Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteinwechselwirkungen mit immobilisierten Lockstoff-Molekülen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Lockstoff gewonnen und immobilisiert wird. Im zweiten Schritt wird die zu untersuchende Phagenbibliothek unter Bindungsbedingungen dem Lockstoff zugegeben.

Anschließend werden die nicht gebundenen Phagen durch strenge Waschschritte entfernt. Die gebundenen Phagen hingegen werden verwendet, um die Bakterien zu infizieren, bevor sie gewonnen werden. Der letzte Schritt besteht darin, die gebundenen Phagen für die nächste Runde der Affinitätsselektion zu amplifizieren.

Letztlich werden, wenn die Phagentiterkurve ein Plateau erreicht, einzelne Plaques ausgewählt und sequenziert, um nachzuweisen, welche Proteine die höchste Affinität für das immobilisierte Folgeprotein unter den experimentellen Bindungsbedingungen aufweisen. Dieser Prozess kann helfen, zentrale Fragen zu Protein-Protein-Interaktionen zu beantworten. Das Verfahren beginnt damit, dass gereinigtes rekombinantes Protein gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung in die Mulden von Mikrotiterplatten gegeben wird.

Der nächste Schritt besteht darin, 50 Milliliter Luria-Burani-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit einer einzelnen Kolonie zu beimpfen, die zuvor wie im Textprotokoll beschrieben angezüchtet wurde, und bei 37 Grad Celsius, 200 U/min in einem horizontalen Schüttler zu inkubieren. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Zelldichte zu überwachen, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 bis 0,6 erreicht ist. Gießen Sie anschließend die Zellen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen oder ein ähnliches Gefäß und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung. Die Zellen bleiben normalerweise etwa eine Woche lang vital. Am ersten Tag bereiten Sie alles für die Affinitätsselektion vor, wie im Textprotokoll beschrieben, am Morgen des zweiten Tages.

Stellen Sie neun leere Autoklav-250-Milliliter-Erlenmeyerkolben in die Halterungen eines Inkubationsschüttlagers und impfen Sie 500 Milliliter Lal-Burani mit 500 Mikrolitern aus einer der am Vortag angesetzten Übernachtkulturen von Phagen-infizierten BLT 5 4 0 3-Zellen. Nachdem Sie den Kolben in den Inkubator gestellt haben, schalten Sie das Spektrophotometer ein und stellen es so ein, dass es die Absorption bei 600 Nanometern misst. In der Zwischenzeit nehmen Sie die Mikrotiterplatte aus dem 4-Grad-Celsius-Kühlschrank und entfernen die Plastikfolie. Entfernen Sie jegliches nicht gebundene Protein von der Platte, indem Sie die Platte zehnmal mit jeweils 200 Mikrolitern pro Mulde von 1× Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,5, waschen und die Platte zwischen den Waschschritten kopfüber auf ein Papiertuch schlagen.

Blockieren Sie mit 200 µL pro Mulde einer 5 %igen Blockierlösung in TBS für eine Stunde. Während die Platte in Parafilm eingewickelt ist, waschen Sie die Blockierungslösung 10-mal mit jeweils 200 µL 1× TBS-T ab, wobei Sie die Platte zwischen den Waschschritten verkehrt herum auf vier Lagen Papier handtuchtrocknen.

Von hier aus Barrierespitzen verwenden, um eine Kreuzkontamination mit Phagen zu vermeiden. 100 Mikroliter der Phagenbibliothek mit den Proteinen pipettieren. Die Platte erneut mit Parafilm verschließen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach einer Stunde die Plastikfolie von der Platte entfernen und unverzüglich den Phagen durch Schütteln in den biologischen Abfall entsorgen. Anschließend mit einer Mehrkanalpipette schnell 200 µL eines X-T-B-S-T in jedes Loch geben. Stellen Sie einen Timer auf eine Minute.

