Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur dynamischen Proteinsynthese und dem daran beteiligten Proteom zu beantworten. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung der mRNAs, die für die Translation ausgewählt werden, der microRNAs, die am Prozess teilnehmen und die Translation stören können, und der Proteine, die zur Proteintranslation beitragen oder selbst translatiert werden. Diese Methode kann Einblicke in die kardialen Reaktionen auf Stress geben, kann aber auch auf die Untersuchung akuter Stressreaktionen in anderen Organen angewendet werden.

Verfahren wird von Miroslava Stastna, einer Projektwissenschaftlerin aus dem Labor von Jennifer Van Eyk, vorgeführt. Füllen Sie am Tag des Experiments das linke Fach eines Gradientenmischers mit fünf Millilitern 15%iger Saccharose-Gradientenlösung und füllen Sie das rechte Fach mit fünf Millilitern 50%iger Saccharose-Gradientenlösung. Öffnen Sie den Hahn und schalten Sie die Pumpe ein, um die beiden kleinen Kammern mit einem Magnetrührer zu rühren, und verwenden Sie ein Rohr, das mit dem zweiten Hahn verbunden ist, damit die gemischten Saccharoselösungen in ein einzelnes Ultrazentrifugenröhrchen mit dünnen Wänden auf Eis fließen können.

Anschließend homogenisieren Sie das frische oder gefrorene Herzgewebe mit einem POLYTRON in gefiltertem Lysepuffer für 15 Sekunden auf Eis. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat, um das unlösliche Material zu entfernen, und ernten Sie den Überstand. Legen Sie 50 Mikroliter des Überstands für die Proteinbestimmung, die RNA-Isolierung und die RNA-Integritätsanalyse beiseite und schichten Sie 100 bis 500 Mikroliter des verbleibenden Überstands über die Gradientenlösung.

Verwenden Sie frischen Lysepuffer, um das Volumen zwischen den beiden Gradientenröhrchen auszugleichen, und ultrazentrifugieren Sie die Proben in einer Ultrazentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor. Achten Sie sehr darauf, den Saccharosegradienten vor oder nach der Zentrifugation nicht zu stören. Um die Gradienten zu erfassen, programmieren Sie den Fraktionssammler so, dass er die ersten drei Minuten der Sammlung verwirft und die schweren, leichten und nicht übersetzenden Fraktionen mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute in 17 Fraktionen von vier bis 19 Minuten mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 254 Nanometern sammelt.

Legen Sie jede Fraktion auf Eis, sobald sie gesammelt wurde. Lagern Sie die Proben dann bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. Um Proteine aus den Polysomenfraktionen zu extrahieren, kombinieren Sie die gesammelten Saccharosefraktionen zu drei Endfraktionen und markieren Sie die Fraktionen als schwer, leicht und nicht translatierend.

Mischen Sie 0,5 Milliliter jeder Probe mit 60 Mikrolitern 100%iger Trichloressigsäure oder TCA. Inkubieren Sie die Fraktionen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Morgen tauen Sie die Proben auf Eis auf, bevor Sie die Proteine durch Zentrifugation pelletieren.

Entsorgen Sie die Überstände und waschen Sie die Pellets zweimal mit 0,5 Millilitern gekühltem Aceton bei minus 20 Grad Celsius pro Zentrifugation. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nach der TCA-Fällung vollständig aufgelöst ist, und zwar mit Pulsbeschallung, um bei Bedarf eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten. Trocknen Sie die Pellets nach der letzten Wäsche an der Luft, bevor Sie sie in 360 Mikrolitern Tris-HCl-Puffer resuspendieren.

Fügen Sie dann 40 Mikroliter Dithiothreitol für eine 45-minütige Inkubation bei 55 Grad Celsius unter Schütteln hinzu. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Jodacetamid zu den Proben für eine 30-minütige Inkubation auf dem Shaker bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, gefolgt von einem Aufschluss der Proben mit einem Trypsin-Protein-Verhältnis von eins zu 50 für eine Schüttelinkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen nach dem Abkühlen die Proben kurz zentrifugieren und den pH-Wert mit 10%iger Ameisensäure auf zwei bis drei einstellen, um die Trypsinaktivität zu löschen.

Um die Proben zu entsalzen, konditionieren Sie das Sorptionsmittel zunächst dreimal in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Methanol, gefolgt von einer dreimaligen Konditionierung mit 200 Mikrolitern 0,1 %iger Ameisensäure pro Well. Laden Sie dann die Proben in jede Vertiefung und waschen Sie die Proben dreimal mit 200 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure pro Waschgang. Unter Verwendung der Schwerkraft, gefolgt von niedrigem Vakuum, eluieren Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1 % Ameisensäure in 50 % Acetonitril zweimal in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinretention pro Probe.

Verwenden Sie dann einen Konzentrator, um die Probeneluate bis zur Trockenheit zu verdampfen, und rekonstituieren Sie jedes tryptische Peptidpellet in 50 bis 100 Mikrolitern 0,1 %-Ameisensäure für die Massenspektrometrieanalyse. Die mRNA-Analyse kann durchgeführt werden, um die Verteilung einer bestimmten mRNA von Interesse in jeder Fraktion zu beurteilen oder um die kombinierten polyribosomalen translatierenden Fraktionen mit der nicht-translatierenden Fraktion als Verhältnis der mRNA-Häufigkeit jeder Fraktion zu quantifizieren und zu vergleichen. Zum Beispiel werden hier die Veränderungen in der mRNA-Verteilung über die translatierenden und nicht-translatierenden Fraktionen nach Ischämie oder Ischämie-Reperfusion des Mausherzens im Vergleich zur Scheinherzbehandlung gezeigt.

In diesem repräsentativen Experiment ergab die Analyse einer Untergruppe von microRNAs in den gepoolten schweren Fraktionen, dass 22 microRNAs während der Ischämie, neun während der Ischämie und Reperfusion und sieben bei beiden Erkrankungen assoziiert waren, was zeigt, dass die Assoziation von microRNAs als Reaktion auf die Belastungen von Ischämie und Reperfusion dynamisch ist. Des Weiteren wurde die Mehrzahl der mitochondrialen ribosomalen Proteine in der leichten Fraktion identifiziert, und die Mehrzahl der zytosolischen ribosomalen Proteine wurde häufig sowohl in der schweren als auch in der leichten Fraktion identifiziert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sehr vorsichtig mit dem Saccharosegradienten umzugehen.

Die TCA-Fällung für die Extraktion von Proteinen aus Polysomenfraktionen wurde in unserem Arbeitsablauf sowohl aufgrund der Fähigkeit, die Fraktion mit hoher Saccharosekonzentration zu verarbeiten, als auch aufgrund der Anzahl der durch Massenspektrometrie identifizierten Proteine ausgewählt. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Herausforderungen, die mit der Reproduzierbarkeit des Saccharosegradienten verbunden sind, Schwierigkeiten haben. Die TCA-Fällung ist vorteilhaft, da nur geringe Volumina zur Ausfällung der Proteine benötigt werden, das Pellet am Röhrchenboden sichtbar ist und es während der Fällung zu keiner Ansammlung von Saccharose kommt.