Name: Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Erfahren Sie das Phagen-Display-Verfahren zur Identifizierung von Proteininteraktionen mit immobilisierten Ködermolekülen. Diese Methode ermöglicht effiziente Affinitätsselektion und Amplifikation spezifischer Interaktoren.

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Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011 bis 04375) und Sir Frederick McMaster-Forschungsstipendium, um ABD; Dieses Projekt wurde teilweise durch einen NSF IOS (0849230) gefördert.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Indem das Experiment in drei replizierten Vertiefungen, kann einzeln erfasst Phagen des gleichen Proteins, das an dem Köder zu unterscheiden, selbst wenn sie die gleichen Klon (dh kein Unterschied in der Nukleotidsequenz der CDS-Region, die erfasst worden ist, aber diese haben sich von unabhängigen Brunnen abgerufen). Ansonsten ist der einzige Weg, um unter den gleichen Phagen-Protein-Bindung an den Köder kodiert, zu unterscheiden, ob sie unabhängig voneinander revers transkribiert Regionen, die in einem Teil d...

Warum Phagen-Display-und Affinitätsselektion statt der unzähligen anderen für die Entdeckung und Untersuchung von Protein-Interaktionen mit anderen Molekülen verfügbaren Techniken? Phagen-Display kann einige einzigartige Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis von Protein-Ligand-Wechselwirkungen 1-3 einschließlich der folgenden aufweist: Sehr breite Repertoire der Köder Moleküle Der wichtigste Grund ist in der Vielfalt der Moleküle wirken kann als Köder in Affinitätsselektion 4. Phagendisplay ist ein sehr wirksames Mittel zur Isolierung von Protein-Fragmenten, die mit anderen Proteinen, Nukleotiden, Kohlenhydrate, etc. 5. Wesentlichen interagieren, wenn ein Polymer / Molekül kann an einen Träger gebunden erzielbaren werden kann, kann zur Affinitäts mit Phagen-Proteine ​​gescreent werden. Zusätzlich kann das Köder-Molekül zugegriffen, um festzustellen, ob es die biologische Aktivität beibehält, wenn sie immobilisiert 6 werden, wenn die Bedingungen verwendet werden, um reduce / eliminieren seine Tätigkeit wirksam sind 6 oder, post-translationale Modifikationen auf den Köder vor der Affinitätsselektion einzuführen. Phage Widerstand gegen äußere Faktoren Ein zweiter Grund für die Verwendung von Phagen-Display, ist, dass es möglich ist, dass einige Köder erfordern Umweltstress (Hitze, hohe Konzentrationen Osmolyten, spezifischen Kofaktoren, usw..), Um ihre wechselwirkende Proteine ​​zu erfassen, oder die Phagen-Proteine ​​müssen irgendwie verändert werden vor der Affinitätsselektion. Der primäre Faktor untersucht, ist die Wechselwirkung zwischen Köder und Protein, nicht die Bedingung, dass die Wechselwirkung auftreten können oder wenn es tödlich für den Testorganismus. Die T7-Phagen ist besonders gut geeignet für solche Studien, da es hart experimentellen Bedingungen sowohl intakt und lebensfähig zu widerstehen (z. B. die veröffentlichte thermische Maximum für T7 Lebensfähigkeit ~ 60 ° C 7). Als ein Beispiel des Änderns Phagen proProteine, bei der Prüfung der Arabidopsis thaliana Samen für Proteom-Proteinsubstraten der Reparatur-Enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferase (PIMT), das Virus in diesen Studien verwendet hatte &quot;gealtert&quot; war für eine Woche vor jeder Affinität Auswahlrunde, um die Einführung zu fördern von isoaspartate (isoAsp) Reste bei empfindlichen Proteine ​​6, die in Organismen, die erkennen und reparieren / verstoffwechseln solche Anomalien nicht möglich ist. Metabolisch inert Weiterhin werden die Phagen in der Regel resistent gegen Stoffwechselgiften und störende kleine Moleküle, die, zumindest, führen würde pleiotrope Wirkungen auf metabolisch aktive Testorganismen. Nach den Waschungen Stringenz wird das Gift, bevor eine große Menge von Bakterien zur Infektion eingeführt, das Gift ist auf einen Bereich um die Bakterien harmlos oder nachfolgenden Phagenreplikations verdünnt entfernt. Bei der Untersuchung der Protein-Targets PIMT ReparaturEnzym, S-Adenosylmethionin (AdoMet) wurde verwendet, um die Mikro-Titer-Platten-und immobilisierte Enzym zu aktivieren, um Zielprotein Abfangen zu ermöglichen, während sich auf S-Adenosyl Homocystein (AdoHcy) zur Inaktivierung des Enzyms und bieten eine nützliche Negativkontrolle sichern in das Wissen, dass das Virus nicht durch beider AdoMet oder AdoHcy 6 beeinflusst werden. Zusätzlich Mitglieder bestimmter spätEmbryoGenese Reichlich (LEA) Proteinfamilien, in diesem Labor untersucht, sind dafür bekannt, ihre Form in Gegenwart von Zusätzen wie Sucrose 8, die hohen Konzentrationen von 200 mM in Sojabohnensamen an dem Punkt erreichen kann, zu verändern physiologischer Reife 9. Das Virus wird nicht angenommen, dass durch Zugabe von 200 mM Saccharose in jeder Runde der Affinitätsselektion, möglicherweise für bestimmte LEA-Client-Protein-Wechselwirkungen erforderlich, was nicht der Fall autonom lebensfähigen Testorganismen 10 beeinflusst werden. Dieses Labor hat sich auf ENTDECKEN konzentriertG-Protein-Protein-Wechselwirkungen in reifen, dehydriert oder keimenden Samen, die den Mechanismus der gespeicherten Proteom Schutz während der Dehydratisierung 11 oder Reparatur von Komponenten des gespeicherten Proteom, die anfällig für isoAsp Bildung sind, wenn das Saatgut aufgesaugt 6 zugrunde liegen. Somit ist die Produktion und Aufreinigung der rekombinanten Proteine ​​als Köder in einem aktiven Zustand erforderlich ist, und sicherzustellen, dass sie so bleiben, bevor und nachdem sie immobilisiert werden, obwohl häufig schwierig ist, ist ein Grundpfeiler unserer Arbeit. Doch wie jedes rekombinante Proteinproduktion Szenario ist anders, die Optimierung der Bedingungen für die Produktion rekombinanter Proteine ​​wird hier nicht angesprochen werden. Die Benutzer werden aufgefordert, zu versuchen, wo immer möglich, zu bestimmen, ob das immobilisierte Protein noch funktionsfähig ist (z. B. wenn es ein Enzym, tun ein Enzym-Assay in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten). Dies wird etwas Vertrauen, dass der Köder ist biologisch aktiv und daher, dass alle entdeckten Wechselwirkungenetwas häufiger auf biologische Relevanz haben.