Nach einer Minute den Puffer in den biohazard-Müll ausschütten, das Plättchen verkehrt herum auf ein Papiertuch schlagen und zurück auf den Arbeitsplatz stellen. Wiederholen Sie die Waschschritte nach dem 10. Waschgang insgesamt zehnmal. Nehmen Sie 200 Mikroliter BLT 5 4 0 3-Zellen aus dem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen bei vier Grad Celsius und übertragen Sie diese jeweils auf den Boden der neun Vertiefungen, aus denen der letzte Waschschritt entfernt wurde.

Verpacken Sie die Platten in Frischhaltefolie und stellen Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit eventuell noch an dem Köder haftende Phagen am Ende der 20 Minuten die Bakterien infizieren können. Entfernen Sie die Folie von den Platten. Entnehmen Sie danach 10 Mikroliter Bakterien aus dem BSA bei 25 Grad Celsius, aus einer Welle der Replikation, und übertragen Sie diese in 990 Mikroliter Medium, das als eins gekennzeichnet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal für dieses Well, sodass drei Triplikate einer 1:100-Verdünnung des Phagen aus diesem Well entstehen – dies ist die BSA-Replikation eins, dreimal entnommen. Diese Verdünnungen werden verwendet, um die durchschnittliche Titerkonzentration zuzüglich oder minus dem Standardfehler des Mittelwerts für diese Replikation von BSA zu schätzen. Führen Sie dasselbe für Replikation zwei und drei von BSA sowie für die drei replizierten Wells des vergifteten Bait-Proteins und für das Bait-Protein durch. Stellen Sie diese 27 EOR-Röhrchen beiseite. Wenn sich die Bakterien im Kolben bei einer optischen Dichte von 0,6 bis 1,0 befinden, gießen Sie 50 Milliliter der Zellen aus dem Fern-Fläschchen in jedes der 9 Erlenmeyerkolben mit 250 Milliliter Inhalt.

Nehmen Sie die verbleibenden 170 µL phageninfizierter BLT5403-Bakterien aus dem BSA-Replikations-Well und geben Sie diese zu den 50 mL Zellen, die als BSA Rep.Eins gekennzeichnet sind. Wiederholen Sie dies für alle neun Wells, bevor Sie die Kolben im 37 °C-Inkubator schütteln. In der Zwischenzeit führen Sie Verdünnungen aus den anfänglichen 27 Verdünnungen durch, indem Sie 100 µL LB mit Bakterien aus dem Einor-Röhrchen eins nehmen und zu den 900 µL LB im Einor-Röhrchen hinzufügen.

Vier für die 10 hoch minus drei Verdünnung, verwerfen Sie die Filtertipp-Spitze und verwenden Sie vor dem Einbringen von 100 Mikrolitern des LB mit Bakterien aus dem Eppendorf-Röhrchen vier in das 900 Mikroliter LB in Eppendorf-Röhrchen sieben eine neue Spitze. Für die 10 hoch minus vier Verdünnung fahren Sie mit der Verdünnung für alle Triplikate aller Replikationen aller Proteine und Behandlungen fort. Insgesamt sollten es 135 Röhrchen sein, sobald die Zellen lysiert haben.

Bringen Sie die Kultur durch Zugabe von fünf Milliliter einer fünf Molaren Natriumchlorid-Standardlösung auf 0,5 Molare Natriumchlorid und überführen Sie die Probe in eine beschriftete Zentrifugenflasche. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 8.000 × g und vier Grad Celsius. Danach gießen Sie das überstehende Viren enthaltende Überstand in ein sauberes, steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie einige Tropfen Chloroform zum abgegossenen Überstand im Falcon-Röhrchen hinzu.

Das Überstand kann bei vier Grad Celsius für die nächste Runde der Affinitätsselektion am dritten Tag aufbewahrt werden; pipettieren Sie 250 Mikroliter VLT 5 4 0 3-Zellen von vier Grad Celsius in jedes der zuvor vorbereiteten nummerierten Bo-Silikat-Reagenzgläser. Danach pipettieren Sie 100 Mikroliter aus der Verdünnung im Einor-Röhrchen eins in die 250 Mikroliter Zellen im Bur-Silikat-Reagenzglas.Eins. Erhitzen Sie kurz die ersten fünf Zoll der Pipette über der Flamme und tauchen Sie sie in die geschmolzene Top-Aros.

