ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Das übergeordnete Ziel von ODELAY ist es, Wachstumsphänotypen einzelner Zellen, die zu Kolonien heranwachsen, mit hohem Durchsatz zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Mikrobiologie, Genetik und Systembiologie zu beantworten, wie z. B. die Auswirkungen genetischer Störungen und Arzneimittelwechselwirkungen auf die Wachstumsphänotypen von koloniebildenden Mikroorganismen. Der Hauptvorteil von ODELAY besteht darin, dass es dem Forscher ermöglicht, die Heterogenität der Population bei einer großen Anzahl von Individuen direkt zu beobachten und zu quantifizieren.

Reinigen Sie die Acrylformen vor dem Zusammenbau der Agarform mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Druckluft. Es gibt drei untere und zwei aufrechte Stücke. Um mit dem Zusammenbau der Agarform zu beginnen, nehmen Sie die drei unteren Teile und setzen Sie sie so zusammen, dass die beiden identischen Teile das dritte Stück umschließen.

Verwenden Sie zwei kleine Bindeklammern, um die Basisstücke auf jeder Seite festzuklemmen. Setzen Sie die Pfosten in die Form ein und achten Sie darauf, dass die Laserkurve richtig positioniert ist. Legen Sie einen gereinigten und getrockneten Glasobjektträger auf die Form und halten Sie ihn an Ort und Stelle, während Sie einen zweiten Glasobjektträger auf die andere Seite legen.

Klemmen Sie die Baugruppe mit einer größeren Binderklammer fest. Klemmen Sie beide Objektträger mit größeren Binderklammern fest und stellen Sie sicher, dass jeder obere Binderclip mit dem Glasobjektträger in Kontakt steht, der das Acryl überlappt. Bevor Sie die zusammengebaute Form mit geschmolzenem Agar füllen, stellen Sie sicher, dass die Ränder versiegelt sind, indem Sie etwa 70 Mikroliter geschmolzenes Agarmedium entlang der Innenseite der Form pipettieren.

Füllen Sie die Form, ohne Luftblasen im Inneren einzuschließen, indem Sie den geschmolzenen Agar langsam am Rand der Form entlang pipettieren. Nachdem die Form gefüllt ist, lassen Sie sie 40-60 Minuten lang bei etwa 23 Grad Celsius Umgebungstemperatur abkühlen. Der nächste Schritt ist die Formtrennung.

Beginnen Sie damit, den unteren Bindeclip zu entfernen. Entferne dann den unteren Teil der Form, der aus den drei Sandwichstücken besteht. Halten Sie die Objektträger fest, indem Sie sie zusammendrücken, und entfernen Sie dann vorsichtig die Heftklammern.

Lege die Form so auf den Rand der Tischplatte, dass die Seite der Form mit dem blauen Punkt nach oben zeigt. Legen Sie beide Daumen unter das Acryl und die ersten Finger auf der Oberseite in Richtung der Innenkante der Form und drücken Sie langsam und vorsichtig mit den Daumen gegen die Form, als ob Sie den Formabstandshalter um den unteren Rand schwenken würden. Üben Sie konstanten, aber langsam ansteigenden Druck aus.

Ein Bruch und eine Luftblase sollten entlang einer Linie erscheinen, an der das obere Glas den Formabstandshalter bedeckt. Nachdem Sie die anfängliche Bruchlinie gesehen haben, drücken Sie mit beiden Daumen weiter nach oben und üben Sie konstanten Druck aus. Der Agar sollte anfangen, sich vom Glas zu lösen.

Schwenken Sie die Form weiter nach oben. Wenn das Glas völlig frei ist, greifen Sie es und nehmen Sie es vollständig aus der Form. Entfernen Sie dann das andere Formstück mit einer ähnlichen Bewegung, um das Stück frei zu heben, ohne den Agar zu bewegen.

