Name: Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Lernen Sie die Subklonierung Plus-Insertion-Methode zur schnellen Konstruktion von Gentargeting-Vektoren in E. coli. Diese Technik ermöglicht die effiziente Erzeugung von Insertionskassetten in einer einzigen Reaktion.

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T.R.R konzipierte das Projekt, entwarf und führte Experimente durch und bereitete das Manuskript vor. E.J.K. und S.E.M. führten Experimente durch. Alle Autoren haben intellektuell zum endgültigen Manuskript beigetragen. Diese Arbeit wurde durch ein Innovation Fellowship der University of Leicester für SEM und durch ein Senior Research Fellowship des UK Medical Research Council (MRC) für S.M.C (MR/J009202/1) finanziert. Die DNA-Sequenzierung wurde von Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester, durchgeführt. Wir danken A. Francis Stewart für die Bereitstellung der Rox- und Dre-Plasmide. Die Plasmide pL451 und pL452 wurden vom National Cancer Institute (NCI) in Frederick, USA, bezogen.

1. Gene Targeting Design- <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestellen Sie eine entsprechende BAC-Klon für den genomischen Region von Interesse. Damit dies isogen zu der Art von ES-Zellen zu modifizieren zB werden RPCI-23 und-24 RPCI BAC-Klone zur Gen-Targeting mit C57BL / 6-ES-Zellen. </li><li> Bewerben konventionellen Gen-Targeting-Kriterien bei der Gestaltung des Targeting-Vektors. Wichtige Parameter sind, ob die Änderung erforderlich ist konstitutiv oder bedingte zu sein, die Definition kritischer Exons (CE) zum Löschen in einem Gen-Knockout-Strategie und den Abstand und die Anordnung der Intron-Kassetten. Hinweis: Jeder von ihnen ist im Detail an anderer Stelle 10 diskutiert. </li><li> Wählen genomischen Regionen jeweils von 5-6 kb flankieren das Ziel Modifikationsstelle. HINWEIS: Die Größe des subklonierten Einsatz ist daher typischerweise 10-12 kb, obwohl die obere Grenze kann so hoch wie 80 kb mit einer niedrigen Kopien Subklonierung Plasmid p15A dergleichen sein, pBR322 usw. und bis zu 200 kb einer BACVektor. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Design-Oligos zur Plasmidrückgrat (Subklonierung Plasmid) und den selektierbaren Marker (Insertionskassette). Entwerfen jedes Oligos, daß er 180 bp HA flankierenden genomischen Zielstelle und 20 bp der spezifischen Anfangssequenz des Einschubkassette oder Subklonieren Plasmid (Figur 2) enthält. HINWEIS: Homologiearme sollten keine sich wiederholenden Elemente enthalten, werden Vorhandensein von repetitiven Elementen in falscher Ausrichtung und Subklonierung führen. Repetitive Elemente können mit Web-basierte Tools wie die &#39;&#39; Wiederholen Masker &#39;&#39; erkannt werden. </li><li> Umfassen eine einzigartige Restriktionsenzym (RE) vor Ort auf eine der Vektor Oligos, die Gen-Targeting-Vektor für die ES-Zell-Targeting (Abbildung 2) zu linearisieren. </li><li> Überprüfen Oligo Parameter unter Verwendung eines Oligo Analyzer Programm. Achten Sie darauf, Sekundärstrukturen in der Primerregion zu vermeidens. </li><li> Kürzere HA (50 bp) der Einschubkassette wird toleriert und führt zu geringeren Anzahl von Rekombinanten jedoch sicherzustellen, dass die Subklonierung Plasmid HA immer mehr (180 bp). </li><li> Bestimmen Sie die Ausrichtung der genomischen DNA-Inserts des jeweiligen BAC-Klon mit Web-basierte Tools wie &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Stellen Sie die Richtung der Replikation von Oris, indem Sie die Karte von der BAC Plasmidrückgrat im BAC-Bibliothek Konstruktion. HINWEIS: Oris ist in der Regel gegenüber dem Transkriptionsrichtung des Chloramphenicol (Chl) Marker für alle gängigen BAC-Plasmide. </li><li> Hinzufügen zwei terminalen Phosphorothioat (PTO) Bindungen an das 5&#39;-Ende des Oligos, die entgegengesetzt zu der Richtung der Replikation auf dem BAC-Klon ist. Hinzufügen eines 5&#39;-Phosphat Modifikation der Rückwärts Oligo (Abbildung 2). HINWEIS: Die asymmetrische phosphorthioiertes PCR-Kassette auf Red Verdauung erzeugt ss-DNA-Zwischenprodukt, das die Hauptverzögerungsstrang kannder Replikationsgabel. HINWEIS: Maximal Multiplex Rekombinationsfrequenz mit den Folgestrangs geschützt Kassetten beobachtet. Führende Strang geschützt oder Dual geschützt Kassetten können gleichwertige Rekombination Effizienz irgend loci nicht zu produzieren. </li><li> Bestellen Oligos mit PAGE oder HPLC-Reinigung. </li></ol> 3. BAC Klon Transformation mit pSC101 BADgbaA Recombineering Plasmid. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Um die E. machen coli-Stamm mit dem BAC Rekombination beherrschen, verwandeln es mit der pSC101 BADgbaA Plasmid, das die Red Gene 16. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid enthält die Rot-RecA-Gene unter der Kontrolle des Arabinose-induzierbaren araC-P BAD-Promotor, ein Tetracyclin-Selektionsmarker und dem temperaturempfindlichen pSC101-Replikon. <ol><li> Erstechen eine sterile Pipettenspitze in der BAC-Agar-Kultur und impfen 5,0 ml LB-Medium (LB), pH 8,0, 12,556; g ml -1 Chl. Wachsen bei 37 ° C für 5 Stunden unter Schütteln bei 200 rpm. </li><li> Kühlen Sie 10% (v / v) Glycerin-Lösung, Mikrozentrifugenröhrchen und Elektroporationsküvetten auf Eis. Kühlen eines gekühlten große Zentrifuge und Mikro bis 4 ° C. </li><li> Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur mit einem Spektralphotometer und Messung der Extinktion bei 600 nm. Bereiten elektro Zellen (wie unten beschrieben), wenn ein OD 600 Lesung von 0,3 bis 0,8 erreicht wird. </li><li> Spin down Zellen in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in einer großen Zentrifuge bei 1.216 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wash-Zellen mit 1 ml gekühltem 10% Glycerin und Spin-down-Zellen bei 17.949 × g für 20 sec bei 4 ° C. Führen Sie den Waschschritt insgesamt 3 mal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 ul 10% Glycerin und fügen 10-200 ng der Plasmid pSC101 BADgbaA Rekombinationstechnologie. Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Pipettierennach oben und unten mehrere Male und dann übertragen Sie die Zellen in ein vorgekühltes 1 mm Lücke Elektroporationsküvette. </li><li> Elektroporation der Zellen mit einem Wert von 1,8 kV, 25 &amp; mgr; F und 200 Ω. HINWEIS: Überprüfen Sie die richtigen Einstellungen für jede Marke von Elektroporator. Eine Zeitkonstante der Elektroporation unter 4 zeigt die Anwesenheit von Salz und anderen Verunreinigungen. </li><li> Der Zellen sofort erholen in 1 ml LB und Übertragen der Zellen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wachsen die BAC GBAA Kultur bei 30 ° C für 2 Stunden unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die pSC101 BADgbaA Plasmid verloren, wenn die Zellen bei 37 ° C aufgrund der Inaktivierung des temperaturempfindlichen RepE Replikationsfaktor gezüchtet. Wachsen GBAA Zellen bei 30 ° C, um die Rekombination Funktionen aufrecht zu erhalten. </li><li> In 9 ml LB, die 12,5 &amp; mgr; g ml -1 Chl und 4 ug ml -1 Tetracyclin (Tet) auf den wiederhergestellten BAC GBAA Kultur. Wachsen dieBAC GBAA Kultur O / N bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Transformationseffizienz von Elektroporation der supercoiled Plasmid GBAA ausreichend hoch ist, um eine Sättigung Wachstums O / N in flüssigen Medien zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Insertion Kassetten und Subklonierung Plasmide <ol style="margin-left: 40px;"><li> HA in die Einschubkassette (n) und die Subklonierung Plasmid einzubauen, führen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der langen modifizierten Oligos, wie unten beschrieben. <ol><li> Optional: Plasmid Verschleppung in die Rekombination Reaktion zu vermeiden, verwenden Sie ein R6K Herkunft oder ähnlich engen Wirtsbereich Plasmidmatrize die Insertionskassette verstärken. </li><li> Alternativ Arisierung der Plasmid-Vorlage mit einem RE-Digest (Tabelle 2). Wählen Sie ein RE, die außerhalb der PCR-Amplifikation Region schneidet und hitzeinaktiviertem. Hitze inaktiviert die RE wie vom Hersteller, Produzent empfohlenacturer. </li><li> Einrichten der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines High-Fidelity DNA Polymerase hotstart Systems. Bereiten Sie ein PCR-Mastermix so detailliert (Tabelle 3). Führen Temperaturwechsel, wie dargestellt (Tabelle 3). </li></ol></li><li> Analyse der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Last 1-5 ul jeder PCR auf ein 1% (w / v) Agarosegel, das 0,5 mg ml -1 Ethidiumbromid (EtBr). HINWEIS: Die Anwesenheit von nicht-spezifischen Amplifikationsprodukte nicht in der Rekombinationstechnologie Reaktion stören. In einigen Fällen jedoch können Primer-Dimere Rekombinationstechnologie Effizienz verringern. </li><li> Reinige PCR-Produkte unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits. <ol><li> Optional: Entfernen Sie die Plasmidmatrize von PCRs durch Behandlung mit DpnI gefolgt von PCR-clean-up. Eluieren der DNA in einem minimalen Volumen von sterilem, deionisiertem Wasser (wie vom Hersteller empfohlen). HINWEIS: Die Zugabe von DpnI zu PCR-Reaktionen führt zu einer verringerten