<table><tbody><tr><td>Trypton</td><td>Becton Dickinson Co.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>Genotyp: F- ompT hsdSB (rB> - mBgal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>Ampicillin, Natriumsalz</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS primärer Antikörper</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Alkali-Phosphatierungskonjugat</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-Nitrophenylphosphat</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP Grundierung</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr> <tr><td>Grundierung</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel-Extraktionskit </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 Zyklus-Sequenzierungskit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Inkubator Ofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten, 5 &#190; in</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Shield</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe, Nitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1,5 ml Röhrchen</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Borosilikatpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kulturröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, ELISA-Platten-Reader</td><td>Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finnland</td><td>Typ 362</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für die phagen-display-und affinity auswahl mit rekombinantem protein-köder

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Verwendung von rekombinanten Phagen als Gerüst, um verschiedene Proteinabschnitte durch eine richtungs klonierten cDNA-Bibliothek zu immobilisierenden Molekülen codiert Köder präsentieren, ist ein effizientes Mittel, um Wechselwirkungen zu entdecken. Die Technik wurde weitgehend verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken, sondern der Köder-Molekül in Frage gestellt werden muss nicht auf Proteine ​​beschränkt. Die hier vorgestellten Protokoll optimiert worden, damit eine bescheidene Anzahl von Ködern in Replikaten gescreent werden, um die Identifizierung der unabhängigen Klonen da er das gleiche Protein zu maximieren. Dies ermöglicht eine größere Zuversicht, dass interagierende Proteine ​​identifiziert sind legitime Interaktoren des Köders Molekül. Die Überwachung der Phagen-Titer nach jeder Affinität Auswahlrunde bietet Informationen darüber, wie die Affinitätsselektion voran sowie auf die Wirksamkeit der negativen Kontrollen. Ein Mittel zum Titrieren der Phagen und wie und was zu im Voraus vorzubereiten, damit dieser Prozess so effizient wie Fortschrittemöglich ist, wird dargestellt. Attribute abgerufen Amplikons nach der Isolierung von unabhängigen Plaque werden hervorgehoben, die verwendet werden können, um festzustellen, wie gut die Affinitätsselektion fortgeschritten ist. Fehlerlokalisierungstechniken, Fehlalarme zu minimieren oder zu umgehen anhaltend erholt Phagen werden erläutert. Mittel zur Reduzierung der viralen Kontamination aufflammen werden diskutiert.

Die Möglichkeit, die Kapazität des Köders mit Phagen präsentierten Proteinen interagieren (metabolisch Vergiftung der Köder) beeinträchtigen eine starke negative Kontrolle für diese Technik. Es ist auch ratsam, um zu bestimmen, wenn der Köder, wenn sie auf die Mikrotiterplatte gebunden ist, behält seine Funktion. Beide Prüfungen werden das Vertrauen, das die Interaktion, auf Phagen-Proteine ​​durch die nonpoisoned Köder erholt sind legitim zu erhöhen. Probenahme drei dreifach aus jeder Verti...

