Name: Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Polysomen-Profilierung zur Analyse der dynamischen Proteinsynthese am isolierten Mäuseherz. Diese Methode untersucht mRNAs, miRNAs und das Polysomen-Proteom während kardialer Stressantworten.

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NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Frauen-Herz-Zentrum (RAG, JVE), Dorothy und E. Phillip Lyon Stuhl in Molekulare Kardiologie (RAG), Erika Glazer Stiftungslehrstuhl im Herzgesundheit der Frau (JVE) und Tschechische Akademie der Wissenschaften Institutionelle Unterstützung RVO: 68081715 (MS).

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<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Polysome Profilanalyse ermöglicht die Untersuchung von Protein-Übersetzung durch die Analyse von translationalen Bundesstaat eine spezifische mRNA oder die ganze Transkriptom-6,-7. Es ist auch eine große Hilfe, wenn lokale Übersetzung werden, wie z. B. Synaptosomes8 untersucht muss. Diese Methode umfasst traditionell die Trennung von Mono - und Polyribosomes und die damit verbundenen mRNAs auf einer Saccharose-Steigung welche mit genomisch...

Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.
Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>für die Euthanasie</td></tr><tr><td>Heparin-Agent</td><td></td><td>103424</td><td>in Langendorff-Präparationszangen verwendet</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>zum Aufhängen des Herzens</td></tr><tr><td>Langendorff-System</td><td>Radnoti + hausgemacht</td><td>n/a</td><td>Ein 'Vier-Herz'-System bestehend aus speziell mundgeblasenem Glas, Schläuchen und Wasserbädern</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Sigma S7653-5KG</td><td>Krebs Puffer und Saccharose</td></tr><tr><td>Gradient KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Krebs Puffer und Lyse Puffer</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Krebs</td></tr><tr><td>Puffer MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Krebs</td></tr><tr><td>Puffer Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Krebs-Puffer</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Krebspuffer</td></tr><tr><td>Saccharosepulver</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Saccharosegradient</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Saccharosegradient und Lysepuffer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Saccharosegradient und Lysepuffer</td></tr><tr><td>Xylolcyanol</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Saccharosegradient</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Saccharosegradient und Lysepuffer</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>RNAse-Inhibitor für Lysepuffer</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktailtabletten, EDTA-frei</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen, dünnwandig, ultraklar, 13,2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Schar</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultrazentrifugation der Gradienten</td></tr><tr><td>Rotor</td><td></td><td>Beckman SW41</td><td>Ultrazentrifugation der Gradienten</td></tr><tr><td>Biologic LP (Pumpe)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fraktionierung der Gradienten</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fraktionierung der Gradienten</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL Röhrchen</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Gradientenfraktion und RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Luciferase Control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA Extraktion</td></tr><tr><td>Glykogen, RNA-Qualität</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Reverse Transkription</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantatives PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit für die Gesamt-RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit für die Echtzeit-PCR-Expressionsanalyse von miRNAs</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Zum Zentrifugieren von 1,5 mL oder 2,0 mL Röhrchen bei unterschiedlichen Temperaturen. Maximale Geschwindigkeit - 21130 x g</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Für die Echtzeit-PCR-Plattenzentrifugation bei verschiedenen Temperaturen. Maximale Geschwindigkeit - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Für die Echtzeit-PCR-Analyse</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Steuerung</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Für die Qualitätskontrolle der RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, grün/transparent</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Für die Echtzeit-PCR-Analyse</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR-Plattenversiegelungsfolie, selbstklebend, optisch</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Für die Echtzeit-PCR-Plattenversiegelung</td></tr><tr><td>Research plus Einkanalpipette, Grau; 0,5-10 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipetten, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipetten, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Zum Pipettieren von</td></tr><tr><td>Glykogen, RNA-Qualität</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Verbessert die Gesamteffizienz der RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 mL Röhrchen, naturfarben</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA-Isolierung und -Lagerung; Reagenzienmischung</td></tr><tr><td>Thermal Cycling Tubes -0,2 mL Individual Caps, Standard 0,2 mL Tubes mit optisch</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reverse Transkriptionsreaktion</td></tr><tr><td>Sharp 10 Präzisions-Barrierespitzen</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>Sharp 20 Präzisions-Barrierespitzen</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>Sharp 200 Präzisions-Barrierespitzen</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Für Pipettierspitzen</td></tr><tr><td>LTS 1 mL Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Zum Pipettieren</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td> <td>(es ändert sich entsprechend der miRNA)</td><td>Für die Echtzeit-PCR-Analyse</td></tr><tr><td>Gradient Master Version 5.3 Modell 108</td><td>BioComp Instrumente</td><td></td><td>Zur Herstellung von Saccharosegradienten</td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501 Trishydrochlorid</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität,</td><td>Schweine Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen 0,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB & micro; Elutionsplatte 30 & Mikro; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Konzentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC Fallensäule PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC Trennsäule PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite Ionenfallen-Massenspektrometer</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert Software</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST Software</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamische proteomic und mirna analyse des polysomes von isolierten maus herz nach langendorff perfusion