Effizienz der Spaltung von th ungereinigteme methylierte Plasmid-DNA-Vorlage. </li></ol></li><li> Quantifizierung PCR amplifizierte DNA durch Agarose-Gel-Analyse gegen einen bekannten Satz von DNA-Standards zB λ HindIII Verdau oder durch Verwendung eines ND-Spektrophotometer. </li></ol> 5. Subklonierung Plus-Insertion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verdünnen Sie die O / N BAC GBAA Kultur 50-fach durch Zugabe von 200 ul in 10 ml LB + Chl + Tet. Wachsen bei 30 &#160; ° C unter Schütteln bei 200 Upm für 1 h 50 min. Gehören Probe als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Kühlen aller Rekombinationstechnologie Materialien und Ausrüstung auf 4 ° C, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben. </li><li> Gießen LB Agar pH 8 Platten, die das korrekte Konzentration des geeigneten selektiven Antibiotikums (en), die die Auswahl des DNA-Fragments, das für die Auswahl der Subklonierungsvektor (Tabelle 4) sowie eingeführt wird ermöglicht. HINWEIS: Einige Antibiotika sind pH-empfindlich. Verwenden LBAgar pH 8 in der Regel. </li><li> Eine 10% ige (w / v) Lösung von L-Arabinose. Filtersterilisieren durch einen 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter. HINWEIS: Arabinose induziert die Expression der Proteine ​​von der Rekombination GBAA Plasmid. </li><li> Überprüfen Sie die OD der BAC GBAA Kultur mit einem Spektralphotometer. Sobald eine OD600 von 0,25-0,3 erreicht ist, induzieren die Rekombination Proteinen wie im folgenden Schritt beschrieben. </li><li> Gib 200 ul der 10% Arabinose Lösung auf 10 ml der BAC Kultur bis zu einer Endkonzentration von Arabinose von 0,2% zu erreichen. Gehören nicht-induzierten Kultur (ohne Arabinose), die als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die BAK-Kultur zu einem 37 &#160; ° C Schüttelinkubator und induzieren Red Ausdruck für 45 min Schütteln bei 230 Umdrehungen pro Minute. HINWEIS: Die Expression von Red Proteine ​​ineffizient bei 30 ° C. </li><li> Spin down Zellen und wäscht mit 10% Glycerin 3-mal, wie in Schritt 3.1.5 beschrieben. </li><li> Fügen 600-1,000 ng von jedem der Subklonierung Plasmid und die Insertion Kassette (n) zu der Rekombinationstechnologie Reaktion. Fügen Sie einen Vektor nur und Vektor plus Einzeleinsatz steuert, um die Rekombination Kompetenz und Integrität des Vektors und den Kassetten zu überprüfen. </li><li> Besorgen Sie sich eine Einzelzellsuspension durch Auf- und Abpipettieren. Führen Elektroporation in Schritt 3.1.7 und anschließende Erholung in 1 ml LB bei 37 ° C für 1 Stunde für Multi-copy Plasmiden oder in 10 ml LB 3 h für BAC-Vektoren beschrieben, bei 37 ° C. </li><li> Platte verschiedene Verdünnungen der Kultur gewonnen zB 90%, 10%, 1% auf die duale Selektions Agarplatten wachsen bei 37 &#160; ° C für 16 Stunden. </li></ol> 6. Analyse von Rekombinanten <ol style="margin-left: 40px;"><li> Optional: Wählen Sie 6 bis 12 Kolonien und durchzuführen, Kolonie-PCR mit einem HA flankierenden Primer und einen Einsatz spezifischer Primer. Fügen Sie die Subklonierung Plasmid und das Einsetzen cassette Plasmid sowie die Mutter BAC-Klon als negative Kontrollen. <ol><li> Führen Agarosegel-Analyse der Kolonie PCRs. Identifizieren positiver Klone durch die Anwesenheit von einem hellen Band an der erwarteten Größe. HINWEIS: Der hohe Wirkungsgrad des SPI Klonens erzeugt meist richtig Rekombinanten. </li></ol></li><li> Wählen Kolonien in 5 ml LB pH 8, der die selektive Antibiotikum und wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Bereiten DNA-Minipreps Verwendung einer Säule Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten BAC Miniprep DNA unter Verwendung von Standard Phenol-Chloroform-Isolation oder ein ähnliches Protokoll. </li><li> Führen RE verdaut, auf dem Miniprep-DNA. Separate DNA durch Agarose-Gelelektrophorese. Analysieren RE Mustern, um die Klone, die die erwarteten Fragmente Größen der richtigen Zielvektor zu identifizieren. Wähle eine RE, die eindeutig diskriminiert zwischen dem Vektor fehlt Einlage (n) und dem Vektor, der die Einlage (n). </li><li> Optional: Zellen, die frei von der BAC, die immer noch in der E. vorhanden sind erhalten coli nach Rekombination, verwenden Sie die Miniprep-Plasmid-DNA, um DH5alpha oder DH10B E. verwandeln coli-Zellen. </li><li> Führen Sie die DNA-Sequenzierung über den HA und Insertionskassette zu Oligosynthese Fehler zu überprüfen. </li></ol>

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</ol>

T.R.R. ist der Erfinder einer britischen Patentanmeldung zur Multiplex-Rekombinationstechnologie.