Legen Sie die Objektträger in eine sterile Tip-Box mit etwas sterilem, hochreinem Wasser am Boden. Verschließen Sie die Box und lagern Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Stämme in einer 96-Well-Platte vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwendung eines Plattenlesegeräts zur Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern jeder Kultur. Verwenden Sie als Nächstes ein automatisiertes Verdünnungsprotokoll, um die Kulturen in der Platte auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,1 zu verdünnen. Sobald das Verdünnungsprogramm eingerichtet ist, laden Sie Platten, Rohre und Spitzen auf das Deck des Liquid-Handling-Roboters, wie durch das Decklayout angezeigt.

Klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche, um das Verdünnungsprogramm auszuführen. Wählen Sie die richtige Anzahl von 50-Mikroliter-Spitzen und die richtige Anzahl von 300-Mikroliter-Spitzen aus. Wenn die Verdünnung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Verdünnungsplatte vom Roboter und kultivieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius unter Beibehaltung der Luftfeuchtigkeit, um ein Austrocknen der Platte für fünf bis sechs Stunden zu verhindern.

Etwa ein bis zwei Stunden, bevor die Inkubation der Kulturplatte abgeschlossen ist, schalten Sie die Inkubationskammern für das Mikroskop ein und lassen Sie sie bei 30 Grad Celsius äquilibrieren. Verdünnen Sie die Kultur ein zweites Mal auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,01 bis 0,02 unter Verwendung desselben automatisierten Verdünnungsprotokolls. Decken Sie die Verdünnungsplatte mit einem Gefriersiegel aus Metall ab und beschallen Sie sie 30 Sekunden lang in einem Eisbad, wobei die Platte in Eiswasser schwimmt.

Beschriften Sie vier 96-Well-Platten mit flachem Boden als eins, zwei, drei und vier. Übertragen Sie 150 Mikroliter jeder beschallten Kultur von der Verdünnungsplatte auf die Flachbodenplatten nach diesem Muster. Vertiefungen A1 bis D6 in die Vertiefungen C4 bis F9 der ersten Platte.

Bohrungen A7 bis D12 in die Vertiefungen C4 bis F9 der zweiten Platte. Vertiefungen E1 bis H6 in die Vertiefungen C4 bis F9 der dritten Platte. Und bohrt die Vertiefungen E7 bis H12 in die Vertiefungen C4 bis F9 von Platte vier.

Um diesen Vorgang zu starten, setzen Sie den Agarose-Objektträger korrekt in die Objektträgerkammer ein. Legen Sie dann die 96-Well-Platten mit flachem Boden in der Reihenfolge ihres Quadranten auf den Tisch. Tafeln eins, zwei, drei und vier von links nach rechts.

Lege die Spitzen so in vier leere Spitzenboxen aus, dass die inneren 24 Vertiefungen jeder Tippbox mit Spitzen belegt sind. Legen Sie in eine fünfte Schachtel eine Spitze in Position C10 und Spitzen mit abgeschnittenem Ende in Positionen A1, A12, H1 und H12. Diese vier abgeschnittenen Spitzen sorgen für Stabilität der Spitzenplattenklemmung.

Platzieren Sie den ersten Spitzenstanzer an der Startstelle des Spottierprogramms der Robotersteuerung, um ein Loch in die Agarose zu stanzen, das später zum Ausrichten der Ursprungskoordinate verwendet werden soll. Platzieren Sie die erste Platte auf dem Liquid-Handling-Roboter, um den ersten Quadranten zu erkennen. Nehmen Sie den Deckel ab und setzen Sie das Schmierblutungsprogramm fort.

Vergewissern Sie sich, dass alle Flecken vorhanden sind. Leeren Sie die gebrauchten Spitzen in den Biohazard-Behälter und legen Sie frische Spitzen auf den Roboter. Warten Sie etwa 30 Sekunden, bis die Flecken auf einen Durchmesser von etwa einem Millimeter getrocknet sind, und setzen Sie dann das Programm fort.

