Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Gen-Targeting-Vektoren durch Sub-Klonierung plus Insertion zu konstruieren. Dies wird erreicht, indem der Rücken, der E-coli enthält, mit einem rekombinierenden Plasmid transformiert wird. Der zweite Schritt umfasst die Erzeugung asymmetrischer phosphorolierter Insertionskassetten und die Subklonierung von Plasmiden durch Polymerase-Kettenreaktion.

Nach der Zugabe von Arabinose werden die GBAA-Rekombinationsproteine exprimiert und die terminale modifizierte Insertionskassette und das subklonierende Plasmid elektroporiert. Die gewünschte DNA-Sequenz wird gleichzeitig von hinten gefangen und mit der Insertionskassette in das subklonierende Plasmid modifiziert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Standardrekombination besteht darin, dass die Konstruktion von Gen-Targeting-Vektoren in einer einzigen Reaktion durchgeführt werden kann.

Design von Oligos für die Insertionskassette und das Subklonierungsplasmid zu beginnen, entwerfen Sie jedes Oligo so, dass es 180 Basenpaar-Homologiearme enthält, die die genomische Zielstelle flankieren, und 20 Basenpaare, eine spezifische Priming-Sequenz für die Insertionskassette oder das Subklonierungsplasmid. Bestimmen Sie als Nächstes die Ausrichtung des genomischen DNA-Inserts des Back-Klons mit einem webbasierten Tool wie clone db. Legen Sie die Richtung der Replikation von oder ES fest, indem Sie die Karte des Backplasmid-Backbones überprüfen, das in der Back-Position verwendet wird.

Bibliothekskonstruktion, fügen Sie zwei terminale Phospho-Acht-Bindungen hinzu, also das fünfprimige Ende des Oligos, das der Replikationsrichtung auf dem hinteren Klon entgegengesetzt ist. Als nächstes fügen Sie dem Reverse-Oligo eine Fünf-Prime-Phosphatmodifikation hinzu. Stechen Sie zunächst eine sterile Pipettenspitze in die hintere Agarkultur und impfen Sie 5,0 Milliliter Odbrühe.

Wachsen Sie die Kultur fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Als nächstes kühlen Sie 10% ige Glycerinlösung, Mikrozentrifuge, Röhrchen und Elektroporation, Küvetten auf Eiskühler, gekühlte große Zentrifuge und Mikrozentrifuge auf vier Grad Celsius. Bestimmen Sie nach der Inkubation die optische Dichte der Kultur mit einem Spektralphotometer.

Messung der Absorption. Bei 600 Nanometern. Bereiten Sie die elektrokompetenten Zellen vor, wenn ein OD 600-Messwert von 0,3 bis 0,8 erreicht wird.

Wenn die Kultur fertig ist, schleudern Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen herunter. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter gekühltem 10%igem Glycerin und schleudern Sie erneut. Führen Sie diese Waschschritte insgesamt dreimal durch.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern und fügen Sie 10 bis 200 Nanogramm des rekombinierenden Plasmids hinzu. Erhalten Sie eine einzelne Zellsuspension, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und die Zellen dann in eine Pre-Chill-Elektroporation überführen. Vete. Legen Sie dann das Vete in ein Elektroporationsgerät und betreiben Sie die Zellen sofort mit Elektro, gewinnen Sie die Zellen in einem Milliliter LB zurück und übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Züchten Sie die Rückenkultur zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Geben Sie nach dieser Zeit neun Milliliter LB in die wiedergewonnene Kultur. Wachsen Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 200 U/min, um die Homologiearme in die Insertionskassette und das Subc-Klonierungsplasmid einzubauen.

Führen Sie die PCR mit den zuvor hergestellten langen modifizierten Oligos durch. Alternativ können Sie das Plasmid-Template mit einem Restriktionsenzym linearisieren und ein Enzym auswählen, das außerhalb des PCR-Amplifikationsbereichs schneidet und durch Hitze aktiviert wird. Richten Sie die PCR mit einem High-Fidelity-Hot-Start-DNA-Polymerase-System ein.

Bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor und führen Sie thermische Zyklen gemäß Best Practices durch. Nach der Reaktion werden PCR-Produkte mittels AROS-Gelelektrophorese analysiert. Laden Sie ein bis fünf Mikroliter jeder PCR auf ein 1%aros-Gel.

Als nächstes reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem PCR-Aufreinigungskit. Quantifizieren Sie die PCR-amplifizierte DNA anhand eines bekannten Satzes von DNA-Standards oder mit einem NanoDrop-Spektralphotometer. Nach einer Inkubation über Nacht verdünnen Sie die hintere GBAA-Kultur 50-fach und bereiten Sie eine separate Kultur für eine Negativkontrolle vor.

Züchten Sie die verdünnten Kulturen bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min für eine Stunde und 50 Minuten. Kühlen Sie anschließend alle rekombinierenden Materialien und Geräte auf vier Grad Celsius ab, wie bereits gezeigt. Bereiten Sie eine OSE-Lösung mit 10 % Gewicht pro Volumen vor und sterilisieren Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter.

Wenn der OD der Rückenkultur das gewünschte Niveau erreicht, fahren Sie mit der Induktion der rekombinierenden Proteine fort. 200 Mikroliter der 10%igen arabischen Lösung zu 10 Millilitern der Rückenkultur hinzufügen, um eine endgültige Absorptionskonzentration von 0,2% zu erreichen. Fügen Sie eine nicht induzierte Kultur hinzu, die als Negativkontrolle verwendet wird. Überführen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator und induzieren Sie 45 Minuten lang eine rote Expression unter Schütteln bei 230 U/min.

Schleudern Sie die Zellen herunter und waschen Sie sie dreimal mit 10 % Glycerin, wie zuvor gezeigt, bei 600 bis 1000 Nanogramm. Jede der Insertionskassetten und das Subklonierungsplasmid für die Rekombinationsreaktion umfassen nur einen Vektor und einen Vektor plus eine Einzelinsert-Steuerung, um die Rekombinationsfähigkeit und Integrität des Vektors zu überprüfen. Besorgen Sie sich als Nächstes eine einzellige Suspension und betreiben Sie die Zellen wie zuvor gezeigt mit Elektro

Ermöglicht die Wiederfindung in LB-Medien bei 37 Grad Celsius für eine Stunde für Mehrfachkopie-Plasmide oder in 10 lb bei 37 Grad Celsius für drei Stunden für Rückvektoren. Führen Sie verschiedene Verdünnungen mit der wiedergewonnenen Kultur bei Doppelselektion durch. Agar bitte und bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden anbauen.

Wenn Sie fertig sind, pflücken Sie die Kolonien in fünf Milliliter LB, die das selektive Antibiotikum enthalten, und züchten Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes ein Säulenaufreinigungskit, um Mini-Prep-DNA herzustellen, führen Sie das entsprechende Restriktionsenzym ein und identifizieren Sie dann die Klone, die die erwarteten Fragmentgrößen enthalten, durch Gelelektrophorese. Führen Sie abschließend eine DNA-Sequenzierung über die Homologiearme und die Insertionskassette durch, um nach Fehlern bei der Oli-Photosynthese zu suchen.

In diesem Beispiel zeigte die Restriktionsverdauungsanalyse von P zwei RX ein EYFP-Insert, das Klone enthielt, das erwartete Muster, was darauf hindeutet, dass sie den korrekt assemblierten Knockin-Vektor enthalten. Dieses Schema veranschaulicht das Konzept des Bact-Trimmens. Die Subklonierung plus Insertionsanalyse von PCR-Produkten bestätigte, dass die Kassetten korrekt eingebaut wurden.

Darüber hinaus wurde bei der Analyse positiver Rückklone nach Zugabe des entsprechenden Restriktionsenzyms das erwartete Muster erhalten. Die Restriktionsverdauungsanalyse von 12 besagten R SR zwei SBI-Klonen zeigte bei der Mehrzahl der Rekombinanten eine korrekte Vektorassemblierung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe von Sub-Klonierung plus Insertion schnell Gen-Targeting-Vektoren konstruieren können.