Name: ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie die ODELAY-Methode zur Hochdurchsatz-Quantifizierung von Hefewachstumsphänotypen mittels Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Technik ermöglicht die direkte Beobachtung und Messung von Populationsheterogenität bei genetisch identischen Zellen.

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Die Autoren bestätigen die Unterstützung für diese Arbeit durch Zuschüsse U54 RR022220 und P50 GM076547 an JDA von den US National Institutes of Health. FDM ist ein Postdoktorand mit den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung. Wir danken dem luxemburgischen Zentrum für Systembiomedizin und der Universität Luxemburg für die Unterstützung.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der ODELAY-Test hat mehrere kritische Punkte, um reproduzierbare und zuverlässige phänotypische Messungen zu gewährleisten. Der erste kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Hefekulturen. Es muss darauf geachtet werden, die Hefezellen aus logarithmischem Wachstum zu ernten. Wenn die Kulturen gesättigt sind, dann wird ihre Heterogenität der Bevölkerung erhöht, die Heterogenität durch genetische oder umweltbedingte ( z. B. Kohlenstoffquellen) Faktoren beeinträchtigen kann 11 . Der zweite kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Medien. Im Allgemeinen sollte ein großes Volumen von 10X-Stammmedien-Lösung generiert und dann im Laufe der Zeit verwendet werden, um Batch-Effekte zu minimieren. Die Formulierung von Medien nach Gewicht, wann immer möglich, hilft, die Konsistenz des Mediums im Laufe der Zeit zu verbessern, indem die Dichte des Agars sichergestellt wird und der Gesamtwassergehalt der Agarose genau überwacht werden kann. Der dritte kritische Punkt beinhaltet die Minimierung oder Beseitigung jeder mechanischen Verformung der Agarose michDia Eine mechanische Verformung des Mediums erfolgt am häufigsten bei der Trennung der Agarose aus den Glasscheiben. Wie bei vielen Labortechniken ist die Praxis erforderlich, diesen Schritt zu beherrschen. Die Variation der Verzögerungszeit, wie in Fig. 4 dargestellt , ist oft mit einem der drei Faktoren verbunden: mechanische Verformung des Agarosemediums, Veränderung der geformten Agardicke oder einer instabilen Lichtquelle. Wenn sich das Agarose-Medium in der Z-Höhe über das gefleckte Array ändert, kann die Höhenvariation den Bereich der Autofokus-Routine überwältigen, wodurch die Anfangsbilder leicht unscharf werden. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Fokushöhe an mehreren Stellen in der Mitte und entlang der Kanten des gefleckten Arrays, um sicherzustellen, dass die Autofokusroutine genügend Z-Bereich hat, um Fokus zu finden. Wenn nötig, verwenden Sie das Autofocus-Bedienfeld, um den Fokusbereich zu erhöhen und die Anzahl der Fokussierungsschritte zu erhöhen. Ein dritter möglicher conditIonen, die zu einem schlechten Fokus führen können, ist eine instabile oder flackernde Lichtquelle, die die berechnete Fokusbewertung für eine bestimmte Z-Höhe stören kann. Wolfram Halogenbirnen neigen dazu, gut zu flackern, bevor die Birnen ausbrennen. Die Wirkung eines schlechten Fokus wird in einem Beispiel beobachtet, bei dem die Wachstumskurven zwischen den ersten und zweiten Zeitpunkten eintauchen ( Abbildung 5 A ), während der benachbarte Punkt nicht das gleiche Dip hat ( Abbildung 5 B ). In diesem Fall wurde die schlechte Fokusbedingung durch Ersetzen der Wolfram-Halogen-Lichtquelle gemildert. In der Praxis haben die Autoren festgestellt, dass, um das Flackern von 100W-Wolfram-Halogenlampen zu reduzieren, die Glühbirnen alle 500 h oder etwa alle 2 Monate ausgetauscht werden müssen, wenn die Mikroskope stark untergebracht sind. Um eine schlechte Fokusausgabe von einer flackernden Glühlampe zu vermeiden, ersetzen Sie die Wolfram-Halogen-Lichtquelle oft oder ersetzen Sie die Halogenlampe mit einer Diodenlichtquelle. EinBeispiel eines Datensatzes, der eine geringe Variation der Verdopplungszeiten sowie einheitlichere Verzögerungszeiten zeigt, ist in Fig. 6 gezeigt . Dieser