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteinwechselwirkungen mit immobilisierten Lockstoff-Molekülen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Lockstoff gewonnen und immobilisiert wird. Im zweiten Schritt wird die zu untersuchende Phagenbibliothek unter Bindungsbedingungen dem Lockstoff zugegeben.Anschließend werden die nicht gebundenen Phagen durch strenge Waschschritte entfernt. Die gebundenen Phagen hingegen werden verwendet, um die Bakterien zu infizieren, bevor sie gewonnen werden. Der letzte Schritt besteht darin, die gebundenen Phagen für die nächste Runde der Affinitätsselektion zu amplifizieren.Letztlich werden, wenn die Phagentiterkurve ein Plateau erreicht, einzelne Plaques ausgewählt und sequenziert, um nachzuweisen, welche Proteine die höchste Affinität für das immobilisierte Folgeprotein unter den experimentellen Bindungsbedingungen aufweisen. Dieser Prozess kann helfen, zentrale Fragen zu Protein-Protein-Interaktionen zu beantworten. Das Verfahren beginnt damit, dass gereinigtes rekombinantes Protein gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung in die Mulden von Mikrotiterplatten gegeben wird.Der nächste Schritt besteht darin, 50 Milliliter Luria-Burani-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit einer einzelnen Kolonie zu beimpfen, die zuvor wie im Textprotokoll beschrieben angezüchtet wurde, und bei 37 Grad Celsius, 200 U/min in einem horizontalen Schüttler zu inkubieren. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Zelldichte zu überwachen, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 bis 0,6 erreicht ist. Gießen Sie anschließend die Zellen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen oder ein ähnliches Gefäß und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Verwendung. Die Zellen bleiben normalerweise etwa eine Woche lang vital. Am ersten Tag bereiten Sie alles für die Affinitätsselektion vor, wie im Textprotokoll beschrieben, am Morgen des zweiten Tages.Stellen Sie neun leere Autoklav-250-Milliliter-Erlenmeyerkolben in die Halterungen eines Inkubationsschüttlagers und impfen Sie 500 Milliliter Lal-Burani mit 500 Mikrolitern aus einer der am Vortag angesetzten Übernachtkulturen von Phagen-infizierten BLT 5 4 0 3-Zellen. Nachdem Sie den Kolben in den Inkubator gestellt haben, schalten Sie das Spektrophotometer ein und stellen es so ein, dass es die Absorption bei 600 Nanometern misst. In der Zwischenzeit nehmen Sie die Mikrotiterplatte aus dem 4-Grad-Celsius-Kühlschrank und entfernen die Plastikfolie. Entfernen Sie jegliches nicht gebundene Protein von der Platte, indem Sie die Platte zehnmal mit jeweils 200 Mikrolitern pro Mulde von 1× Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,5, waschen und die Platte zwischen den Waschschritten kopfüber auf ein Papiertuch schlagen.Blockieren Sie mit 200 µL pro Mulde einer 5 %igen Blockierlösung in TBS für eine Stunde. Während die Platte in Parafilm eingewickelt ist, waschen Sie die Blockierungslösung 10-mal mit jeweils 200 µL 1× TBS-T ab, wobei Sie die Platte zwischen den Waschschritten verkehrt herum auf vier Lagen Papier handtuchtrocknen.Von hier aus Barrierespitzen verwenden, um eine Kreuzkontamination mit Phagen zu vermeiden. 