Name: Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Immunantwort und Schlafverhalten in Drosophila quantitativ messen. Diese Methode nutzt NFκB-Luciferase-Reporter und Lokomotionsanalysen, um den Zusammenhang zwischen Infektion und Verhalten zu untersuchen.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter dem Förderkennzeichen # IOS-1025627 unterstützt und von den National Institutes of Health unter dem Förderkennzeichen # 1R21NS078582-01 bis JAW

Dieses Protokoll verwendet zwei Setups (Abbildung 1) zu vier verschiedenen Anzeigen von Fliegen, die einer bakteriellen Infektion gesammelt erwerben. Diese Ausgänge sind 1) Schlaf / Wach-Verhalten; 2) das Überleben Ergebnis; 3) Keimbelastung in der Fliege, und 4) Echtzeit-Messung von NFKB Reporter Aktivität in vivo. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge, die verfügbar sind in Drosophila, bieten diese Messungen mechanistischen Einblick in die molekulare Verbindung zwischen Immunfunktion und Verhalten. Ein. Measure Bewegungsaktivität und Hotels in Flies <ol><li> Das Setup verwendet, um Bewegungsaktivität zu messen und Hotels in Fliegen, die auch die Drosophila Activity Monitoring System (DAM2, Trikinetics), Inkubatoren, dunklen Raum, und die Vorbereitung der Versuchstiere und Aktivität Röhren, wurde bereits 6 beschrieben. Der gleiche Ansatz wird hier, mit einigen geringfügigen Änderungen verwendet. <ol class="lalpha"><li&gt; Die Beleuchtung des Inkubators durch den Inkubator selbst gesteuert. Daher ist es wichtig, die Zeit Einstellung bei Computer-und Gründerzentren synchronisieren. </li><li> Aktivität Röhrchen werden zur Wiederverwendung durch Kochen auf einer Heizplatte in entionisiertem Wasser gereinigt. Eine geringe Menge an Detergens für das erste Kochen zugesetzt werden Rohre gut gespült und kochte noch zweimal. Wenn Garn verwendet wird, um das Rohr anschließen, können verwendet Aktivität Rohre (Aufnahme von Lebensmitteln, Wachs, Fliegen und Garne) ohne vorherige Entfernung des Garns gereinigt werden. </li></ol></li><li> Vor Beginn eines Experiments, inszeniert Ort Kulturen mit späten Puppenstadium Fliegen in Inkubatoren für drei bis vier Tage an experimentelle Beleuchtung und andere Umweltbedingungen anzupassen. Light: dunkel oder konstanten Bedingungen wurden häufig verwendet, um das Schlafverhalten messen. In diesem Beispiel werden entfernt, um konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf die Immunantwort und Verhalten 2,7,8 eliminieren akklimatisiert. Wie in 1A beschriebenen </strong&gt;, Load 1-4 Tage alten Fliegen in der Trikinetics DAM2 Tätigkeit überwacht als 6 und Rekord für ein Minimum von drei Tagen beschrieben vor der Infektion. </li></ol> 2. Infect Fliegen mit einem pathogenen Stamm von Bakterien <ol><li> Das hier beschriebene Protokoll ist spezifisch für S. marcescens, die einfach zu züchten und zu warten sind. Protokolle für Langzeitspeicherung und Kulturbedingungen für andere bakterielle Spezies variieren. S. marcescens in 15-50% Glycerin bei -80 ° C gelagert Um für die langfristige Lagerung vorbereiten, mischen 2 Volumina Nacht Bakterienkultur (OD 600 = 0,5 - 1,0) bis 1 Volumen autoklavierten 50% Glycerin in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Diese werden in einem abschließenden Glycerinkonzentration von 17% führen. Röhrchen bei -80 ° C. Um einen kurzfristigen in-use Quelle von Bakterien vorzubereiten, kratzen die gefrorenen Aktie mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und führen eine Drei-Wege-Streifen auf einer LB-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 &amp; dzB, C, um isolierte Kolonien zu erhalten. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C. Einen Tag vor der geplanten Infektion, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der LB-Agar-Platte mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und tauchen die Spitze in einer Kultur Röhrchen mit 5 ml LB-Medium. Bakterien wachsen über Nacht, oder bis zu 16 Stunden innerhalb eines Inkubationsschüttler bei 37 ° C und 250 rpm bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase. Messen der Konzentration mit einem Spektrophotometer bei OD 600. Die Konzentration in dieser Phase im Bereich von 0,5 zu 1 beträgt. Ist die Konzentration zu hoch ist, subkultivieren Bakterien und wachsen noch mehrere Stunden, um eine optimale Konzentration zu erhalten. Führen Sie das Verfahren in der Nähe einer Flamme Quelle. Einige Bakterienstämme für Antibiotikaresistenz konstruiert und gezüchtet werden und ausgewählt geeigneten Antibiotika zu dem Medium hinzugefügt. S. marcescens (ATCC # 8100) sind keine Antibiotika-resistente und werden daher in sterilen Medium ohne Antibiotikum gezüchtet. Um sterile Technik überprüfen, gehen Sie ein Mock cultuerneut ohne Bakterien als Kontrolle. Die Lösung, um Fliegen zu infizieren enthält Bakterien (verdünnt auf OD 600 = 0,1) und 1% Lebensmittelfarbe (Brilliant Blue FCF) in PBS. Bereiten Sie eine Lösung zur Injektion Kontrolle, indem äquivalente Menge LB-Medium in Infektion Lösung und 1% blaue Lebensmittelfarbe in PBS verwendet. Store Solutions auf Eis. </li><li> Bereiten Glasnadeln zum Einspritzen die Fliegen. Ziehen Sie Glaskapillaren (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) zu einer feinen Spitze mit einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige). Unter einem Präpariermikroskop, verwenden feinen Pinzette zum Abbruch der Spitze der Nadel, so daß die Öffnung groß genug ist, um mit Injektionsflüssigkeit durch Saugwirkung mit einer Spritze zu füllen, aber klein genug, um eine Beschädigung der Fliege während der Injektion zu minimieren. Nach dem Bruch der Spitze, sollte die Spitze Größe ca. 40-50 um betragen. Das Glas Nadel wird zu einer 3 cc-Kunststoffspritze mit einem Länge Rohr befestigt. Der Fluss der Injektion Medium manuell gesteuert Anwendung Überdruck oder suction mit der Spritze. Vermeiden Sie Verschmutzung der Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit, wie die Spritze Gerät sowohl für Infektionen und Kontrolle Injektionen verwendet wird. </li><li> Anesthetize Fliegen, indem sie auf eine CO 2-Pad. CO 2 wird durch einen abgedichteten Behälter mit Wasser geleitet, um das Kissen zu befeuchten und um statische Elektrizität, die Manipulation der Fliegen an den Pad kann verkomplizieren reduzieren. Injizieren Fliegen durch Stossen das Glas Nadel in den Bereich oberhalb des Scutellum des dorsalen Thorax. Die Weitergabe der Injektion Medium in-the-fly durch die Lebensmittelfarbe überprüft - Fliegen drehen blau wie die Lebensmittelfarbe Spreads durch das System. Die Dosis von Bakterien, die Fliegen empfangen kann quantifiziert, wie in Abschnitt 3 beschrieben, weiter unten. Einige experimentelle Designs gehören eine Kontrollgruppe, die aseptische Verletzungen erhält durch die Injektion Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe aber ohne Bakterien. </li></ol> 3. Bestimmen Sie die bakterielle Belastung Ein Ansatz zur evaluating die Immunantwort gegen eine bakterielle Infektion ist, um die bakterielle Belastung nach der Infektion bestimmt. D. melanogaster ist ein großes Vorbild, um diesen Parameter zu bestimmen, weil die ganze Fliege kann homogenisiert, um die Summe der Keimzahlen innerhalb eines einzelnen zu schätzen. Das Grundprinzip hinter diesem Protokoll ist, wenn sie auf einem festen Medium wie Luria Broth (LB)-Agar in einer Petrischale (LB-Platte) gezüchtet, ein einzelnes Bakterium eine sichtbare unterscheidbare Kolonie bildet. Daher kann durch Homogenisieren infizierten Fliegen in LB-Flüssigmedium, Erzeugen von seriellen Verdünnungen des Homogenats und Spreizen des verdünnten Homogenat auf LB-Platten, kann die Anzahl der Bakterienzellen Infizieren einer Fliege bestimmt werden. Eine Kontrollgruppe von Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe, aber ohne Bakterien injiziert sollte verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Infektion nicht mit anderen bakteriellen Spezies kontaminiert werden. Es sollte keine