Ziehen Sie drei Milliliter auf und geben Sie sie schnell in das Reagenzglas auf die Zellen und den Phagen. Mischen Sie durch leichtes Anschlagen mit einem Finger, während Sie das Reagenzglas mit der anderen Hand halten, und gießen Sie anschließend den Inhalt auf die Platte. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie das Reagenzglas, um Blasen und trockene Stellen zu beseitigen, bis die gesamte Platte mit dem oberen Agaroseüberstand bedeckt ist.

Stellen Sie es aufrecht auf dem Pult zum Abkühlen beiseite. Entsorgen Sie die Borosilikat-Röhre. Entfernen Sie die Filter-Spitze und nehmen Sie eine neue, um fortzufahren, bis alle Verdünnungen ausplattiert wurden.

Holen Sie die vorbereiteten Platten je nach Bedarf aus dem Inkubator, jedoch nicht mehr als sechs gleichzeitig, da sie sonst abkühlen und das obere Agar zu schnell erstarrt. Untersuchen Sie die auf den Platten gebildeten Plaques und entsorgen Sie jene mit konfluenter Lyse. Bestimmen Sie, bei welchen der verbleibenden seriellen Verdünnungen die Anzahl der Plaques ausreichend gering ist, um eine genaue Zählung zu ermöglichen. Notieren Sie die Anzahl der Plaques auf diesen Platten und berechnen Sie die Titer gemäß der schriftlichen Anleitung am Ende der Affinitätsselektion. Runde vier: Wählen Sie 18 einzelne, gut abgegrenzte Plaque-Kolonien unter Verwendung einer sterilen gelben Pipettenspitze aus.

Befeuchten Sie die Innenseite der Pipettenspitze mit Tris-Hydrochlorid, pH 8,5, in einem Eppendorf-Röhrchen. Entnehmen Sie dann die Kolonien von den Titrierplatten, indem Sie die Spitze durch eine gut isolierte Kolonie hindurch bis zum darunterliegenden Kunststoff-Petri-Schale drücken und den Kolonieabdruck aufsaugen. Geben Sie den Abdruck in 100 Mikroliter Tris-Hydrochlorid, pH 8,5, in das entsprechende Röhrchen und wirbeln Sie kurz. Erhitzen Sie anschließend kurz 20 Mikroliter dieser Lösung 10 Minuten lang auf 65 Grad Celsius und führen Sie danach die PCR und Sequenzierung gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren durch. Typische Titrierergebnisse werden hier dargestellt. Durch mehrfache Stichproben entstehen Endwerte, die weniger anfällig für Pipettierfehler sind und eine genauere Schätzung des tatsächlichen Titers sowie der zugehörigen Variabilität ermöglichen.

Die Schätzung von Brunnen zu Brunnen ergibt eine zunehmende Phagentiterung, vorzugsweise für den nicht vergifteten Köder, während die Anzahl der Affinitätsselektionsrunden steigt. Dies liefert zudem Vertrauen, dass die Technik funktioniert. Die Beibehaltung eines zunehmenden Prozentsatzes an Phagen mit Insert in den Brunnen des nicht vergifteten Köders, während die Anzahl der Affinitätsselektionen steigt, ist ebenfalls vielversprechend nach fortgeschrittenen Runden der Affinitätsselektion.

Ein Anstieg der Anzahl unabhängig gewonnener Phagen, die ein Insert enthalten, im Vergleich zur ersten Runde sowie das Auftreten dieser Amplifikate in wenigen gleich großem Bandmuster ist ein guter Hinweis darauf, dass bestimmte Klone bei der Affinitätsselektion nach diesem Verfahren gezielt angereichert werden. Weitere Methoden wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Test können durchgeführt werden, um die durch Phag-Display entdeckten Wechselwirkungen zu validieren.