100 Mikroliter der Phagenbibliothek mit den Proteinen pipettieren. Die Platte erneut mit Parafilm verschließen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Nach einer Stunde die Plastikfolie von der Platte entfernen und unverzüglich den Phagen durch Schütteln in den biologischen Abfall entsorgen. Anschließend mit einer Mehrkanalpipette schnell 200 µL eines X-T-B-S-T in jedes Loch geben. Stellen Sie einen Timer auf eine Minute.Nach einer Minute den Puffer in den biohazard-Müll ausschütten, das Plättchen verkehrt herum auf ein Papiertuch schlagen und zurück auf den Arbeitsplatz stellen. Wiederholen Sie die Waschschritte nach dem 10. Waschgang insgesamt zehnmal. Nehmen Sie 200 Mikroliter BLT 5 4 0 3-Zellen aus dem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen bei vier Grad Celsius und übertragen Sie diese jeweils auf den Boden der neun Vertiefungen, aus denen der letzte Waschschritt entfernt wurde.Verpacken Sie die Platten in Frischhaltefolie und stellen Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit eventuell noch an dem Köder haftende Phagen am Ende der 20 Minuten die Bakterien infizieren können. Entfernen Sie die Folie von den Platten. Entnehmen Sie danach 10 Mikroliter Bakterien aus dem BSA bei 25 Grad Celsius, aus einer Welle der Replikation, und übertragen Sie diese in 990 Mikroliter Medium, das als eins gekennzeichnet ist.Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal für dieses Well, sodass drei Triplikate einer 1:100-Verdünnung des Phagen aus diesem Well entstehen – dies ist die BSA-Replikation eins, dreimal entnommen. Diese Verdünnungen werden verwendet, um die durchschnittliche Titerkonzentration zuzüglich oder minus dem Standardfehler des Mittelwerts für diese Replikation von BSA zu schätzen. Führen Sie dasselbe für Replikation zwei und drei von BSA sowie für die drei replizierten Wells des vergifteten Bait-Proteins und für das Bait-Protein durch. Stellen Sie diese 27 EOR-Röhrchen beiseite. Wenn sich die Bakterien im Kolben bei einer optischen Dichte von 0,6 bis 1,0 befinden, gießen Sie 50 Milliliter der Zellen aus dem Fern-Fläschchen in jedes der 9 Erlenmeyerkolben mit 250 Milliliter Inhalt. Nehmen Sie die verbleibenden 170 µL phageninfizierter BLT5403-Bakterien aus dem BSA-Replikations-Well und geben Sie diese zu den 50 mL Zellen, die als BSA Rep.Eins gekennzeichnet sind. Wiederholen Sie dies für alle neun Wells, bevor Sie die Kolben im 37 °C-Inkubator schütteln. In der Zwischenzeit führen Sie Verdünnungen aus den anfänglichen 27 Verdünnungen durch, indem Sie 100 µL LB mit Bakterien aus dem Einor-Röhrchen eins nehmen und zu den 900 µL LB im Einor-Röhrchen hinzufügen.Vier für die 10 hoch minus drei Verdünnung, verwerfen Sie die Filtertipp-Spitze und verwenden Sie vor dem Einbringen von 100 Mikrolitern des LB mit Bakterien aus dem Eppendorf-Röhrchen vier in das 900 Mikroliter LB in Eppendorf-Röhrchen sieben eine neue Spitze. Für die 10 hoch minus vier Verdünnung fahren Sie mit der Verdünnung für alle Triplikate aller Replikationen aller Proteine und Behandlungen fort. Insgesamt sollten es 135 Röhrchen sein, sobald die Zellen lysiert haben.Bringen Sie die Kultur durch Zugabe von fünf Milliliter einer fünf Molaren Natriumchlorid-Standardlösung auf 0,5 Molare Natriumchlorid und überführen Sie die Probe in eine beschriftete Zentrifugenflasche. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 8.000 × g und vier Grad Celsius. Danach gießen Sie das überstehende Viren enthaltende Überstand in ein sauberes, steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie einige Tropfen Chloroform zum abgegossenen Überstand im Falcon-Röhrchen hinzu.Das Überstand kann bei vier Grad Celsius für die nächste Runde der Affinitätsselektion am dritten Tag aufbewahrt werden; pipettieren Sie 250 Mikroliter VLT 5 4 0 3-Zellen von vier Grad Celsius in jedes der zuvor vorbereiteten nummerierten Bo-Silikat-Reagenzgläser. Danach pipettieren Sie 100 Mikroliter aus der Verdünnung im Einor-Röhrchen eins in die 250 Mikroliter Zellen im Bur-Silikat-Reagenzglas.Eins. Erhitzen Sie kurz die ersten fünf Zoll der Pipette über der Flamme und tauchen Sie sie in die geschmolzene Top-Aros. Ziehen Sie drei Milliliter auf und geben Sie sie schnell in das Reagenzglas auf die Zellen und den Phagen. Mischen Sie durch leichtes Anschlagen mit einem Finger, während Sie das Reagenzglas mit der anderen Hand halten, und gießen Sie anschließend den Inhalt auf die Platte. