Eine rechnerische Methode, Fly Circadian Activity zu quantifizieren

Bei den meisten Tieren orchestrieren zirkadiane Uhren Verhaltens- und molekulare Prozesse und synchronisieren sie mit dem täglichen Hell-Dunkel-Zyklus. Bei Fruchtfliegen wird die Uhr in der Regel anhand von Bewegungsaufzeichnungen untersucht. Hier ist ein Beispiel für die durchschnittliche Fortbewegung des Wildtyps, gemessen im 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus, wobei der Hell-Dunkel-Zyklus mit einem gelb-schwarzen Balken oben dargestellt ist.

Eine typische Fliegenaufzeichnung zeigt ein komplexes, biomodales Muster mit zwei Aktivitätsspitzen, einem morgendlichen Peak, der in der Morgendämmerung auftritt, und einem abendlichen Peak, der in der Abenddämmerung auftritt. Diese beiden Peaks zusammen bilden eine Wellenform, die sich stark von den sinusförmigen Oszillationen unterscheidet, die in Uhrengenen beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass neben der Uhr auch Mechanismen einen tiefgreifenden Einfluss auf die Erzeugung des beobachteten Musters in Verhaltensdaten haben. Hier stellen wir die erste Methode vor, die temporale Muster in der Fliegenaktivität mathematisch beschreibt.

Wir passen die Aktivitätsdaten an eine Modellwellenform an, die die Fortbewegung von Fliegen nachahmt. Unser Modell besteht aus vier exponentiellen Termen, zwei Termen aus dem morgendlichen Peak und zwei Termen aus dem abendlichen Peak. Zusammen mit der zirkadianen Periode hat unser Modell neun unabhängige Parameter.

B-Parameter definieren die Geschwindigkeit des Morgenaufgangs, des Morgenzerfalls, des Abendaufgangs und des Abendzerfalls. TM und TE definieren die Breiten der Morgen- und Abendgipfel, und HM und HE definieren die Höhen der Gipfel. Zusammen beschreiben diese Parameter die Größe und Form der morgendlichen und abendlichen Spitzen im Aktivitätsmuster vollständig.

Unsere Methode kann angewendet werden, um die Mechanismen und das Substrat aufzuklären, die dem häufig beobachteten bimodalen Aktivitätsmuster in Fliegenlokomotormessungen zugrunde liegen. Bereiten Sie für das Fortbewegungsexperiment einzelne Röhrchen mit Futter an einem Ende und Baumwolle am anderen Ende vor. Dafür gibst du zunächst fünf bis sechs Gramm Fliegenfutter in ein 50-Milliliter-Becherglas.

Schneiden Sie Lebensmittel in kleine Stücke, damit sie leichter in der Mikrowelle geschmolzen werden können. Ein Aktivitätsmonitor passt für 32 einzelne Röhren. Nehmen Sie daher 32 Schläuche und verbinden Sie sie mit einem Gummiband miteinander.

Die Speisen im Becherglas in der Mikrowelle schmelzen. Erhitzen Sie das Essen etwa 10 bis 15 Sekunden lang. Stoppen Sie die Mikrowelle alle fünf Sekunden und schütteln Sie den Becher ein wenig mit Lebensmitteln, um ein gleichmäßiges Schmelzen der Lebensmittel zu gewährleisten.

Stellen Sie sicher, dass alle Lebensmittel geschmolzen sind und sich keine festen Lebensmittelstücke mehr im Becherglas befinden. Solange die Lebensmittel noch flüssig sind, die Schläuche in den Becher mit den Lebensmitteln einführen. Bewegen Sie die Röhren ein wenig auf und ab, damit sie gleichmäßig gefüllt sind.

Lassen Sie die Speisen ca. eine Stunde abkühlen und fest werden. Nachdem die Lebensmittel fest sind, entfernen Sie die Schläuche mit einer Drehbewegung aus dem Becherglas, damit die Lebensmittel nicht am Boden des Bechers kleben bleiben. Entfernen Sie dann das Gummiband.

Versiegeln Sie das Ende mit Lebensmitteln mit Wachs. Wischen Sie dazu zunächst die Tube vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Drücken Sie dann die Tube gegen das Wachs.

Überprüfen Sie die Qualität der Versiegelung visuell und wiederholen Sie die Versiegelung gegebenenfalls erneut. Verschließen Sie mit dieser Technik alle Röhrchen für das Experiment. Das andere Ende der Schläuche schließt sich mit der Watte.

Die Watte lässt die Luft durch, während die Fliegen in den Schläuchen eingeschlossen bleiben. Es ist auch einfach zu entfernen und wieder einzusetzen, was nützlich sein wird, wenn wir die Röhren mit den Fliegen für das Experiment beladen. Jetzt, wenn die Röhren fertig sind, beladen Sie sie mit Fliegen für das Experiment.