Der Bau der ES-Zelllinien und Maus-Modellen ist historisch beteiligten Gene Targeting unter Verwendung von Plasmid-Konstrukte, die die modifizierte Allel 4 enthalten. Jedoch ist die Konstruktion dieser Komplex das Gen-Targeting-Vektoren hat sich als eine erhebliche Engpass bei der rechtzeitigen Herstellung derartiger Modelle. Die Entwicklung der Rekombination auf der Basis der Konstruktion des Vektors Strategien hat verbesserte Vektor-Design und effizienter Vektor Montage erlaubt. Dennoch aktuellen Rekombination Protokolle beinhalten noch mehrere Schritte erfordern Zwischen Plasmidreinigung und verschiedene Bakterienstämme. Subklonierung und Einfügen bietet einen neuartigen Ansatz zur Konstruktion des Vektors, die in einem Elektroporation Ereignis in der Wohn BAC Wirtsstamm durchgeführt werden können. Die Nützlichkeit der SPI in Gen-Targeting wurde hier eine Vielzahl von Vektor-Konstruktionsanwendungen getestet. In allen hier betrachteten Fällen erwiesen SPI effizient zu sein und die richtige rekombinante Plasmid wurde hergestellt.In der Mehrzahl der Fälle wurden die mehrere unterschiedliche Kassetten richtig im Targeting-Vektor inseriert. Große DNA-Kassetten und Vektoren wurden leicht in dem SPI-Protokoll aufgenommen und zeigte die Flexibilität dieses Systems. SPI beruht auf der Verwendung langer Homologiesequenzen und Phosphorothioat (PTO) Schutz der linearen DNA-Kassetten. PTO Modifikation verleiht Schutz gegen Exonukleasen zu der linearen DNA 20,21 und die lange HA erhöht Rekombinationseffizienz zu Multiplexing ermöglichen. Synthese von längeren Oligo-Sequenzen erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit des Ansammelns Fehler insbesondere Deletionen. Mutationen im Oligo kann besonders nachteilig sein, wenn sie zu decken Protein kodierenden Regionen. DNA-Sequenzierung über den HA und die das gesamte Länge des eingelegten Kassette ist empfehlenswert, um Klone mit allen Sequenzänderungen zu eliminieren. Verwendung eines High-Fidelity-DNA-Polymerase-System wird auch vorgeschlagen, um die Einführung eines zu vermeideny PCR-Fehler. Die Länge und Zusammensetzung der HA des Subklonierung Plasmid kritischer ist relativ zu der Einschubkassette (Daten nicht gezeigt). Für besonders empfindliche Anwendungen wie Bau von Knockin-Vektoren, in denen alle Mutationen in Exon Regionen werden nicht toleriert, kann der HA des Insertionskassette gekürzt werden (50 bis 120 bp) Probleme mit langen Oligos assoziiert zu vermeiden. Insertionskassette können unmodifiziert oder dual phosphorthioiertes (wenn die anhand der Richtung der Replikation nicht verfügbar ist) gelassen werden. Aber Multiplexen in diesen Fällen immer noch erfordert lange geschützt HA Subklonierung Plasmide. Eine Einschränkung dieser besonderen Strategie ist die Senkung der Multiplexing Effizienz, die möglicherweise Auswirkungen kann SPI Klonen an verschiedenen Loci. Die Länge der Insertionskassette und dem Subklonieren Plasmid ist ein weiterer wichtiger Parameter bei der SPI Klonen. Größere DNA-Moleküle zu elektroporieren weniger wirksam, und die Wirkung ist kumulativ, da die Wiederquirement alle Kassetten in der gleichen Zelle einzuführen (Daten nicht gezeigt). Multiplexing ist am effizientesten mit kleineren Einschubkassetten. DNA-Fragmente größer als 3 kb stellen auch eine Grenze für Red vermittelte ssDNA Verarbeitung, die effizienteste bis zu 3 kb 30 ist. Eingefügt Kassetten mehr als 3 kb sind Dual reseziert und weniger effizient rekombinieren über eine Beta-unabhängigen Weg 20. Daher wird Screening von Kolonien ausreichen, um die korrekte Klon identifiziert in diesen Fällen wichtig. Eine längere Dauer der Rekombination nach der Elektroporation erhöht auch die Chancen für eine Erholung der richtige Klon in schwierigen SPI Übungen. Bis zu vier kleine Kassetten (&lt;1,5 kb) können gleichzeitig mit dem SPI-Prozess eingeführt werden, wenn die Multiplexeffizienz mit jedem zusätzlichen Kassette verringert (Daten nicht gezeigt). Jedoch spiegelt dies das Ergebnis einer optimalen SPI Experiment und sinnvoll, die Grenzwerte des Multiplexens beachten, wenn viele große Kassetten ist. </p&gt; Die Entwicklung von Genom-Editing-Tools wie Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -cas9 Endonuklease-System hat die Schaffung neuer Genom-Modifikationen aktiviert werden und hat zu einer effizienteren Genomtechnik 36 geführt. Jedoch haben diese neueren Technologien Gen-Targeting-Vektoren ergänzt, anstatt sie verdrängt. Es ist vorgesehen, dass die CRISPR-cas System könnte Antibiotika-Selektion zu ersetzen und zu verfeinern die Multiplex-Rekombination Protokoll.