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie das Reagenzglas, um Blasen und trockene Stellen zu beseitigen, bis die gesamte Platte mit dem oberen Agaroseüberstand bedeckt ist.Stellen Sie es aufrecht auf dem Pult zum Abkühlen beiseite. Entsorgen Sie die Borosilikat-Röhre. Entfernen Sie die Filter-Spitze und nehmen Sie eine neue, um fortzufahren, bis alle Verdünnungen ausplattiert wurden.Holen Sie die vorbereiteten Platten je nach Bedarf aus dem Inkubator, jedoch nicht mehr als sechs gleichzeitig, da sie sonst abkühlen und das obere Agar zu schnell erstarrt. Untersuchen Sie die auf den Platten gebildeten Plaques und entsorgen Sie jene mit konfluenter Lyse. Bestimmen Sie, bei welchen der verbleibenden seriellen Verdünnungen die Anzahl der Plaques ausreichend gering ist, um eine genaue Zählung zu ermöglichen. Notieren Sie die Anzahl der Plaques auf diesen Platten und berechnen Sie die Titer gemäß der schriftlichen Anleitung am Ende der Affinitätsselektion. Runde vier: Wählen Sie 18 einzelne, gut abgegrenzte Plaque-Kolonien unter Verwendung einer sterilen gelben Pipettenspitze aus.Befeuchten Sie die Innenseite der Pipettenspitze mit Tris-Hydrochlorid, pH 8,5, in einem Eppendorf-Röhrchen. Entnehmen Sie dann die Kolonien von den Titrierplatten, indem Sie die Spitze durch eine gut isolierte Kolonie hindurch bis zum darunterliegenden Kunststoff-Petri-Schale drücken und den Kolonieabdruck aufsaugen. Geben Sie den Abdruck in 100 Mikroliter Tris-Hydrochlorid, pH 8,5, in das entsprechende Röhrchen und wirbeln Sie kurz. Erhitzen Sie anschließend kurz 20 Mikroliter dieser Lösung 10 Minuten lang auf 65 Grad Celsius und führen Sie danach die PCR und Sequenzierung gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren durch. Typische Titrierergebnisse werden hier dargestellt. Durch mehrfache Stichproben entstehen Endwerte, die weniger anfällig für Pipettierfehler sind und eine genauere Schätzung des tatsächlichen Titers sowie der zugehörigen Variabilität ermöglichen.Die Schätzung von Brunnen zu Brunnen ergibt eine zunehmende Phagentiterung, vorzugsweise für den nicht vergifteten Köder, während die Anzahl der Affinitätsselektionsrunden steigt. Dies liefert zudem Vertrauen, dass die Technik funktioniert. Die Beibehaltung eines zunehmenden Prozentsatzes an Phagen mit Insert in den Brunnen des nicht vergifteten Köders, während die Anzahl der Affinitätsselektionen steigt, ist ebenfalls vielversprechend nach fortgeschrittenen Runden der Affinitätsselektion.Ein Anstieg der Anzahl unabhängig gewonnener Phagen, die ein Insert enthalten, im Vergleich zur ersten Runde sowie das Auftreten dieser Amplifikate in wenigen gleich großem Bandmuster ist ein guter Hinweis darauf, dass bestimmte Klone bei der Affinitätsselektion nach diesem Verfahren gezielt angereichert werden. Weitere Methoden wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Test können durchgeführt werden, um die durch Phag-Display entdeckten Wechselwirkungen zu validieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Protein-Interaktion Assay entwickelt, um systematisch Bildschirm für neue extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Paare in der Zellerkennung Prozessen beteiligt sind. Es ist speziell entwickelt, um transienten Protein-Interaktionen, die schwer zu identifizieren, die mit anderen hohen Durchsatz Ansätze sind zu erkennen.