Kolonien auf der LB-Agar-Platte in diesem Zustand sein. <ol><li> Autoklavieren alle Materialien, die dafür verwendet werden sollenVerfahren vor Durchführung der eigentlichen Homogenisierung Schritt. Dazu gehören 200 ul Pipettenspitzen mit einer Schere, LB Medien und Stößel für die Homogenisierung verwendet geschnitten. Bereiten Platten durch Gießen autoklavierten LB / Agar-Medium in 10 cm sterile Petrischalen mindestens 1 Tag vor Homogenisieren Fliegen. </li><li> Anesthetize sammeln und fliegt in 1,5 ml Reaktionsgefäße und Shop Röhrchen auf Eis. </li><li> Führen Sie die Homogenisierung in der Nähe einer Flamme, um eine Kontamination zu verhindern. Eine Steuerung Homogenisierung mit Fliegen ohne Infektion wird empfohlen, insbesondere bei Verwendung eines Bakterienstamm wie S. marcescens, die nicht Antibiotikum resistent. Homogenisieren ein Minimum von 2 Gruppen von 10 Fliegen pro Tier experimentellen Zustand. Die Zahl der Fliegen pro Homogenat verwendet wird vom Experimentator bestimmt. Einige Gruppen haben eine Fliege pro Homogenat verwendet, was nützlich ist, zum Auswerten Variation zwischen einzelnen bakteriellen Belastung entfernt 8, während andere 3-10 Fliegen pro Homogenat verwendet habenum über Genotyp oder experimentelle Bedingung 9-12 vergleichen. <ol class="lalpha"><li> Fügen Sie 400 ul LB-Medium zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit Fliegen und homogenisieren mit einem kleinen Motor und Stößel (Kontes). </li><li> Mit sterilisiert geschnitten Pipettenspitzen verdünnen serielle das Homogenat 1.10 durch Zugabe von 20 ul homogenisierte LB / bakterielle mittel-bis 1,5 ul Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 ul LB-Medium. Schneiden Pipettenspitzen verhindert das Blockieren von fly Schutt und stellt sicher, dass ein geeignetes Volumen wird übertragen. </li><li> Verdünnungsfaktor wird empirisch bestimmt und hängt von der Genotyp des fliegen, der Bakterienstamm verwendet, und experimentellen Bedingungen. Für Wildtyp Fliegen mit S. infiziert marcescens, verwenden Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 3 2 für Fliegen sofort nach der Infektion homogenisiert und Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 4 5 für Fliegen homogenisiert 24 h nach der Infektion. </li><li> Fügen Sie 100 ul LB / bakterielle Medium aus der microcentrifuge Röhrchen mit dem Endverdünnung und verteilt das Medium auf einer LB-Platte unter Verwendung von Glaskugeln (VWR), um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Entsorgen Sie die Glaskugeln in 100% EtOH Lösung. Legen Sie die LB-Platten in einem 37 ° C Inkubator über Nacht. </li><li> Als optionaler Schritt, verwenden ein Abbildungssystem mit sichtbarem Licht, um ein Bild der LB-Platten (FluorChem 8900; Alpha Innotech) zu erhalten. Zählen der Anzahl von Kolonien entweder auf der Platte selbst oder aus dem Bild der Platte mit dem Werkzeug auf das Zählen Photoshop Software (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Berechnen der Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten pro Fliege unter Verwendung der Formel: [n / (N * T * v)] * V, wobei n = Anzahl der Kolonien auf dem LB-Platte gezüchtet, N = die Anzahl der Fliegen in einem gepoolten Mikrozentrifugenröhrchen, D = Verdünnungsfaktor, und v = Volumen der Lösung auf jeder Platte zu verbreiten; V = ursprüngliches Volumen der Homogenat. </li></ol></li></ol> 4. Bewerten Sleep and Survival-Dauer nach der Infektion <ol><li> FürFliegen, die nicht für die Messung bakterielle Belastung geerntet werden, weiterhin überwachen Verhalten für weitere 7-10 Tage. Überlebensdauer von Genotyp der Fliege, die Umgebungsbedingungen beeinflusst und Bakterienarten für die Infektion verwendet. </li><li> Nach ca. 10 Tagen zu kündigen das Experiment, herunterzuladen und zu verarbeiten Verhaltensdaten wie zuvor 6 beschrieben. Insomniac2 kundenspezifische Software, die in Matlab basiert, wird verwendet, um Schlaf-Parameter zu analysieren. Es ist wichtig zu toten Fliegen aus der