Die Entwicklung von Gen-Targeting-Technologien, hat den Bau von Zelllinien und Maus-Modellen ermöglicht, verschiedene biologische Systeme 1-3 zu untersuchen. Ein Schlüssel der ersten Stufe in der Modifikation einer genomischen Sequenz ist die Gestaltung und Konstruktion eines Gen-Targeting-Vektor 4. Targeting-Vektoren sind Plasmidkonstrukte, die das Allel von Interesse, die die gewünschten Modifikationen (n) durch einen Selektionsmarker (beispielsweise Neomycin) flankiert tragen und langen genomischen Regionen für effiziente homologe Rekombination in Säugerzellen 5 erforderlich. Präzise Genveränderung durch Einbringen des Targeting-Vektors in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) 6 oder somatischen Zellen 7, dadurch gelöst, dass eine homologe Rekombination zwischen identischen Abschnitte der DNA-Sequenz auf dem Zielvektor und den genomischen Locus resultiert in der Übertragung von der beabsichtigten Modifikation um das Genom durch Genkonversion 8. Solche modified ES-Zellen können in der Maus Blastozysten injiziert werden, um Nachkommen (Chimären) herstellen, die dann übertragen können diese modifizierten Allele über die Keimbahn 9. Ein alternativer Weg, um transgene Mäuse zu erzeugen beinhaltet die Mikroinjektion eines Genexpressionsvektor in einzelligen Maus Zygoten, die der zufälligen Integration des Vektors in das Genom der Maus 10 führt. Traditionelle Methoden der Vektorkonstruktion wurden auf herkömmliche verlassen &#39;cut and paste&#39; Klonen Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen, um die verschiedenen Selektionsmarker und genomische Fragmente in einen Vektor-Rückgrat zu klonen. Jedoch ist eine inhärente Begrenzungsfaktor herkömmlicher Klonen die Positionierung und die Wahl der Restriktionsstellen, vor allem bei längeren DNA-Sequenzen. Dies erfordert häufig mehrere Subklonierungsschritte und führt auch fremde DNA-Sequenzen in den Vektor, die oft zu einer geringeren Effizienz des Gen-Targeting. Recombineering (rekombinogenen gerineering) ist ein DNA-Engineering-Technologie, die diese Einschränkungen überwunden durch die Verwendung der homologen Rekombination (HR) durch Phagen Rekombination Proteine ​​in E. vermittelte coli-Zellen 11,12. Da jede Region eine homologe Sequenz kann als Substrat Rekombination dienen, werden die Beschränkungen der Verfügbarkeit von Restriktionsstellen entfernt wurde. Große DNA-Sequenzen können nahtlos direkt in vivo modifiziert werden, so auch ihre strukturelle Integrität bewahren 13. Recombineering ist sehr effizient mit kurzen Homologien (50 bp) 14 und damit Homologiearme (HA) können bequem in synthetische Oligo-Sequenzen integriert werden. In einem typischen Experiment Rekombinationstechnologie, einem Oligo oder einem Doppelstrang-DNA (dsDNA) Fragment, HA in Rekombinationstechnologie kompetente E. elektroporiert coli-Zellen, welche die Ziel entweder auf dem Chromosom oder auf einem Plasmid 15 angeordnet. Die Rekombination Potential wird durch induzierbare Expression des Red rec tragenenombination Proteine ​​der Phagen 16,17 bzw. die RecET Proteine ​​der rac Prophagen 18. Die Rot / RecE Exonuklease wandelt lineare dsDNA zu einer Einzelstrang-DNA (ssDNA) Zwischen, die dann von ihrem Partner, Rot / RecT, eine einzelsträngige Glühen Protein (SSAP) 19 gebunden. Das Tempern eines langen ssDNA oder eine kurze Oligo an seinen komplementären Zielsequenz auf der Folgestrang der Replikationsgabel und führt zum Einbau der Sequenz an der Targetstelle. Verzögerungsstrang ssDNA Rekombination ist die Grundlage für die hohe Effizienz der Rekombination und können durch die &quot;Beta&quot; Rekombinationsmodell 20,21 beschrieben. Ein typischer Workflow Rekombination zum Aufbau einer Gen-Targeting-Vektor umfasst eine der beiden folgenden Strecken. Ein Weg beinhaltet Subklonieren der gewünschten genomischen Region von einem Maus-BAC-Klons in ein Plasmid, gefolgt von dem sequentiellen Einführen LoxP Rekombinationsstelle, einen Selektionsmarker <sbis&gt; 22 etc. oder die alternative Route beinhaltet gezielt den BAC genomischen Locus mit den verschiedenen Zielvektorelemente durch mehrere Runden von Rekombination 10,23 und Subklonierung des modifizierten Locus in ein Plasmid durch Lücke Reparatur Klonen 24,25. Variationen zu diesem Thema wurden in verschiedenen High-Throughput-Rekombination Rohrleitungen im Rahmen der großen Maus Produktionsprogramme 26,27 verwendet. Diese Verfahren umfassen jedoch komplizierte und langwierige Stufen erfordern die Verwendung von speziellen Vektoren und E. coli-Stämmen (zB Cre-exprimierenden Zellen) und nutzen