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

In diesem Video demonstrieren wir die Phagen-Display-Technik, um vorgefertigte Phagen zu isolieren, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein exprimieren.

Verwendung des Phagen-Displays zur Auswahl von Proteinen mit hoher Affinität zu einem Zielprotein

Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken ist eine bewährte Technik für Entdeckung von Peptid Affinität Reagenzien, eine robuste Alternative zu Antikörpern. Die halbautomatische Sortiermethode hierin wurde gestrafft, Biopanning um das Auftreten von Fehlalarmen zu verringern. Hier zeigen wir den Denkprozess und Techniken Bewertung der Kandidaten und nachgelagerte Analyse zu minimieren.

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

Hier stellen wir eine Methode zur Auswahl neuartiger Varianten der E. coli-Biotin-Proteinligase BirA vor, die ein bestimmtes Zielpeptid biotinylatiert. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Plasmids zur bakteriellen Darstellung des Zielpeptids, die Erzeugung einer BirA-Bibliothek, die Auswahl und Charakterisierung von BirA-Varianten.

Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme

Die Schaffung chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme mit gewünschter Affinität und Spezifität für einen bestimmten kleinen Molekülligand hätte viele biologische Sensor- und Betätigungsanwendungen. Hier beschreiben wir eine effiziente, verallgemeinerbare Methode zur de novo Engineering von chemisch induzierten Dimerisierungssystemen durch die schrittweise Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Ein-Domänen-Antikörperbibliothek.

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methodik zur Messung von Isolevuglandinen in Geweben durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von alkalischen Phosphatase-konjugierten ScFv D11-Antikörpern vor. Bluthochdruckmodelle sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen werden verwendet, um die Schritt-für-Schritt-Verfahren und grundlegenden Prinzipien der Isolevuglandin-Messung in Gewebeproben zu erklären.

Direkter Nachweis von Isolevuglandinen in Geweben mittels eines D11 scFv-alkalischen Phosphatase-Fusionsproteins und Immunfluoreszenz

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

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Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

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