Datensatz wurde mit einem Dioden-Illuminator aufgenommen, der eine stabilere Ausleuchtung über die Zeit bietet, während er den Autofokus durchführt. Während viele der hier erwähnten Punkte zur Optimierung der Medienvorbereitung offensichtlich erscheinen, zeigen sich in der Literatur die meisten Großbildschirme nicht gut miteinander, 8 , 11 . Daher haben wir sorgfältig die Vorbereitung von Kulturen und Agarose-Medien beschrieben, so dass mehr reproduzierbare phänotypische Bildschirme erzeugt werden können. Der ODELAY-Assay ist derzeit im Durchsatz im Vergleich zu Pinning-basierten Assays wie synthetischen genetischen Arrays oder dem Scan-O-Matic-Assay begrenzt. Während diese Methoden die Anzahl der gemessenen Stämme erhöhen, fehlt ihnen die Fähigkeit, einzelne Zellen zu lösenDaher kann man die Heterogenität der Bevölkerung nicht messen, die wir in klonalen Hefestämmen beobachten. Der Ursprung dieser Heterogenität wird derzeit nicht verstanden, aber die hier beschriebene Verschmelzung von Technik und Berechnungen bietet eine Möglichkeit zur objektiven Adressierung der zugrunde liegenden zellulären Mechanismen 12 . Die Autoren möchten beachten, dass ODELAY derzeit nur für eine bestimmte Mikroskopmarke und Körpertyp optimiert ist. Das Ändern von ODELAY für andere Mikroskopsysteme ist einfach, erfordert jedoch Kenntnisse der Open Source API 13 . Allerdings werden sowohl die API als auch die ODELAY Scripts geschrieben, um leicht an verschiedene Systeme und experimentelle Assays angepasst zu werden. Während ODELAY ursprünglich für Hefe entwickelt wurde, konnten wir es ohne Veränderung nutzen, um das Wachstum von Mycobacterium smegmatis zu beobachten. Die Beobachtung der anderen Kolonie bildenden Mikroorganismen istMöglich mit Änderungen am Quellcode 11 . Im Allgemeinen ist ODELAY ein leistungsfähiges und flexibles Werkzeug für den Vergleich von Mikroorganismen, die unter verschiedenen Umgebungsbedingungen und genetischen Störungen gewachsen sind.

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Eignung zu einem gegebenen Umgebungszustand. Das Wachstum wird klassisch in 3 verschiedene Wachstumsregimes getrennt: Lag-Phase, Log-Phase und stationäres Phasenwachstum 1 . Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die von verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen abhängig sind. Zum Beispiel kann die Verzögerungszeit oder die Zeitspanne, in der ein Organismus vor dem Beginn des exponentiellen Wachstums in der Verzögerungsphase verbringt, auf die Fähigkeit eines Organismus hinweisen, auf veränderte Umgebungsbedingungen zu reagieren 2 . Die Verdopplungszeit während des Log-Phase-Wachstums, die häufigste Metrik der zellulären Fitness, zeigt die Gesamteffizienz der Fähigkeit eines Organismus, sich durch Metabolisierung und Nutzung von Umweltmaterialien für die Replikation zu teilen. Stationäre Phase, wo Wachstum nach Log-Phase schnell reduziert wird, ist ein weiterer Indikator für Fitness, die regelmäßig istAls Wachstumsendpunkt in punktbasierten Hefewachstums-Assays verwendet. Mehrere Hefewachstumstests sind derzeit verfügbar und gelten als Standardmethoden zur Bewertung von Wachstumsphänotypen in Hefe 3 , 4 , 5 . Diese Assays basieren in erster Linie auf Methoden zum Anbau von Hefe entweder auf festen oder in flüssigen Medien. Auf festen Medien übertragen Kolonie-Pinning-Assays eine kleine Anzahl von Zellen auf einen festen Agar mit einem Pin und Hefe-Zellen können für eine definierte Zeitspanne wachsen. Kolonien werden dann abgebildet und ihre Größen werden an einem Endpunkt 6 verglichen. Diese Kolonie-Pinning-Assays haben sich als robust und skalierbar erwiesen, um genomweite Bildschirme zu erzeugen. In jüngster Zeit wurde eine periodische Bildgebung mit Flachbett-Scannern und Einzelobjektivreflex (SLR) -Kameras in diese Assays integriert, um das Koloniewachstum über die Zeit 7 , 8 aufzuzeichnen, 9 Die Auflösung dieser Vorrichtungen verhindert jedoch, dass sie einzelne Zellen detektieren und somit diese Kolonie-Pinning-Assays nicht direkt die Verzögerungszeit beobachten und die Variation zwischen den