kardiovaskulären Programmen sinkt.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Angiogenese-Modulatoren basierend auf quantitativen phänotypischen Ergebnissen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischen Techniken für das Handling von Embryonen und die mikrochirurgische Herzeinspritzung.
- Setzt eine Infrastruktur für Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der Gefäße und zur Bildaufnahme voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Embryonalstadien und des Zeitpunkts der Injektion für eine konsistente Markierung des Gefäßsystems.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Ergebnisse auf andere Modellsysteme oder Kontexte mit Bezug zum Menschen übertragen werden sollen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Abhängigkeit von der Zugänglichkeit der Embryonen und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Optimierung der Farbstoffkonzentration, um unspezifische Markierungen zu vermeiden.