Entladen Sie dazu Fliegen auf dem Pad mit CO2. Stecken Sie dann mit der Bürste vorsichtig eine Fliege in jedes einzelne Rohr. Legen Sie den Schlauch mit der Fliege in den Monitor.

In der gleichen Reihenfolge wie auf dem Monitor wird die Flugbewegung vom Monitorsystem in der Ausgabedatei aufgezeichnet. Schließen Sie den Monitor an den Computer an und stellen Sie ihn in einen Inkubator, der konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrechterhält. Stellen Sie auf der Grundlage des Experiments die richtigen Hell-Dunkel-Bedingungen ein.

Halten Sie die Fliegen für das Hell-Dunkel-Experiment während des gesamten Experiments im Hell-Dunkel-Zyklus. Verwenden Sie nicht den ersten Tag der Messungen in der Analyse. Für das Experiment mit konstanter Dunkelheit halten Sie die Fliegen zunächst zwei Tage lang in hellen/dunklen Bedingungen, um die Uhren mitzunehmen und zu synchronisieren, und wechseln Sie dann zu konstanter Dunkelheit.

Verwenden Sie in der Analyse keine Messungen ab dem ersten Tag konstanter Dunkelheit. Bevor Sie mit dem nächsten Abschnitt fortfahren, empfehlen wir Ihnen, das Protokoll zu lesen. Das Monitorsystem gibt eine einzelne Datei aus, die die Aktivität aller Fliegen im Monitor enthält.

Die letzten 32 Spalten der Ausgabedatei enthalten die Aktivität einzelner Fliegen. Unser Programm funktioniert mit Einzelflugaktivitäten. Teilen Sie daher die Ausgabedatei in mehrere einzelne Flugaktivitätsdateien auf.

Bei jeder Datei sollte es sich um eine einspaltige TXT-Datei handeln. Nachdem wir nun die Aktivitätsdateien vorbereitet haben, können wir unsere Analyse ausführen. Führen Sie die Funktion ModelFitPS3 im MATLAB-Befehlsfenster mit den folgenden Eingabeparametern aus.

Abtastrate, geben Sie das Zeitintervall der Datenabtastung in Sekunden an. Zum Beispiel wurden unsere Daten mit einer Abtastrate von 20 Sekunden genommen. Deshalb setzen wir hier 20 ein.

Geben Sie als Bin-Intervall das Zeitintervall in Minuten ein, in das die Daten zur besseren Visualisierung eingelagert werden. Wir empfehlen, die Klassifizierung auf 20 oder 30 Minuten zu begrenzen, aber im Moment werde ich hier 10 einfügen, um Ihnen später zu zeigen, wie es leicht geändert werden kann. Geben Sie als Trend eins ein, wenn die Daten den Basistrend anzeigen, andernfalls null.

Unsere Daten haben keinen Basistrend. Deshalb setze ich hier Null. Drücken Sie die Eingabetaste, um die Funktion auszuführen.

Wählen Sie im Popup-Fenster die Aktivitätsdatei für einen einzelnen Flug aus und drücken Sie auf Öffnen. Das Programm berechnet und zeichnet das Leistungsspektrum der Daten auf. Bestimmen Sie in diesem Fenster den primären Zeitraum in den Daten.

Klicken Sie dazu entweder mit der linken Maustaste auf den Peak in der zirkadianen Periode oder mit der rechten Maustaste auf den Peak in der zweiten Harmonischen, repliziert ungefähr bei der zirkadianen Periode geteilt durch zwei. In unserem Fall ist der Peak bei der zweiten Harmonischen viel größer und schärfer als der Peak bei der zirkadianen Periode. Daher verwenden wir die zweite Option.

Dann zeichnet das Programm die Daten in das ausgewählte Bin-Intervall ein. Wie Sie sehen können, sind die morgendlichen und abendlichen Spitzen im 10-Minuten-Intervall nicht sehr gut visualisiert. Daher wollen wir diesen Wert ändern.

Klicken Sie dazu einfach mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle im Diagramm. Geben Sie im neuen Dialogfeld den neuen Wert für das Abschnittsintervall ein. Es wird empfohlen, die Klassierung in ein Zeitintervall von 20 Minuten zu begrenzen.

Deshalb setzen wir hier 20 ein. Drücken Sie OK. Das Programm zeichnet die Daten sofort mit dem neuen Wert des Bin-Intervalls neu. Um diesen Wert zu übernehmen, klicken Sie einfach mit der linken Maustaste auf eine beliebige Stelle im Diagramm.