einzelnen Zellen, die in Kolonien wachsen, nicht beobachten können. Flüssigbasierte Wachstumstests wurden auch zur Durchführung von genomweiten Schirmen eingesetzt 3 . Die Kopplung eines Liquidwachstums-Assays mit der Zeitraffer-Mikroskopie zeigte die Heterogenität der Population in der Verdopplungszeit genetisch identischer Einzelzellen, die eine wichtige Perspektive für das Verständnis der genetischen Regulation und der Umweltanpassung bietet. Dieser Assay misst jedoch nicht andere Aspekte des Wachstums wie Verzögerungszeit und Tragfähigkeit 10 . Hier stellen wir eine Methode vor, um alle drei Wachstumsphasen von koloniebildenden Mikroorganismen auf festen Medien unter Verwendung eines Assays zu charakterisieren, den wir ODELAY 11 bezeichnen . ODELAY besteht aus utiliZing hohe Durchlauf-Zeitraffer-Mikroskopie zur Aufzeichnung von Bildern von einzelnen Zellen, die in Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Population einzelner Zellen, die in Kolonien wachsen, zeigt die zugrundeliegende Heterogenität der Bevölkerung, die von anderen weniger empfindlichen Messungen, wie z. B. terminaler Endpunkt-Scoring, nicht erkannt wird. Wir zeigen die Methode auf Hefe, aber ODELAY kann auf jeden Organismus angewendet werden, der Kontrast in der Hellfeldmikroskopie zeigt.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gelstärke (1%) 1,2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Hefeextrakt Pepton (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (durchschnittlich mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Hefestamm BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Hefestamm BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 Karton</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 Zoll 1,0 mm dicke Objektträger 1/2 brutto</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Hydra Roboter für die Handhabung von Flüssigkeiten</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Roboter für die Handhabung von Flüssigkeiten</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL Spitzen Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA Objektiv</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB mit Bildverarbeitungs-Toolbox</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td> https://micro-manager.org/ <td></td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB-Skripte und GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY für Matlab-Skripte und -Software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY für mechanische Zeichnungen</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY für Formzeichnungen</td></tr></tbody></table>

odelay: eine groß angelegte methode für die mehrparameter-quantifizierung des hefewachstums

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Fitness und können in 3 Wachstumsregimes getrennt werden: Lag-Phase, Log-Phase und stationäre Phase. Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die mit verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen zusammenhängen. Hochauflösende und quantitative Messungen aller 3 Phasen des Wachstums sind in der Regel schwer zu erreichen. Hier präsentieren wir eine detaillierte Methode zur Charakterisierung aller 3 Wachstumsphasen auf festen Medien mit einem Assay namens One-Cell Doubling Evaluation von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY). ODELAY quantifiziert die Wachstumsphänotypen einzelner Zellen, die unter Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zu Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Methode kann die Heterogenität der Population mit jedem Wachstumsparameter in genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, direkt beobachten. Diese Heterogenität der Bevölkerung bietet eine einzigartige Perspektive für das Verständnis der genetischen und epigenetischen Regulierung und der Reaktionen aufGenetische und umweltbedingte Störungen. Während die ODELAY-Methode unter Verwendung von Hefe demonstriert wird, kann sie auf jedem koloniebildenden Mikroorganismus verwendet werden, der durch eine helle Feldmikroskopie sichtbar ist.