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studien in dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung erfordern spezialisierte Methoden. Hier untersuchten wir Veränderungen in neu synthetisierten Proteine als Reaktion auf Ischämie und Reperfusion mit isoliert PERFUNDIERTEN Maus Herzen gepaart mit Polysome Profilierung. Um die dynamischen Änderungen im Protein Übersetzung besser zu verstehen, wir zeichnen die mRNAs, die wurden mit cytosolische Ribosomen (Polyribosomes oder Polysomes) geladen und auch erholt mitochondriale Polysomes und verglichen mRNA und Protein-Verteilung in der Hocheffizienz Fraktionen (zahlreiche Ribosomen an mRNA befestigt), niedrig-Effizienz (weniger Ribosomen befestigt) darunter auch mitochondriale Polysomes und die Fraktionen nicht übersetzen. MiRNAs können auch mit mRNAs, die übersetzt werden werden, wodurch die Effizienz der Übersetzung zuordnen, untersuchten wir die Verteilung der MiRNAs in die Brüche. Die Verteilung der mRNAs, MiRNAs und Proteine wurde unter basalen PERFUNDIERTEN Bedingungen am Ende des 30 min des globalen keine-Flow-Ischämie und nach 30 min der Reperfusion untersucht. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden verwendet, um diese Analyse zu erreichen – unter anderem wurde der Ansatz zur Optimierung der Proteingewinnung aus Saccharose Neigung, als dies nicht vor beschrieben — und einige repräsentative Ergebnisse liefern.