die eine oder mehrere Zwischenschritte der Vektor DNA Aufreinigung und Rücktransformation (Tabelle 1). Subklonierung und Einfügen (SPI) ist eine neue Technik, die Beta-Rekombination Rekombination und Reparatur Lücke Klonierung in einem einzigen Prozess (Abbildung 1) verbindet. SPI Vektor Montage ist einfach, schnell und flexibel und bietet deutliche Verbesserung gegenüber Standard recombiEngineering nähert (Tabelle 1). Hier zeigen wir, wie einfach und Nutzen des Einsatzes von SPI für verschiedene Vektorkonstruktion Anwendungen mit besonderem Schwerpunkt auf den Aufbau Nicht-Standard-und herausfordernde Vektor-Designs. Testfälle enthalten den Bau eines fluoreszierenden Reporter Knockin Vektor, eine doppelte Fotos mit Namensproteinexpression Knockin Vektor, ein BAC fluoreszierenden Reportervektor und eine Knockout-Vektor. Verschiedentlich die Forderung, einen Zelloberflächenrezeptor zu lokalisieren, zu reinigen, eine Kernproteinkomplex Diese untersucht oder bedingt abzutragen die Expression eines Gens.

<table><tbody><tr><td>Antibiotika außer Zeocin</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol, C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin: K1876-1G; Tetracyclinhydrochlorid, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin ist auch erhältlich von Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC-Klonen</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>RPCI-23 oder RPCI-24 BAC-Bibliotheken</td><td>129/Sv BAC-Klone können von Invivogen oder Life Technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD Hotstart DNA-Polymerase-System</td> erhalten <td>werden Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lange Oligos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Gen-Link: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramers oder Gene Link Long Oligos</td><td>PTO und Phosphosphat sind als kundenspezifische Modifikationen erhältlich. Die PAGE-Aufreinigung wird für lange Oligos dringend empfohlen.</td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>PCR-Aufreinigungskits mit Mindestelution werden bevorzugt.</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Vorbereitungskit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>Silica-Säule oder ähnliche Matrix-Kits werden bevorzugt.</td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>Eine Liste der RE finden Sie auf der NEB-Website.</td></tr></tbody></table>

subklonierung plus-insertion (spi) - a novel recombineering verfahren zur schnellen bau der gene targeting vektoren

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gen-Targeting bezieht sich auf die präzise Modifikation eines genetischen Locus mittels homologe Rekombination. Die Generierung neuartiger Zelllinien und transgener Mausmodelle mit dieser Methode erfordert die Konstruktion eines "Targeting"-Vektors, der homologe DNA-Sequenzen zum Zielgen enthält, und ist seit vielen Jahren ein limitierender Schritt in diesem Prozess. Die Vektorkonstruktion kann in vivo in Escherichia coli-Zellen unter Verwendung einer homologen Rekombination durchgeführt werden, die durch Phagen-Rekombinasen vermittelt wird, wobei eine Technik namens Rekombinering verwendet wird. Die Rekombinierung ist die bevorzugte Technik, um die langen Homologiesequenzen (>4kb) und verschiedene Targeting-Elemente, einschließlich Selektionsmarker, zu subklonen, die für die Vermittlung eines effizienten allelischen Austauschs zwischen einem Targeting-Vektor und seinem verwandten genomischen Locus erforderlich sind. Typische Rekombinationsprotokolle folgen einem iterativen Schema der schrittweisen Integration der Targeting-Elemente und erfordern Zwischenreinigungs- und Transformationsschritte. In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Rekombinierungsmethodik der Vektorassemblierung unter Verwendung eines Multiplex-Ansatzes vor. Die Reparatur der Plasmidlücke erfolgt durch die gleichzeitige Erfassung der genomischen Sequenz aus bakteriellen künstlichen Chromosomenbibliotheken der Maus und die Insertion von dualen Selektionsmarkern für Bakterien und Säugetiere. Diese Methode der Subklonierung plus Insertion ist hocheffizient und liefert einen Großteil an korrekten Rekombinanten. Wir präsentieren Daten für die Konstruktion verschiedener Arten von bedingten Gen-Knockout- oder Knock-in-Vektoren und BAC-Reportervektoren, die mit dieser Methode konstruiert wurden. Die SPI-Vektorkonstruktion erweitert das Repertoire der Recombineering-Toolbox erheblich und bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Konstruktion dieser hochkomplexen Vektoren.