<html> Beispielbilder von Hefe, die in der Zeitraffer-Mikroskopie wachsen, sind in Fig. 3B gezeigt . Nach der Verarbeitung der Zeitrafferbilder ist ein repräsentativer Datensatz, der die Hefestämme BY4741 &amp; BY4742 vergleicht, in Fig. 4 gezeigt . In diesem Beispiel-Datensatz gibt es sehr wenig Abweichung in der Verdopplungszeit zwischen verschiedenen Positionen auf der Platte. Wenn das Agarosemedium schlecht vorbereitet wird, dann wäre eine offensichtliche Abweichung sowohl bei der Verdopplungszeit als auch bei der Verzögerungszeit in den Fleckpositionen offensichtlich, die mit dem deformierten Bereich des Agarosegels übereinstimmen. Während die Verdopplungszeiten relativ gleichmäßig erscheinen, zeigt dieses Beispiel Variationen der Verzögerungszeitmessungen. Ein konsistenterer Datensatz ist in Abbildung 6 dargestellt . In diesem Datensatz sind sowohl Verzögerungszeit als auch Verdopplungszeit einheitlich. Dateien / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Agar Mould Assembly. Die Komponenten der Agarform sind in ( A ) dargestellt. Montieren Sie den Sockel wie in ( B ) gezeigt und klemmen Sie den Sockel mit kleinen Binderclips. Legen Sie die längeren Ständer in den Hohlraum der Basis ( C ) und legen Sie dann die Schieber wie in ( D ) gezeigt in die Form. Eine Seitenansicht, die den Winkel der Form und die Ausrichtung des Formkörpers zeigt, der für eine gleichmäßige Trennung des Agars von dem Glasschieber ( E ) benötigt wird. Beachten Sie die Position des Daumens und der Zeigefinger sowie die Gerade des Agars, die sich von der Folie ( F ) trennt, und notieren Sie den horizontalen Pfeil. Die Trennlinie sollte sich gleichmäßig in Richtung der vertikalen Pfeile bewegen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Abbildung 2: Sonication and Spotting Methode. Sonden Sie die Platte in Eiswasser und verwenden Sie einen Zentrifugen-Eimerhalter, um die Platte ( A ) zu unterstützen. Legen Sie die Platten aus den Schritten 3.8.1 für das Aufsprühen auf die Agaroseplatte ( B ). Auch die Spitzen so anordnen, dass die linke meisten Kasten eine Spitze an Position C10 hat und dann vier andere Spitzen mit ihren Enden abgeschnitten, also stoßen sie nicht den Plattenhalter ( C ) an. Legen Sie die restlichen Spitzen in vier Boxen, so dass die inneren 24 Spitzenpositionen besetzt sind ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: ODELAY Grafische Benutzeroberfläche. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Diese Schnittstelle ermöglicht die Überwachung der Kamera und die Einstellung der Mikroskop-Beleuchtungseinstellungen für Epifluoreszenz- und Hellfeldmodi. Rote Pfeile zeigen auf die Focus- und Transmit-Tasten, die die Kamera aktivieren, um Bilder schnell zu erfassen und den Durchlicht-Shutter zu öffnen. Blaue Pfeile werden verwendet, um die Bühne für den Ursprung zu bewegen und dann den Ursprung mit der Taste &quot;Go Origin&quot; und &quot;Set&quot; zu setzen. Grüne Pfeile zeigen auf &quot;Reset&quot; und &quot;ODELAY !!!&quot; Tasten, die ODELAY-Bildmodi auf die aktuellen Bedingungen zurücksetzen und die ODELAY-Bildsammlung initiiert. Zeitraffer Bilder von Hefe, die auf festem Medium bei 0, 3, 6 und 9 h nach dem Spotting ( B ) wachsen. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_IPT.m&quot; oder th<html> E ODELAY Bildverarbeitungswerkzeug ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Abbildung 4: Beispiel ODELAY Ausgang. Dieser Datensatz vergleicht die Stämme BY4741 und BY4742 auf YPD-Medien. Diese Figur ist ein Beispiel für eine gut vorbereitete Agarose-Folie; Autofokuseinstellungen sind jedoch nicht optimal. Die Daten, die in jeder Spalte von links nach rechts dargestellt werden, sind: die Tragfähigkeit in Log 2 des Kolonienbereichs; Verdopplungszeit, gegeben in min; Und Verzögerungszeit, gegeben in min. In diesem Beispiel verdoppeln sich die Verdopplungszeiten aller Flecken auf der Agar-Folie gut mit einer kleinen Menge an erhöhter Verdopplungszeit in Richtung der Säule. Allerdings