Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine effizient aus der menschlichen Mitralklappe zu extrahieren, die für die proteomische Analyse geeignet sind. Diese Methode kann möglicherweise dazu beitragen, pathogene Mechanismen im Bereich der Herzklappenerkrankungen aufzudecken und neue diagnostische und prognostische Krankheitsmarker und hoffentlich auch therapeutische Ziele zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es einen effizienten Extraktions-Workflow bietet, der mit vielen analytischen Anwendungen kompatibel ist.

Das Ergebnis ist eine umfassendere Charakterisierung des Mitralklappenproteums des Herzens. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Mitralklappe des Schweins, die eine große Ähnlichkeit mit der menschlichen Klappe aufweist und in einem experimentellen Modell zur Bewertung der Klappenfunktion verwendet wird. Das experimentelle Vorgehen wird von Stefania Ghilardi, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt.

Um die menschliche Mitralklappe vorzubereiten, beginnen Sie mit einem explantierten Herzen, das vier bis 12 Stunden lang unter kalter Ischämie stand. Nehmen Sie in einem Reinraum das Herz aus der Transporttasche und geben Sie es in einen sterilisierten Eimer. Als nächstes überführen Sie das Herz in eine Biosicherheitswerkbank.

Schneiden Sie dort mit einem Einwegskalpell senkrecht zur Hauptachse auf Höhe des linken und rechten Ventrikels, etwa vier Zentimeter von der Spitze entfernt. Legen Sie dann das Herz auf ein steriles Tuch. Schieben Sie dann die aufsteigende Aorta und die Lungenarterie beiseite, um Zugang zum linken Vorhofdach zu erhalten.

Schneiden Sie am linken Vorhofdach mit einer Pinzette und Plektren um die linke Ohrmuschel, um die Mitralklappe freizulegen. Die Mitralklappe ist vollständig in der linken Herzkammer enthalten. Legen Sie also das große Mitralblatt und das kleine Mitralblatt frei.

Die anterolaterale und die posteromediale Kommissur definieren die Grenze des vorderen und hinteren Bereichs. Präparieren Sie nun mit einer Schere und einer nicht-traumatischen Pinzette den linken Vorhof und die Ventrikelwanddicke, die die Mitralklappe umgibt. Identifizieren Sie während dieser Dissektion die Kontinuität der Mitralaortenklappe.

Trennen Sie als Nächstes das vordere Mitralklappensegel vom hinteren Mitralklappensegel, indem Sie entlang der Kommissuren schneiden, die das hintere Segel begrenzen. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, desinfizieren Sie den Tisch des Schranks mit einer 70%igen Isopropylalkohollösung und einer 6%igen Wasserstoffperoxidlösung. Waschen Sie nun das hintere Segel der Mitralklappe in Kochsalzlösung.

Schneiden Sie dann das Ventil in kleine Stücke, die jeweils weniger als einen Quadratzentimeter groß sind. Wickeln Sie die Stücke einzeln in Alufolie ein und frieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff ein. Um mit der Proteinextraktion zu beginnen, entnehmen Sie mit einer Pinzette eine Probe aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort auf Trockeneis.

Lassen Sie die Probe nicht auftauen. Geben Sie dann den Mörser, die zugehörigen Stößel und die Probe in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Dewarwarkolben. Es ist wichtig, dass der flüssige Stickstoff zum Einfrieren der Probe und zum Kühlen des Mahlsystems verwendet wird.

Dieser Schritt verhindert den biologischen Abbau und ermöglicht ein effizientes Pulverisieren, erfordert jedoch eine technische Schulung für eine sichere Handhabung. Sobald sie schockgefroren sind, geben Sie den Mörser und die Stößel in eine Styroporbox mit Trockeneis. Lege auch einen Spatel auf das Trockeneis.

Entfernen Sie anschließend die Probe von der Folie und laden Sie sie in den Mörser. Und positionieren Sie den größeren Stößel darüber. Drehen Sie den Stößel mit einem Schraubendreher und mahlen Sie die Probe 15 bis 20 Mal.

Mischen Sie die Probe während des Schleifens mit der Spitze eines gekühlten Spatels. Nachdem Sie den großen Stößel verwendet haben, wiederholen Sie den Mahlvorgang mit einem kleineren Stößel. Die Gewinnung eines feinen Pulvers ist entscheidend für eine effiziente Proteinextraktion.

Kippen Sie nun die pulverisierte Probe in ein 15-Millileter-Zentrifugenröhrchen mit bekannter Masse. Bürsten Sie dann das restliche Material mit einem kalten Spachtel in den Mörtel. Bewahren Sie das Röhrchen mit der Probe auf Trockeneis auf und bestimmen Sie schnell die Masse der Probe.

Kippen Sie anschließend die Probe in ein Homogenisatorröhrchen aus Glas. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Harnstoffpuffer pro 10 Milligramm Probe hinzu. Dabei werden die im Röhrchen verbliebenen Rückstände zurückgewonnen, indem sie mit dem Harnstoffpuffer aliquot ausgespült werden.

Homogenisieren Sie nun die Probe mit einem motorisierten PFTE-Stößel mit 1.500 U/min. Drücken Sie den Stößel langsam mit einer Drehbewegung 10 Mal auf die Probe. Übertragen Sie anschließend den viskosen gelben Überstand mit einer Glaspipette in ein sauberes 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie nun die Homogenisierung an der restlichen Probe mit halb so viel Harnstoff. Stellen Sie den Überstand her und kombinieren Sie ihn mit der vorherigen Sammlung. Legen Sie dann den Schlauch für 30 Minuten auf einen Schlauchrotator.

Nach 30 Minuten wird das Röhrchen in eine kalte Zentrifuge geladen und die Probe eine halbe Stunde lang bei 13.000 g heruntergeschleudert. Dann bergen Sie den Überstand. Und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Protein-Assay.

Nach Durchführung des vorgeschriebenen Protokolls wurde der Proteinextrakt nach einigen zusätzlichen Behandlungen mit einer Vielzahl von Methoden untersucht. Insgesamt wurden 422 Proteine im Mitralklappengewebe durch zweidimensionale Elektrophorese, isoelektrische Flüssigphasenfokussierung, Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie und 2D-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie identifiziert. Die 422 Proteine wurden mit Hilfe der Gen-Ontologie-Analyse klassifiziert.

Die extrazellulären Regionen enthielten mehrere erwartete Proteine und andere intrazelluläre und Zelloberflächenproteine. Viele von ihnen wurden zum ersten Mal bei Mitralklappen identifiziert. Das Vorhandensein von vier solcher Proteine, die zuvor nicht in Mitralklappen identifiziert wurden, wurde mit Antikörpern in drei einzigartigen Proben bestätigt.

Bei den Proteinen handelt es sich um Septin-11, viereinhalb LIM-Domänen, Protein eins, Dermatoponin und alphakristallines B. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine aus der Mitralklappe extrahiert werden, um sie zu identifizieren und zu quantifizieren. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll bei richtiger Durchführung in fast zwei Stunden durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die Proben während des Transfers nicht auftauen, um die größte Ausbeute an Proteinen mit hoher Proteinintegrität zu erzielen.