Das Programm zeichnet nun die Daten neu und zeigt nur fünf Tage Messung an. Wählen Sie in diesem Fenster den ersten Morgenpeak aus, der in der Analyse verwendet werden soll. Manchmal ist es notwendig, zuerst ein oder zwei Tage zu überspringen, was dauert, bis sich die Fliege an den Hell-Dunkel-Zyklus angepasst hat.

Um den Morgenpeak auszuwählen, klicken Sie einfach auf den gewünschten Peak. Das Programm zeichnet die Daten neu und zeigt jetzt nur noch Messungen an drei Tagen an, beginnend mit dem ausgewählten morgendlichen Peak. Die blauen und roten vertikalen Linien zeigen den ersten Abendpeak und den zweiten Morgenpeak basierend auf dem im ersten Fenster ausgewählten Zeitraum.

Wählen Sie in diesem Fenster den Punkt aus, den das Rohr für die vorläufige Anpassung der Daten mit der Modellfunktion verwendet hat. Klicken Sie dazu auf die folgenden Punkte in dieser Reihenfolge. Klicken Sie zunächst auf die Spitze des ersten Morgengipfels.

Der Klick wird mit dem roten Stern am unteren Rand angezeigt, der die Position des Klicks anzeigt. Klicken Sie dann auf das Ende des Morgengipfels, dann auf den Beginn des Abendgipfels, dann auf den Gipfel des Abendgipfels, dann auf das Ende des Abendgipfels und zuletzt auf den Gipfel des Morgengipfels des nächsten Tages. Das Programm zeichnet das Leistungsspektrum erneut auf, da die endgültigen Parameter aus der spektralen Anpassung gewonnen werden.

Das Spektrum wird nun als Frequenz auf der x-Achse dargestellt, und der zirkadiane Peak befindet sich auf der linken Seite des Diagramms. Der im ersten Schritt ermittelte Zeitraum wird mit einer roten vertikalen Linie dargestellt. Um Passpunkte auszuwählen, bestimmen Sie zunächst grob die Primärperiode.

Klicken Sie dazu entweder mit der linken Maustaste auf den Peak in der zirkadianen Periode oder mit der rechten Maustaste auf den Peak in der zweiten Harmonischen. Wir werden wieder die zweite Option verwenden. Danach erscheint unten ein Schieberegler, mit dem Sie die Punkte für die spektrale Anpassung auswählen können.

Die Punkte werden mit roten Kreisen dargestellt und erscheinen nach dem Verschieben des Schiebereglers. Bewegen Sie den Schieberegler nach links und rechts und platzieren Sie die Punkte so nah wie möglich an den Spitzen der Spektralpeaks. Nachdem das beste Bild erreicht wurde, drücken Sie die Schaltfläche Akzeptieren, und das Programm passt die ausgewählten Punkte an den analytischen Ausdruck für das Modellleistungsspektrum an.

Nach der Anpassung gibt das Programm zwei weitere Diagramme aus. Der erste ist ein Leistungsspektrum des Modells, das mit den extrahierten Parametern konstruiert wurde. Zweitens sind die Daten, die mit dem Modell ausgestattet sind.

Die Daten werden mit einer schwarzen Linie und das Modell mit einer roten Linie angezeigt. Es ist ersichtlich, dass die Funktion den Daten sehr ähnlich ist, insbesondere den Aktivitätsdaten der letzten drei Tage. Die extrahierten Parameter werden in der TXT-Datei für die Modellanpassungsparameter gespeichert.

Nach dem Namen der Datei werden die Parameter in der folgenden Reihenfolge gespeichert: zuerst b des morgendlichen Zerfalls, dann b des morgendlichen Aufgangs, b des abendlichen Aufgangs, b des abendlichen Abklangs, zirkadiane Periode, dann die Breite der morgendlichen Spitze geteilt durch die zirkadiane Periode, die Breite der abendlichen Spitze geteilt durch die zirkadiane Periode, Höhe der morgendlichen Spitze, Höhe des Abendgipfels und der Anpassungsfehler der spektralen Passform. Neben der Parameterdatei für die Modellanpassung gibt das Programm noch zwei weitere Dateien aus. Die erste ist die Datenanpassung mit der Modellfunktion und die zweite ist eine spektrale Anpassung.

Führen Sie diese Analyse mit anderen Aktivitätsdateien durch. Alle extrahierten Parameter werden in der TXT-Datei für die Modellanpassungsparameter gespeichert und können weiter verwendet werden, um die Verhaltensausgabe mit den zugrunde liegenden Mechanismen zu verbinden, die das tägliche Verhalten des Fluges regulieren, das durch das Modellaktivitätsmuster gesteuert wird.