Verhaltensanalyse eliminieren. Normalerweise schränkt dies Analysen innerhalb der ersten Tage nach der Infektion, je nach Art der Infektion und Fliege Genotyp. Tod im Assay wird durch die Zeit alle Aktivitäten zählt Null erreicht angegeben haben. Um die Analyse des Überlebens zu erleichtern, Drosonex, kundenspezifische Software in Microsoft Visual C + + 6.0, wird verwendet, um Rohdaten aus dem Trikinetics DAM-System zu verarbeiten. Die Software-Berichte als Excel-Dateien, Überleben Dauer jedes fly (in Stunden), kompiliert Aktivität data von allen Monitoren in einer einzigen Tabelle, und meldet die prozentuale fliegt überlebende im Laufe der Zeit, wie sie durch den Benutzer. Die Excel-Dateien sind zum Einbau in andere statistische Software-Pakete für die weitere Analyse zu integrieren. </li></ol> 5. Messen NFKB Aktivität während der Infektion mit einem Luciferase Reporter Assay Transgene Fliegen kappaB-luc in diesem Test verwendet wurden erzeugt, wie in vorher Kuo et al., 2010 2. Kurz gesagt, enthält die KB-luc Reporter 8 Wiederholungen einer NFKB Bindungssequenz, die in einen Promotor eingefügt wurden stromaufwärts eines Luciferase offenen Leserahmens. <ol><li> Passen Fliegen zu experimentellen Lichtverhältnissen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. In diesem Beispiel sind 1-4 Tage alte kappaB-luc Fliegen in Fläschchen, die eine 5% Saccharose, 2% Agar Nährboden und in Gleichlicht (LL) für 2 Tage, um die gleiche Alter als andere während der Infektion entfernt erreichen untergebracht. </li><li> Bereiten Sie eine 96-well Mikrotiterplatten für Fliegen. Jede Vertiefung enthält 2 Schichten von Lebensmitteln Medium (Abbildung 2), die obere Schicht enthält Luciferin, das Substrat der Luciferase. Fügen Sie 300 ul einer 5% Saccharose, 2% Agar-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie sich zu verfestigen. Weiter, einen 50 ul Deckschicht zu jedem Well, enthaltend 5% Sucrose, 1% Agar, und 2 mM Luciferin (Gold Biotechnology, Inc.). Luciferin Konzentrationen für Mess-Reporter-Aktivität in Drosophila verwendet wurden in der Literatur unterschiedlich und haben so niedrig wie 100 uM 13 gewesen. Die erforderliche Konzentration kann empirisch ermittelt werden. Zwischen Abgabe der Lebensmittel Schichten, decken Sie die Platte mit einem feinmaschigen Gewebe zu erleichtern Trocknen unter Beibehaltung Sterilität. Die Platte sollte gründlich trocknen gelassen werden, bis zu einer Stunde, um Fliegen aus immer in Kondensationstropfen steckenbleiben. Da Luciferin ist lichtempfindlich, vermeiden Platten mehr als nötig leuchten. </li><li> Tragen Sie eine klare Klebefolie (Top-Seal-A; Perkin Elmer) in eine 96-well-Mikrotiterplatte und perforierten mit einer feinen Nadel in einer Menge von 2 Löcher pro Vertiefung. Diese Löcher werden nicht nur ermöglichen Luftaustausch in jede Vertiefung, sondern auch eine Möglichkeit, um Fliegen auf einer individuellen Basis zu betäuben. Mit einem scharfen Messer und Lineal, stellen einen Schnitt zwischen den einzelnen Spalten. Dies wird eine einfache Möglichkeit zum Laden / Entladen Fliegen in Gruppen von 8 zu einem Zeitpunkt. Um Fliegen in die Mikrotiterplatte zu laden, entfernen Sie die Fläschchen aus dem Inkubator und betäuben Fliegen auf einen CO 2-Pad. Last fliegt ein-by-one zu jeder Vertiefung Spalte für Spalte. Sollte ein Versehen fliegen Klebe-/Dichtungsmasse stecken, lassen die Fliege allein, wie sie oft in der Lage, sich ohne Intervention befreien. Bringen Sie die Mikrotiterplatte in den Inkubator in LL für 8-24 Stunden an die neue Umgebung anzupassen und die Luciferinsubstrat verbrauchen. </li><li> Kultur Bakterien, S. marcescens, und bereiten eine Lösung für eine Infektion wie oben beschrieben. </li><li> Betäuben tfliegt er mit einer Mikropipette Spitze an einer Niederdruck-CO 2-Leitung. Legen Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Lüftungsöffnungen für jeden gut gemacht. Vorsicht geboten, um zu gewährleisten, dass der CO 2-Druck hoch genug, um die Fliege