Gen-Targeting-Methoden können verwendet werden, um transgene Mäuse mit Knockout-, Knock-in- und getaggten Allelen zu erzeugen. Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode der Rekombination in E. coli, die wir als "Subklonierung plus Insertion" bezeichnen und die zur schnellen Generierung benutzerdefinierter Gen-Targeting-Vektoren verwendet werden kann.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Gen-Targeting-Vektoren durch Sub-Klonierung plus Insertion zu konstruieren. Dies wird erreicht, indem der Rücken, der E-coli enthält, mit einem rekombinierenden Plasmid transformiert wird. Der zweite Schritt umfasst die Erzeugung asymmetrischer phosphorolierter Insertionskassetten und die Subklonierung von Plasmiden durch Polymerase-Kettenreaktion.Nach der Zugabe von Arabinose werden die GBAA-Rekombinationsproteine exprimiert und die terminale modifizierte Insertionskassette und das subklonierende Plasmid elektroporiert. Die gewünschte DNA-Sequenz wird gleichzeitig von hinten gefangen und mit der Insertionskassette in das subklonierende Plasmid modifiziert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Standardrekombination besteht darin, dass die Konstruktion von Gen-Targeting-Vektoren in einer einzigen Reaktion durchgeführt werden kann.Um mit dem Design von Oligos für die Insertionskassette und das Subklonierungsplasmid zu beginnen, entwerfen Sie jedes Oligo so, dass es 180 Basenpaar-Homologiearme enthält, die die genomische Zielstelle flankieren, und 20 Basenpaare, eine spezifische Priming-Sequenz für die Insertionskassette oder das Subklonierungsplasmid. Bestimmen Sie als Nächstes die Ausrichtung des genomischen DNA-Inserts des Back-Klons mit einem webbasierten Tool wie clone db. Legen Sie die Richtung der Replikation von oder ES fest, indem Sie die Karte des Backplasmid-Backbones überprüfen, das in der Back-Position verwendet wird.Bibliothekskonstruktion, fügen Sie zwei terminale Phospho-Acht-Bindungen hinzu, also das fünfprimige Ende des Oligos, das der Replikationsrichtung auf dem hinteren Klon entgegengesetzt ist. Als nächstes fügen Sie dem Reverse-Oligo eine Fünf-Prime-Phosphatmodifikation hinzu. Stechen Sie zunächst eine sterile Pipettenspitze in die hintere Agarkultur und impfen Sie 5,0 Milliliter Odbrühe.Wachsen Sie die Kultur fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Als nächstes kühlen Sie 10% ige Glycerinlösung, Mikrozentrifuge, Röhrchen und Elektroporation, Küvetten auf Eiskühler, gekühlte große Zentrifuge und Mikrozentrifuge auf vier Grad Celsius. Bestimmen Sie nach der Inkubation die optische Dichte der Kultur mit einem Spektralphotometer.Messung der Absorption. Bei 600 Nanometern. Bereiten Sie die elektrokompetenten Zellen vor, wenn ein OD 600-Messwert von 0,3 bis 0,8 erreicht wird.Wenn die Kultur fertig ist, schleudern Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen herunter. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter gekühltem 10%igem Glycerin und schleudern Sie erneut. Führen Sie diese Waschschritte insgesamt dreimal durch.Resuspendieren Sie die Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern und fügen Sie 10 bis 200 Nanogramm des rekombinierenden Plasmids hinzu. Erhalten Sie eine einzelne Zellsuspension, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und die Zellen dann in eine Pre-Chill-Elektroporation überführen. Vete. Legen Sie dann das Vete in ein Elektroporationsgerät und betreiben Sie die Zellen sofort mit Elektro, gewinnen Sie die Zellen in einem Milliliter LB zurück und übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Züchten Sie die Rückenkultur zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min. Geben Sie nach dieser Zeit neun Milliliter LB in die wiedergewonnene Kultur. Wachsen Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 200 U/min, um die Homologiearme in die Insertionskassette und das Subc-Klonierungsplasmid einzubauen.Führen Sie die PCR mit den zuvor hergestellten langen modifizierten Oligos durch. Alternativ können Sie das Plasmid-Template mit einem Restriktionsenzym linearisieren und ein Enzym auswählen, das außerhalb des