variieren die Lagzeiten in diesem Datensatz erheblich._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Abbildung 5: Growth Curve Beispiele. Dieses Beispiel zeigt, wie ein schlechter Anfangsfokus die geschätzte Verzögerungszeit (t lag ) erhöhen kann ( A ), während die angrenzende Position eine kürzere Verzögerungszeit ( B ) aufweist. T d ist die Verdopplungszeit in min und t lag die Verzögerungszeit in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Abbildung 6: Beispiel für gut durchgeführte Testversuche. Ein eBeispiel des BY4742-Stammes, der nach dem Austausch einer Wolfram-Halogenbirne mit einem Dioden-Illuminator getestet wurde und sichergestellt wurde, dass der Autofokus korrekt eingestellt ist. Alle verdoppelnden Zeiten scheinen sich gut zu überlappen, und die Verzögerungszeiten scheinen konsistent zu sein. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Das übergeordnete Ziel von ODELAY besteht darin, Wachstumsphänotypen einzelner Zellen, die zu Kolonien heranwachsen, auf hochdurchsatzfähige Weise zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Mikrobiologie, Genetik und Systembiologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Auswirkungen genetischer Störungen und von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen auf die Wachstumsphänotypen jedes mikrobiellen Organismus, der zur Koloniebildung befähigt ist. Der Hauptvorteil von ODELAY liegt darin, dass der Forscher die Heterogenität innerhalb einer Population direkt beobachten und quantifizieren kann, und zwar bei einer großen Anzahl von Individuen.Reinigen Sie vor dem Zusammenbau der Agarform die Acrylformen mit 70 %igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Druckluft. Es gibt drei Bodenteile und zwei senkrechte Teile. Zum Beginn des Zusammenbaus der Agarform nehmen Sie die drei Bodenteile und setzen sie so zusammen, dass die beiden identischen Teile das dritte Teil einschließen.Verwenden Sie zwei kleine Büroklammern, um die Basisteile auf jeder Seite zu befestigen. Setzen Sie die senkrechten Teile in die Form ein und stellen Sie sicher, dass die Laserkurve korrekt positioniert ist. Legen Sie einen gereinigten und getrockneten Objektträger auf die Form und halten Sie ihn fest, während Sie einen zweiten Objektträger auf der anderen Seite platzieren.Befestigen Sie die Montage mit einem größeren Büroklammer. Klemmen Sie beide Objektträger mit größeren Büroklammern fest, wobei sich jede obere Büroklammer in Kontakt mit dem Objektträger befinden sollte, der über die Acrylplatte hinausragt. Stellen Sie sicher, dass die Kanten abgedichtet sind, bevor Sie die zusammengesetzte Form mit geschmolzenem Agar füllen, indem Sie etwa 70&nbsp;µL geschmolzenes Agar-Medium entlang der Innenseite der Form pipettieren.Füllen Sie die Form, ohne Luftblasen einzuschließen, indem Sie das geschmolzene Agar langsam entlang der Kante der Form pipettieren. Nachdem die Form gefüllt ist, lassen Sie sie bei einer Umgebungstemperatur von etwa 23 Grad Celsius 40–60 Minuten abkühlen. Der nächste Schritt ist die Trennung der Form. Beginnen Sie damit, die untere Büroklammer zu entfernen. Anschließend wird der untere Teil der Form entfernt, der aus den drei übereinanderliegenden Stücken besteht. Halten Sie die Objektträger durch Zusammendrücken fest und entfernen Sie dann vorsichtig die Büroklammern.Stellen Sie die Form an die Kante der Arbeitsplatte, sodass die Seite der Form mit dem blauen Punkt nach oben zeigt. Legen Sie beide Daumen unter die Acrylplatte und die ersten Finger nach oben an den inneren Rand der Form und drücken Sie langsam und vorsichtig mit den Daumen gegen die Form, als würden Sie den Formabstandshalter um seine untere Kante drehen. Üben Sie dabei einen gleichmäßigen, aber langsam zunehmenden Druck aus.Entlang der Linie, an der das obere Glas die Formabstandshalterung bedeckt, sollten ein Bruch und eine Luftblase entstehen. Nachdem die anfängliche Bruchlinie sichtbar ist, weiterhin mit beiden Daumen nach oben drücken und gleichmäßigen Druck ausüben. Das Agar sollte sich allmählich vom Glas lösen.Setzen Sie die Drehung der Form nach oben fort. Sobald das Glas vollständig gelöst ist, greifen Sie es an und entfernen es vollständig aus der Form. Entfernen Sie anschließend das andere Formteil mit einer ähnlichen Bewegung, um es zu lösen, ohne den Agar zu bewegen.Legen Sie die Objektträger in eine sterile Spitzenbox mit etwas steriler, hochreiner Wasser in der Unterseite. Schließen Sie die Box und lagern Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius zur Verwendung am folgenden Tag. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Stämme in einer 96-Loch-Platte wie im Textprotokoll beschrieben vorbereiten.Verwenden Sie einen Plattenreader, um die optische Dichte bei 600 Nanometern jeder Kultur zu messen. Verdünnen Sie anschließend mithilfe eines automatisierten Verdünnungsprotokolls die Kulturen in der Platte auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,1. Sobald das Verdünnungsprogramm eingerichtet ist, laden Sie die Platten, Röhrchen und Spitzen gemäß der Deck-Layout-Angabe auf das Deck des Flüssigkeits-Handlings-Roboters auf.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Play“, um das Verdünnungsprogramm auszuführen. Wählen Sie die korrekte Anzahl an 50-Mikroliter-Spitzen und die korrekte Anzahl an 300-Mikroliter-Spitzen aus. Sobald die Verdünnung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Verdünnungsplatte vom Roboter und inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius unter Beibehaltung der Luftfeuchtigkeit, um Austrocknen der Platte zu verhindern, für fünf bis sechs Stunden.Etwa eine bis zwei Stunden vor Abschluss der Inkubation der Kulturplatte die Inkubationskammern für das Mikroskop einschalten und sie bei 30 Grad Celsius equilibrieren lassen. Verdünnen Sie die Kultur ein zweites Mal auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,01 bis 0,02, wobei das gleiche automatisierte Verdünnungsprotokoll verwendet wird. Bedecken Sie die Verdünnungsplatte mit einer Metallversiegelung für Tiefkühlbehälter und beschallen Sie sie 30 Sekunden lang in einem Eisbad, wobei die Platte in eisgekühltem Wasser schwimmt.Beschriften Sie vier 96-Loch-Flachbodenplatten als eins, zwei, drei und vier. Übertragen Sie 150 Mikroliter jeder sonifizierten Kultur von der Verdünnungsplatte auf die Flachbodenplatten gemäß diesem Muster: Die Löcher A1 bis D6 in die Löcher C4 bis F9 der Platte eins.Verteilen Sie die Proben aus den Vertiefungen A7 bis D12 in die Vertiefungen C4 bis F9 der Platte Zwei. Verteilen Sie die Proben aus den Vertiefungen E1 bis H6 in die Vertiefungen C4 bis F9 der Platte Drei. Und verteilen Sie die Proben aus den Vertiefungen E7 bis H12 in die Vertiefungen C4 bis F9 der Platte Vier.Um dieses Verfahren zu beginnen, platzieren Sie den Agarose-Objektträger korrekt in die Objektträgerkammer. Stellen Sie danach die 96-Loch-Platten mit flachem Boden in der Reihenfolge ihrer Quadranten von links nach rechts auf den Tisch. Platte Eins, Zwei, Drei und Vier.Stellen Sie die Spitzen in vier leere Spitzenboxen so aus, dass die inneren 24 Vertiefungen jeder Spitzenbox mit Spitzen belegt sind. In einer fünften Box platzieren Sie eine Spitze in Position C10 sowie abgeschnittene Spitzen in den Positionen A1, A12, H1 und H12. Diese vier abgeschnittenen Spitzen dienen der Stabilität der Spitzenplattenklemme.Platzieren Sie den ersten Tip-Punch an der Startstelle des robotergesteuerten Spotting-Programms, um ein Loch in die Agarose zu stanzen, das später zur Ausrichtung der Ursprungskoordinate verwendet wird. Stellen Sie Platte Eins auf den Flüssigkeits-Handhabungsroboter, um das erste Quadrant zu bepunkten. Entfernen Sie den Deckel und setzen Sie das Spotting-Programm fort.