Tauschen Sie Platte eins gegen Platte zwei aus und setzen Sie das Spottprogramm fort. Wenn alle vier Quadranten gesichtet wurden und die Flecken trocken sind, setzen Sie die Abdeckung der Schiebekammer wieder auf und drehen Sie das Gerät um. Platzieren Sie einen Objektträger auf der Oberseite der Objektträgerkammer.

Laden Sie zunächst die Objektträgerkammer in das Mikroskop. Die Zeitraffermikroskopie wird durchgeführt, indem ein speziell entwickeltes Skript ausgeführt wird. Klicken Sie auf den Auslöser, um den Durchlichtverschluss zu öffnen, und dann auf die Fokustaste, um die hohe Kamerarate zu starten.

Klicken Sie auf "Go Origin" und bewegen Sie die Bühne, um die Ursprungsmarkierung zu finden, die in den Agar gestanzt wurde, und bewegen Sie sich dann leicht nach rechts, um sich auf die Zellen zu konzentrieren, die im Bereich E7 entdeckt wurden. Kehren Sie zum Ursprungsstempel zurück und zentrieren Sie ihn im Sichtfeld. Setzen Sie den Ursprung auf diesen Wert, indem Sie die Schaltfläche "Set" drücken. Bewegen Sie sich zu Position H18 und fokussieren Sie mit der Sechskantschraube, die dieser Position am nächsten liegt.

Gehen Sie dann zu Position L7 und fokussieren Sie mit der Sechskantschraube, die dieser Position am nächsten liegt. Gehen Sie schließlich zu Position E7 und fokussieren Sie mit der Sechskantschraube, die dieser Position am nächsten liegt. Überprüfen Sie den Fokus in der Mitte und an den Rändern an den Punkten E12, H12 und L12 und stellen Sie den Autofokusbereich ein, wenn die durch den z-Wert angezeigten Fokus-Z-Werte größer als plus oder minus des Autofokusbereichs sind.

Drücken Sie die Taste "Reset" und dann ODELAY. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen. Das Mikroskop sammelt Daten für 48 Stunden oder bis das Programm geschlossen wird.

Diese repräsentativen Zeitrafferbilder zeigen Hefezellen, die auf festem Medium als Stunde null, drei Stunden, sechs Stunden und neun Stunden nach der Schmierblutung wachsen. Hier ist ein repräsentativer Datensatz zu sehen, der zwei Hefestämme nach der Verarbeitung der Zeitrafferbilder vergleicht. Die relativ gleichmäßigen Verdopplungszeiten spiegeln den gut vorbereiteten Agarose-Schlitten wider, allerdings variieren die Verzögerungszeiten aufgrund nicht optimaler Autofokus-Einstellungen erheblich.

Hier wird ein konsistenterer Datensatz gezeigt, in dem sich alle Verdopplungszeiten gut zu überlappen scheinen und die Verzögerungszeiten konsistent zu sein scheinen. Einmal gemastert, kann das Setup von ODELAY in drei bis vier Stunden erledigt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Die wichtigsten Schritte für wiederholbare ODELAY-Messungen sind die gleichmäßige Vorbereitung des Mediums und die Vermeidung einer mechanischen Verformung des Mediums beim Trennen der Objektträger.

ODELAY ist ein sehr empfindlicher Assay. Zum Beispiel kann es Wachstumsdefekte in temperaturempfindlichen Hefestämmen bei Raumtemperatur beobachten, während üblicherweise punktbasierte Assays die Kultivierung von Hefe bei 37 Grad Celsius erfordern, um einen Wachstumsdefekt aufzudecken. Obwohl ODELAY in Hefe entwickelt wurde, ist die Methode auf jeden koloniebildenden Organismus, einschließlich Krankheitserreger, anwendbar, um eine breite Palette von Umwelt- und genetischen Bedingungen zu erforschen und das Verhalten von Mikroorganismen zu verstehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ODELAY durchführen, um Wachstumsphänotypen von einzelligen Mikroorganismen zu messen, die Kolonien auf festen Medien bilden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Mikroorganismen gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, die für die untersuchten Organismen geeignet ist.