Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteinwechselwirkungen mit immobilisierten Ködermolekülen zu entdecken. Dies wird erreicht, indem der Köder zunächst aufgenommen und ruhiggestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die zu siebende Phagenbibliothek unter bindungsfördernden Bedingungen in den Köder einzuführen.

Anschließend werden die ungebundenen Phagen durch stringentes Waschen entfernt. Während gebundene Phagen verwendet werden, um die Bakterien zu infizieren, bevor sie zurückgewonnen werden. Der letzte Schritt besteht darin, den gebundenen Phagen für die nächste Iteration der Affinitätsselektion zu amplifizieren.

Wenn der Phagentiter ein Plateau erreicht, werden schließlich einzelne Plaques ausgewählt und sequenziert, um zu zeigen, welche Proteine unter den experimentellen Bindungsbedingungen die höchste Affinität für den immobilisierten Belag aufweisen. Dieser Prozess kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu Protein-Protein-Wechselwirkungen zu beantworten. Dieses Verfahren beginnt damit, dass das gereinigte rekombinante Protein in den Boden der Mikrotiterplatten eingebracht wird, wie im Textprotokoll beschrieben.

Der nächste Schritt besteht darin, 50 Milliliter Luria burani Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem 250 Milliliter Erlenmeyerkolben mit einer einzelnen Kolonie zu impfen, die zuvor wie im Textprotokoll beschrieben gezüchtet wurde, bei 37 Grad Celsius, 200 U/min in einem horizontalen Schüttler zu inkubieren und mit einem Spektralphotometer die Zelldichte zu überwachen, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 bis 0,6 erreicht ist. Gießen Sie dann die Zellen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen oder ähnliches und halten Sie sie bei vier Grad Celsius, bis die Zellen am ersten Tag in der Regel etwa eine Woche lang lebensfähig bleiben. Bereiten Sie sich auf die Affinitätsauswahl vor, wie im Textprotokoll beschrieben, am Morgen des zweiten Tages.

Legen Sie neun leere 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben in die Klammern eines Inkubationsschüttlers, impfen Sie 500 Milliliter Lal Burani mit 500 Mikrolitern aus einer der Übernachtkulturen von Phagen-infizierten BLT 5 4 0 3-Zellen, die in der Nacht zuvor nach dem Platzieren des Kolbens in den Inkubator begonnen wurden, schalten Sie das Spektralphotometer ein und stellen Sie es so ein, dass die Absorption bei 600 Nanometern gemessen wird. In der Zwischenzeit die Mikrotiterplatte von vier Grad Celsius entfernen und die Plastikfolie entfernen. Entfernen Sie alle ungebundenen Proteine von der Platte, indem Sie 10 Mal mit 200 Mikrolitern pro Vertiefung einer X Tris gepufferten Kochsalzlösung oder TBS pH 7,5 waschen und die Platte zwischen den Wäschen kopfüber auf das Papiertuch schlagen.

Blockieren Sie eine Stunde lang mit 200 Mikrolitern 5%-Blockierungsreagenz in TBS pro Well. Waschen Sie die Platte in Plastikfolie eingewickelt 10 Mal mit 200 Mikrolitern eines X-T-B-S-T ab, indem Sie die Platte kopfüber auf vier Papierlagen schmatzen. Handtuch zwischen den Wäschen.

Verwenden Sie von hier aus Filterbarrierespitzen, um eine Phagenkreuzkontamination zu vermeiden. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Phagenbibliothek mit den Proteinen hinein. Verschließen Sie die Platte wieder mit Frischhaltefolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach einer Stunde die Plastikfolie von der Platte und waschen Sie sie sofort, indem Sie den Phagen in den biogefährlichen Abfall ausschütteln. Verwenden Sie dann eine Multipipette, um schnell 200 Mikroliter eines X-T-B-S-T zu jedem hinzuzufügen. Stellen Sie einen Timer auf eine Minute.