Überprüfen Sie, ob alle Tropfen vorhanden sind. Entsorgen Sie die verwendeten Spitzen im Bioabfallbehälter und setzen Sie neue Spitzen auf den Roboter. Warten Sie etwa 30 Sekunden, bis die Tropfen auf einen Durchmesser von etwa einem Millimeter getrocknet sind, und fahren Sie dann mit dem Programm fort.Ersetzen Sie Platte Eins durch Platte Zwei und setzen Sie das Auftragen fort. Wenn alle vier Quadrate beimpft wurden und die Tropfen trocken sind, setzen Sie die Kammerabdeckung wieder auf und drehen Sie die Vorrichtung um. Legen Sie einen Objektträger auf die obere Seite der Objektträgerkammer.Laden Sie zuerst die Objektkammer in das Mikroskop ein. Die Zeitraffermikroskopie wird durch Ausführen eines benutzerdefinierten Skripts durchgeführt. Klicken Sie auf den Verschluss, um den Durchlichtverschluss zu öffnen, und dann auf die Fokustaste, um die hohe Kamerarate zu starten.Klicken Sie auf „Go Origin“ und bewegen Sie den Objekttisch, um die Markierung zu finden, die in das Agar gestanzt wurde. Bewegen Sie sich dann leicht nach rechts, um den Fokus auf die in Bereich E7 aufgebrachten Zellen zu legen. Fahren Sie zurück zur Ausgangsstanze und zentrieren Sie diese im Sichtfeld. Stellen Sie den Ursprung auf diesen Wert ein, indem Sie die „Set“-Taste drücken. Fahren Sie zur Position H18 und fokussieren Sie mithilfe der dem Ort nächstgelegenen Sechskantschraube.Wechseln Sie anschließend zur Position L7 und fokussieren Sie mithilfe der Sechskantschraube, die sich am nächsten an dieser Stelle befindet. Schließlich wechseln Sie zur Position E7 und fokussieren Sie mit der Sechskantschraube, die der Position am nächsten liegt. Überprüfen Sie die Fokussierung in der Mitte sowie an den Kanten an den Stellen E12, H12 und L12, und passen Sie den Autofokus-Bereich an, falls die Fokus-z-Werte, wie durch den z-Wert angegeben, größer als plus oder minus dem Autofokus-Bereich sind.Drücken Sie die „Reset“-Taste und anschließend „ODELAY“. Wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern der Daten aus. Das Mikroskop sammelt 48 Stunden lang Daten oder bis das Programm geschlossen wird.Diese repräsentativen Zeitrafferaufnahmen zeigen Hefezellen, die auf festem Medium wachsen, zu den Zeitpunkten null Stunden, drei Stunden, sechs Stunden und neun Stunden nach dem Auftragen. Dargestellt ist ein repräsentativer Datensatz, der zwei Hefestämme nach der Auswertung der Zeitrafferaufnahmen vergleicht. Die relativ einheitlichen Verdopplungszeiten spiegeln die gut vorbereitete Agaroseplatte wider, jedoch variieren die Lag-Phasen erheblich aufgrund von Autofokuseinstellungen, die nicht optimal sind.Ein konsistenterer Datensatz wird hier gezeigt, bei dem alle Verdopplungszeiten gut zu überlappen scheinen und die Lag-Phasen konsistent erscheinen. Sobald die Einrichtung von ODELAY beherrscht ist, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Die kritischsten Schritte für reproduzierbare ODELAY-Messungen sind die konsistente Zubereitung des Mediums und die Vermeidung mechanischer Verformung des Mediums beim Trennen der Objektträger.ODELAY ist ein äußerst empfindlicher Test. Er kann beispielsweise Wachstumsdefekte bei temperatursensiblen Hefestämmen bei Raumtemperatur nachweisen, während häufig verwendete spotbasierte Assays das Kultivieren der Hefe bei 37 Grad Celsius erfordern, um ein Wachstumsdefekt sichtbar zu machen. Obwohl ODELAY an Hefe entwickelt wurde, ist die Methode auf jeden koloniebildenden Organismus anwendbar, einschließlich Pathogene, um ein breites Spektrum an Umwelt- und genetischen Bedingungen zu untersuchen und das Verhalten von Mikroorganismen zu verstehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ODELAY durchführt, um Wachstumsphänotypen von einzelligen Mikroorganismen zu messen, die Kolonien auf festem Medium bilden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroorganismen gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen, beispielsweise durch das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, die für die untersuchten Organismen geeignet ist.

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Research

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JoVE Journal

Biology

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