PCR-Amplifikationsbereichs schneidet und durch Hitze aktiviert wird. Richten Sie die PCR mit einem High-Fidelity-Hot-Start-DNA-Polymerase-System ein.Bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor und führen Sie thermische Zyklen gemäß Best Practices durch. Nach der Reaktion werden PCR-Produkte mittels AROS-Gelelektrophorese analysiert. Laden Sie ein bis fünf Mikroliter jeder PCR auf ein 1%aros-Gel.Als nächstes reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem PCR-Aufreinigungskit. Quantifizieren Sie die PCR-amplifizierte DNA anhand eines bekannten Satzes von DNA-Standards oder mit einem NanoDrop-Spektralphotometer. Nach einer Inkubation über Nacht verdünnen Sie die hintere GBAA-Kultur 50-fach und bereiten Sie eine separate Kultur für eine Negativkontrolle vor.Züchten Sie die verdünnten Kulturen bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min für eine Stunde und 50 Minuten. Kühlen Sie anschließend alle rekombinierenden Materialien und Geräte auf vier Grad Celsius ab, wie bereits gezeigt. Bereiten Sie eine OSE-Lösung mit 10 % Gewicht pro Volumen vor und sterilisieren Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter.Wenn der OD der Rückenkultur das gewünschte Niveau erreicht, fahren Sie mit der Induktion der rekombinierenden Proteine fort. 200 Mikroliter der 10%igen arabischen Lösung zu 10 Millilitern der Rückenkultur hinzufügen, um eine endgültige Absorptionskonzentration von 0,2% zu erreichen. Fügen Sie eine nicht induzierte Kultur hinzu, die als Negativkontrolle verwendet wird. Überführen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator und induzieren Sie 45 Minuten lang eine rote Expression unter Schütteln bei 230 U/min.Schleudern Sie die Zellen herunter und waschen Sie sie dreimal mit 10 % Glycerin, wie zuvor gezeigt, bei 600 bis 1000 Nanogramm. Jede der Insertionskassetten und das Subklonierungsplasmid für die Rekombinationsreaktion umfassen nur einen Vektor und einen Vektor plus eine Einzelinsert-Steuerung, um die Rekombinationsfähigkeit und Integrität des Vektors zu überprüfen. Besorgen Sie sich als Nächstes eine einzellige Suspension und betreiben Sie die Zellen wie zuvor gezeigt mit Elektro.Ermöglicht die Wiederfindung in LB-Medien bei 37 Grad Celsius für eine Stunde für Mehrfachkopie-Plasmide oder in 10 lb bei 37 Grad Celsius für drei Stunden für Rückvektoren. Führen Sie verschiedene Verdünnungen mit der wiedergewonnenen Kultur bei Doppelselektion durch. Agar bitte und bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden anbauen.Wenn Sie fertig sind, pflücken Sie die Kolonien in fünf Milliliter LB, die das selektive Antibiotikum enthalten, und züchten Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes ein Säulenaufreinigungskit, um Mini-Prep-DNA herzustellen, führen Sie das entsprechende Restriktionsenzym ein und identifizieren Sie dann die Klone, die die erwarteten Fragmentgrößen enthalten, durch Gelelektrophorese. Führen Sie abschließend eine DNA-Sequenzierung über die Homologiearme und die Insertionskassette durch, um nach Fehlern bei der Oli-Photosynthese zu suchen.In diesem Beispiel zeigte die Restriktionsverdauungsanalyse von P zwei RX ein EYFP-Insert, das Klone enthielt, das erwartete Muster, was darauf hindeutet, dass sie den korrekt assemblierten Knockin-Vektor enthalten. Dieses Schema veranschaulicht das Konzept des Bact-Trimmens. Die Subklonierung plus Insertionsanalyse von PCR-Produkten bestätigte, dass die Kassetten korrekt eingebaut wurden.Darüber hinaus wurde bei der Analyse positiver Rückklone nach Zugabe des entsprechenden Restriktionsenzyms das erwartete Muster erhalten. Die Restriktionsverdauungsanalyse von 12 besagten R SR zwei SBI-Klonen zeigte bei der Mehrzahl der Rekombinanten eine korrekte Vektorassemblierung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mithilfe von Sub-Klonierung plus Insertion schnell Gen-Targeting-Vektoren konstruieren können.

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JoVE Journal

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Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

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