Nach einer Minute schütteln Sie den Puffer in den biologisch gefährlichen Abfall aus, schlagen Sie den Teller kopfüber auf ein Papiertuch und legen Sie ihn wieder auf die Bank. Wiederholen Sie die Waschschritte nach der 10. Wäsche 10 Mal. Entnehmen Sie 200 Mikroliter BLT 5 4 0 3 Zellen bei vier Grad Celsius aus dem 50 Milliliter Falcon-Röhrchen und geben Sie sie auf den Boden jeder der neun Vertiefungen, aus denen die letzte Wäsche entnommen wurde.

Wickeln Sie die Platten in Plastikfolie ein und legen Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf, damit am Ende der 20 Minuten noch Phagen am Köder haften bleiben, um die Bakterien zu infizieren. Packen Sie die Teller aus. Als nächstes entfernen Sie 10 Mikroliter Bakterien aus dem BSA bei 25 Grad Celsius Replikation eine Vertiefung und übertragen Sie sie auf die 990 Mikroliter des mit 1 gekennzeichneten Mediums.

Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal für diese Vertiefung, was zu drei Dreifachen von einem bis 100 Dilu des Phagen aus dieser Vertiefung führt, dies ist die BSA-Replikation, die dreimal entnommen wurde. Diese Verdünnung wird verwendet, um den durchschnittlichen Titer plus oder minus den Standardfehler des Mittelwerts für diese Replikation von BSA zu schätzen; machen Sie dasselbe für die Replikation zwei und drei von BSA für die drei replizierten Vertiefungen des vergifteten Köderproteins und für das Köderprotein legen Sie diese 27 EOR-Röhrchen beiseite. Liegen die Bakterien in dem Kolben bei einer optischen Dichte von 0,6 bis 1,0 Kolben vor, so werden 50 Milliliter der Zellen aus dem Farnkolben in jeden der 9 250 Milliliter Erlenmeyerkolben umgefüllt.

Nehmen Sie die restlichen 170 Mikroliter Phagen-infizierter BLT 5 4 0 3 Bakterien in der BSA-Replikation eine Vertiefung und fügen Sie sie den 50 Millilitern Zellen hinzu, die mit BSA rep gekennzeichnet sind. Eins. Tun Sie dies für alle neun Vertiefungen, bevor Sie die Kolben im 37 Grad Celsius heißen Inkubator schütteln. In der Zwischenzeit führen Sie Verdünnungen von den anfänglichen 27 Verdünnungen durch, indem Sie 100 Mikroliter des LB mit Bakterien aus dem Einor-Röhrchen eins nehmen und es zu den 900 Mikrolitern LB im Einor-Röhrchen hinzufügen.

Vier für die 10 bis minus dritte Verdünnung, verwerfen Sie die Filtersperrspitze für eine neue, bevor Sie 100 Mikroliter des LB mit Bakterien aus dem Einor-Rohr vier nehmen und es zu den 900 Mikrolitern LB im Eph-Rohr hinzufügen. Sieben für die Verdünnung von 10 bis minus vierte, setzen Sie die Verdünnung für alle Triplikate aller Replikationen aller Proteine und Behandlungen fort. Es sollten insgesamt 135 Röhrchen sein, sobald die Zellen gelegen haben.

Bringen Sie die Kultur auf 0,5 molare Natriumchloride, indem Sie fünf Milliliter aus einem fünfmolaren Natriumchlorid-Stamm hinzufügen und die Probe in eine beschriftete Zentrifugenflaschenzentrifuge bei 8.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius überführen. Anschließend wird der Überstand, der das Virus enthält, in ein sauberes, steriles 50-Milliliter-Falkenröhrchen umgefüllt. Geben Sie einige Tropfen Chloroform in den dekantierten Überstand im Falcon-Röhrchen.