mRNA-Analyse mRNA-Ergebnisse können als Gewinnausschüttung einer bestimmten mRNA in jedem Bruchteil (Abbildung 3A); Kombinieren Sie für die Quantifizierung polyribosomal Übersetzung Brüche und vergleichen Sie nicht übersetzen Bruchteil (Abb. 3 b), präsentiert ein Verhältnis von mRNA Fülle nontranslating Fraktionen zu übersetzen. Weitere Informationen gewinnt man durch die Untersuchung der hocheffiziente Polysome Frakt...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur dynamischen Proteinsynthese und dem daran beteiligten Proteom zu beantworten. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung der mRNAs, die für die Translation ausgewählt werden, der microRNAs, die am Prozess teilnehmen und die Translation stören können, und der Proteine, die zur Proteintranslation beitragen oder selbst translatiert werden. Diese Methode kann Einblicke in die kardialen Reaktionen auf Stress geben, kann aber auch auf die Untersuchung akuter Stressreaktionen in anderen Organen angewendet werden.Das Verfahren wird von Miroslava Stastna, einer Projektwissenschaftlerin aus dem Labor von Jennifer Van Eyk, vorgeführt. Füllen Sie am Tag des Experiments das linke Fach eines Gradientenmischers mit fünf Millilitern 15%iger Saccharose-Gradientenlösung und füllen Sie das rechte Fach mit fünf Millilitern 50%iger Saccharose-Gradientenlösung. Öffnen Sie den Hahn und schalten Sie die Pumpe ein, um die beiden kleinen Kammern mit einem Magnetrührer zu rühren, und verwenden Sie ein Rohr, das mit dem zweiten Hahn verbunden ist, damit die gemischten Saccharoselösungen in ein einzelnes Ultrazentrifugenröhrchen mit dünnen Wänden auf Eis fließen können.Anschließend homogenisieren Sie das frische oder gefrorene Herzgewebe mit einem POLYTRON in gefiltertem Lysepuffer für 15 Sekunden auf Eis. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat, um das unlösliche Material zu entfernen, und ernten Sie den Überstand. Legen Sie 50 Mikroliter des Überstands für die Proteinbestimmung, die RNA-Isolierung und die RNA-Integritätsanalyse beiseite und schichten Sie 100 bis 500 Mikroliter des verbleibenden Überstands über die Gradientenlösung.Verwenden Sie frischen Lysepuffer, um das Volumen zwischen den beiden Gradientenröhrchen auszugleichen, und ultrazentrifugieren Sie die Proben in einer Ultrazentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor. Achten Sie sehr darauf, den Saccharosegradienten vor oder nach der Zentrifugation nicht zu stören. Um die Gradienten zu erfassen, programmieren Sie den Fraktionssammler so, dass er die ersten drei Minuten der Sammlung verwirft und die schweren, leichten und nicht übersetzenden Fraktionen mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute in 17 Fraktionen von vier bis 19 Minuten mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 254 Nanometern sammelt.Legen Sie jede Fraktion auf Eis, sobald sie gesammelt wurde. Lagern Sie die Proben dann bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. Um Proteine aus den Polysomenfraktionen zu extrahieren, kombinieren Sie die gesammelten Saccharosefraktionen zu drei Endfraktionen und markieren Sie die Fraktionen als schwer, leicht und nicht translatierend.Mischen Sie 0,5 Milliliter jeder Probe mit 60 Mikrolitern 100%iger Trichloressigsäure oder TCA. Inkubieren Sie die Fraktionen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Morgen tauen Sie die Proben auf Eis auf, bevor Sie die Proteine durch Zentrifugation pelletieren.Entsorgen Sie die Überstände und waschen Sie die Pellets zweimal mit 0,5 Millilitern gekühltem Aceton bei minus 20 Grad Celsius pro Zentrifugation. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nach der TCA-Fällung vollständig aufgelöst ist, und zwar mit Pulsbeschallung, um bei Bedarf eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten. Trocknen Sie die Pellets nach der letzten Wäsche an der Luft, bevor Sie sie in 360 Mikrolitern Tris-HCl-Puffer resuspendieren.Fügen Sie dann 40 Mikroliter Dithiothreitol für eine 45-minütige Inkubation bei 55 Grad Celsius unter Schütteln hinzu. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Jodacetamid zu den Proben für eine 30-minütige Inkubation auf dem Shaker bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, gefolgt von einem Aufschluss der Proben mit einem Trypsin-Protein-Verhältnis von eins zu 50 für eine Schüttelinkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen nach dem Abkühlen die Proben kurz zentrifugieren und den pH-Wert mit 10%iger Ameisensäure auf zwei bis drei einstellen, um die Trypsinaktivität zu löschen.Um die Proben zu entsalzen, konditionieren Sie das Sorptionsmittel zunächst dreimal in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Methanol, gefolgt von einer dreimaligen Konditionierung mit 200 Mikrolitern 0,1 %iger Ameisensäure pro Well. Laden Sie dann die Proben in jede Vertiefung und waschen Sie die Proben dreimal mit 200 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure pro Waschgang. Unter Verwendung der Schwerkraft, gefolgt von niedrigem Vakuum, eluieren Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure in 50 % Acetonitril zweimal in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinretention pro Probe.Verwenden Sie dann einen Konzentrator, um die Probeneluate bis zur Trockenheit zu verdampfen, und rekonstituieren Sie jedes tryptische Peptidpellet in 50 bis 100 Mikrolitern 0,1 %-Ameisensäure für die Massenspektrometrieanalyse. Die mRNA-Analyse kann durchgeführt werden, um die Verteilung einer bestimmten mRNA von Interesse in jeder Fraktion zu beurteilen oder um die kombinierten polyribosomalen translatierenden Fraktionen mit der nicht-translatierenden Fraktion als Verhältnis der mRNA-Häufigkeit jeder Fraktion zu quantifizieren und zu vergleichen. Zum Beispiel werden hier die Veränderungen in der mRNA-Verteilung über die translatierenden und nicht-translatierenden Fraktionen nach Ischämie oder Ischämie-Reperfusion des Mausherzens im Vergleich zur Scheinherzbehandlung gezeigt.In diesem repräsentativen Experiment ergab die Analyse einer Untergruppe von microRNAs in den gepoolten schweren Fraktionen, dass 22 microRNAs während der Ischämie, neun während der Ischämie und Reperfusion und sieben bei beiden Erkrankungen assoziiert waren, was zeigt, dass die Assoziation von microRNAs als Reaktion auf die Belastungen von Ischämie und Reperfusion dynamisch ist. Des Weiteren wurde die Mehrzahl der mitochondrialen ribosomalen Proteine in der leichten Fraktion identifiziert, und die Mehrzahl der zytosolischen ribosomalen Proteine wurde häufig sowohl in der schweren als auch in der leichten Fraktion identifiziert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sehr vorsichtig mit dem Saccharosegradienten umzugehen.Die TCA-Fällung für die Extraktion von Proteinen aus Polysomenfraktionen wurde in unserem Arbeitsablauf sowohl aufgrund der Fähigkeit, die Fraktion mit hoher Saccharosekonzentration zu verarbeiten, als auch aufgrund der Anzahl der durch Massenspektrometrie identifizierten Proteine ausgewählt. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Herausforderungen, die mit der Reproduzierbarkeit des Saccharosegradienten verbunden sind, Schwierigkeiten haben. Die TCA-Fällung ist vorteilhaft, da nur geringe Volumina zur Ausfällung der Proteine benötigt werden, das Pellet am Röhrchenboden sichtbar ist und es während der Fällung zu keiner Ansammlung von Saccharose kommt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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