Der Überstand kann bei vier Grad Celsius gelagert werden, für die nächste Runde der Affinitätsauswahl am dritten Tag, pipettieren Sie 250 Mikroliter VLT 5 4 0 3 Zellen aus vier Grad Celsius in jedes der zuvor vorbereiteten nummerierten Bo-Silikat-Reagenzgläser. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter aus der Verdünnung im Einor-Röhrchen in die 250 Mikroliter Zellen im Silikat-Reagenzglas. Eins. Die ersten fünf Zentimeter der Pipette kurz über der Flamme erhitzen und in den geschmolzenen oberen Bogen tauchen.

Ziehen Sie drei Milliliter hoch und geben Sie sie schnell in das Reagenzglas auf die Zellen und Phagen. Mischen Sie, indem Sie mit einem Finger schnippen, während Sie die Tube mit der anderen Hand halten, und gießen Sie dann den Inhalt auf den Teller. Kippen Sie die Platte und jagen Sie mit dem Reagenzglas Blasen und trockene Stellen, bis die gesamte Platte von der oberen Agros bedeckt ist.

Zum Abkühlen aufrecht auf die Bank stellen. Entsorgen Sie das Boros-Silikatrohr. Werfen Sie die Filtersperrspitze aus, holen Sie sich eine frische und fahren Sie fort, bis die gesamte Verdünnung plattiert ist.

Nehmen Sie vorbereitete Platten aus dem Inkubator, wenn sie erschöpft sind, aber nicht mehr als sechs auf einmal, sonst kühlen sie ab und das obere Agros verfestigt sich zu schnell, untersuchen Sie die auf den Platten gebildeten Plaques und entsorgen Sie die Platten mit konfluenter Lyse. Bestimmen Sie, welche der verbleibenden seriellen Verdünnungen ausreichend wenige Plaques erzeugt haben, um eine genaue Cali zu ermöglichen. Notieren Sie die Anzahl der Plaques aus diesen Platten und fahren Sie mit der Berechnung des Titers fort, wie im Textprotokoll am Ende der Affinitätsauswahl beschrieben. In der vierten Runde wählen Sie 18 einzelne, gut definierte Plaque-Kolonien mit einer sterilen gelben Pipettenspitze aus.

Befeuchten Sie die Innenseite der Spitze mit Trishydrochlorid pH 8,5 in einem Einor-Röhrchen. Dann entkernen Sie diese Plaques aus den Titterplatten, indem Sie die Spitze durch eine gut isolierte Plaque direkt in die darunter liegende Kunststoff-Petrischale schieben und den Kern aspirieren. Stoßen Sie den Kern in 100 Mikroliter Trishydrochlorid pH 8,5 in das entsprechende Röhrchen aus, bevor Sie es vortexen. Kurz gesagt, erhitzen Sie 20 Mikroliter von diesem Volumen bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten und fahren Sie mit PCR und Sequenzierung fort, wie im hier gezeigten Textprotokoll beschrieben. sind typische Titerergebnisse durch mehrmalige Probenahme, die endgültigen geschätzten Ergebnisse sind nicht so anfällig für Pipettierfehler und eine genauere Schätzung des tatsächlichen Titers und der Variation um diesen herum.

Die Schätzung von gut bis gut wird erhalten, wobei der Phagentiter bevorzugt für den nicht vergifteten Köder mit zunehmender Anzahl der Affinitätsauswahlrunden ansteigt. Bietet auch die Gewissheit, dass die Technik funktioniert. Die Beibehaltung eines zunehmenden Prozentsatzes von Phagen, die Einlage enthalten, in nicht vergifteten Köderschächten mit zunehmender Anzahl der Affinitätsselektionen ist auch nach fortgeschrittenen Runden der Affinitätsselektion vielversprechend.

Eine Erhöhung der Anzahl unabhängig voneinander gewonnener Phagen, die im Vergleich zur ersten Runde ein Insert aufweisen, und das Absetzen dieser Amplikons auf einigen identisch großen Banden ist ein guter Hinweis darauf, dass bestimmte Klone in der Affinitätsauswahl nach diesem Verfahren ausgewählt werden. Andere Methoden wie Ease Two Hybrid können durchgeführt werden, um die durch das Phagen-Display entdeckten Wechselwirkungen zu validieren.