betäuben, aber niedrig genug, um eine Verletzung des fly vermeiden. In Gruppen von acht einzeln übertragen jede Fliege zu einer CO 2-Pad, und infizieren wie oben beschrieben. Nach der Infektion wieder jede Fliege auf seine ursprüngliche gut und versiegeln Sie den Mikroplatten. </li><li> Maßnahme Lumineszenz (TopCount NXT-Lumineszenz und Scintillation Counter; Perkin-Elmer). Die Lumineszenz TopCount Zähler enthält eine Stapelkassette für Platten, die für den programmierten und automatisierte Messungen ermöglicht kontinuierlich an gewünschten Inkremente für längere Zeit (in der Regel bis zu fünf Tagen). Diese Funktion ist nicht auf allen Instrumenten und Datenerfassung für Experimente mit anderen Instrumenten durchgeführt werden daher seltener. Die Lumineszenz-Zähler in einem ro untergebrachtom mit einer kontrollierten Temperatur und Beleuchtung Zeitplan. Beim Laden Platten in die Stapelkassette, stapeln Sie die Platten mit den Fliegen zwischen klaren Blindplatten um sicherzustellen, dass Fliegen Licht zu empfangen. Programm das Luminometer nach den Angaben des Herstellers zu sammeln Lesungen jede Stunde für ein Minimum von 24 Stunden. In diesem Beispiel werden die Detektoren programmiert, um alle Vertiefungen für 10 sec zu lesen und das Ergebnis als Zählungen (willkürliche Einheiten) pro Sekunde abzugeben. Dieser Wert wird auf 3 Lesungen pro Vertiefung gemittelt. Exportieren Sie die Dateien in ein Tabellenkalkulationsprogramm und führen Sie eine Standard-Analyse, grafische Darstellung der Ergebnisse der Lumineszenz. </li></ol>

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<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zu untersuchen, wie Verhalten, insbesondere schlafen, um die Immunantwort Parametern verknüpft. Zu diesen Parametern gehören bakterielle Belastung, Überleben Ergebnis und NFkB-Aktivität, wie durch eine Luciferase-Reporter in vivo gemessen. Zusammen stellen diese Parameter liefern Informationen darüber, wie gut eine Fliege kann eine Infektion zu bekämpfen. Bakterielle Belastung und Überleben Ergebnis sind Immunantwort Parameter, die eine einfache Messung in Drosophila...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Inkubatoren </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Jeder Inkubator lauffähig programmierten Licht / Temperatur Zeitpläne angemessen ist. </td></tr><tr><td> Drosophila activitiy Monitore </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Wie an anderer Stelle beschrieben 6, erfordert dieses System eine Computer-Schnittstelle, Software und anderes Zubehör. </td></tr><tr><td> Pyrex Glass Tubes </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Szintillations-und Lumineszenz-Zähler </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 Detektor </td><td> Jede Mikroplattenleser zum Aufspüren von Lumineszenz kann für diese Art von Reporter-Assay verwendet werden. TopCount enthält mehrere Detektoren und eine automatisierte Stapler, es fähig ist, programmiert, um kontinuierlich ausgelesen aus mehreren Platten. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imaging von Bakterienkulturen ist optional; jede digitale Imaging-System mit sichtbarem Licht Fähigkeit ist ausreichend. </td></tr><tr><td> Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vorräte </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> World Precision Instruments Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Syringe Needles </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - entzieht der Spitze der Nadel, um eine Beschädigung des Schlauches zu verhindern. </td></tr><tr><td> Silikonschlauch, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Wandstärke (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Gebrauchte zur Befestigung Glaskapillare Nadeln mit einer Spritze </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn </td><td> Amerikanischen Pharmaseal Unternehmen </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle Cordless Motor </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Glaskugeln 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-Well-Platten, die für Lumineszenz sind - sie sind opak. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-well Mikrotiterplatten </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplate Press-On Adhesive Sealing Film </td></tr><tr><td> D-Luciferin, Kaliumsalz </td><td> Gold Biotechnology, Inc. </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Erhältlich auf Anfrage bei den Autoren </td><td> custom; von Lesley Ashmore, Ph.D. geschrieben (Westminster College) </td><td> Matlab basierte Software, die verwendet wurde routinemäßig zur Analyse des Schlafes 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Erhältlich auf Anfrage bei den Autoren </td><td> custom; Thomas Coradetti (Sidewalk Software) geschrieben </td><td> Ein PC MSVC6 Programm für das Überleben Analyse von Rohdaten verwendet mit den gesammeltenTrikinetics System </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Lehmziegel </td><td></td><td> Nützlich für den Erhalt Zahl der cfu / Platte aus digitalen Bildern (optional) </td></tr></tbody></table>

quantitative messung der immunantwort und sleep in<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Eine komplexe Wechselwirkung zwischen der Immunantwort und Host Verhalten wurde in einer Vielzahl von Arten beschrieben worden. Überschüssiges Schlaf, insbesondere, ist bekannt, als Reaktion auf eine Infektion in Säugern 1 auftreten und kürzlich auch in Drosophila melanogaster 2 beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, daß der Schlaf nützlich zum Host während einer Infektion ist, und dass es für die Beibehaltung einer robusten Immunsystems 3,4 wichtig. Jedoch gibt experimentelle Hinweise, dass diese Hypothese unterstützt begrenzte 4, und die Funktion des Schlafes Überschuß bei einer Immunantwort bleibt unklar. Wir haben einen multidisziplinären Ansatz verwendet, um dieses komplexe Problem anzugehen, und habe durchgeführten Studien in der einfachen genetischen Modellsystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Wir verwenden eine Standard-Test zur Messung lokomotorische Verhalten und schlafen in Fliegen, und zeigen, wie dieser Test verwendet wird, um das Verhalten der Fliegen infecte messend mit einem pathogenen Stamm von Bakterien. Dieser Assay ist auch nützlich zur Überwachung der Dauer des Überlebens in einzelnen Fliegen während einer Infektion. Zusätzliche Maßnahmen der Immunfunktion umfassen die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion und die Aktivierung von NFkB, ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der von zentraler Bedeutung für die angeborene Immunantwort in Drosophila ist klar. Sowohl das Überleben Ergebnis und bakterielle Clearance während der Infektion zusammen sind Indikatoren für Widerstand und Toleranz gegenüber Infektionen. Widerstand bezieht sich auf die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion zu löschen, während Toleranz als die Fähigkeit des Wirts, um eine Beschädigung von einer Infektion zu begrenzen und dadurch trotz hoher Pathogen innerhalb des Systems 5 überleben definiert ist. Echtzeit-Überwachung von NFKB Aktivität während der Infektion gibt einen Einblick in einen molekularen Mechanismus des Überlebens während der Infektion. Die Verwendung von Drosophila in diesen einfachen Tests erleichtert die genetische und molekulare Analysen des Schlafesund die Immunantwort und wie diese beiden komplexen Systemen wechselseitig beeinflusst.

<ol><li> Infektion fördert den Schlaf. In diesem Beispiel, Canton-S (CS) Wildtyp Mutante Fliegen und Fliegen fehlt ein NFKB Gens, Relish (Rel E20) 14 wurden in zwei DAM2 Aktivitätsmonitore geladen (n = 32 für jeden Genotyp) infiziert und, wie oben beschrieben. Fliegen wurden in konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf Verhalten und Infektion zu eliminieren 2,7,8 aufrechterhalten. Die Rel E20 Mutanten wurden CS isogenized wie zuvor beschrieben 11. Beide Sätze...

Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu messen<em&gt; Drosophila</em&gt; Während bakterielle Infektion als auch die Fähigkeit der Fliegen, um eine Immunantwort durch Überwachung Überleben, bakterielle Belastung und Echtzeit-Aktivität eines zentraler Regulator der angeborenen Immunität, NFKB montieren.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

Eine komplexe Wechselwirkung zwischen der Immunantwort und dem Verhalten des Wirts wurde bei einer Vielzahl von Spezies beschrieben. Insbesondere ein übermäßiges Schlafbedürfnis ist bekannt ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Schlaf und Immunfunktion bei Drosophila zu untersuchen. Zunächst wird dazu die motorische Aktivität infizierter Fliegen aufgezeichnet, um den Schlaf zu messen. Im zweiten Schritt nach der Infektion werden die Fliegen homogenisiert, verdünnt und auf LB-Agarplatten ausgestrichen. Die Anzahl der wachsenden koloniebildenden Einheiten zeigt die Fähigkeit der Fliegen an, die Infektion abzuklären.Anschließend werden infizierte Fliegen, die ein Transgen mit dem NF-kappa-b-Luciferase-Reporter exprimieren, in eine 96-Loch-Platte gegeben, die Luciferingehalt, das Substrat der Luciferase, enthält. Die Echtzeitmessung der kappa-b-Luciferase zeigt die Aktivierung eines NF-kappa-B-Signalwegs während der Infektion sowie den Überlebensausgang unter Schlafentzug an. Die Bestimmung der bakteriellen Eliminierung und die NF-kB-Reporteraktivität sind Messgrößen, die Einblicke in den molekularen Zusammenhang zwischen Immunfunktion und Verhalten ermöglichen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es Zeit und Übung erfordert, um zu lernen, Fliegen konsistent manuell zu infizieren. Der Hauptvorteil der Lucifer-Assay-Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der QPCR besteht darin, dass die NF-kappaB-Aktivität kontinuierlich in Echtzeit in lebenden Fliegen gemessen werden kann. Beginnen Sie damit, Drosophila-Kulturen im späten Puppenstadium drei bis vier Tage lang zu inkubieren, damit sich die erwachsenen Tiere an die Umweltbedingungen anpassen können.Hier werden die Fliegen unter konstantes Licht gestellt, um den Einfluss der circadianen Uhr auf die Immunantwort und das Verhalten auszuschließen. Danach werden ein bis vier Tage alte Fliegen in das Aktivitätsmonitoring eingebracht. Die Monitore erfassen ihre Aktivität mindestens drei Tage vor der Infektion, einen Tag vor der geplanten Infektion.Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne SIA-Kolonie und tauchen Sie die Spitze in ein Kulturgefäß mit fünf Millilitern LB-Medium, um die sterile Technik zu überprüfen. Vergessen Sie nicht, eine Kontrollkultur ohne Bakterien anzulegen. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht, bis sie am nächsten Tag die exponentielle Wachstumsphase erreichen.Messen Sie die Extinktion der Kultur bei 600 Nanometern. Verwenden Sie eine zweite Q-Vet als Blindprobe. Die Kultur ist fertig, wenn die Konzentration zwischen 0,5 und 1 Extinktionseinheiten liegt; führen Sie gegebenenfalls eine Unterkultur durch oder verlängern Sie die Kultivierungszeit nach Bedarf.Bereiten Sie nun die Bakterienlösung zur Infektion der Fliegen vor. Verdünnen Sie die Bakterien mit PBS auf eine erwartete Extinktion von 0,1 bei 600 Nanometern. Fügen Sie anschließend Lebensmittelfarbstoff als Injektionskontrolle hinzu.Ersetzen Sie die Bakterien durch LB-Medium. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis. Stellen Sie anschließend unter einem Stereomikroskop mit einem Mikropipettenzuggerät Injektionsnadeln mit feiner Spitze her.Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Spitze jeder Nadel abzubrechen, sodass die Öffnung groß genug ist, um sie durch Saugkraft mit Injektionsflüssigkeit zu füllen, aber gleichzeitig klein genug bleibt, um die Fliege so wenig wie möglich zu verletzen. Befestigen Sie eine Glasnadel mit Hilfe der Spritze mittels eines Schlauckstücks an einer 3-cc-Kunststoffspritze. Der Fluss des Injektionsmediums wird manuell gesteuert.Vermeiden Sie es, den Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit zu kontaminieren, da die Spritzenvorrichtung sowohl für infektiöse als auch für Kontrollinjektionen verwendet wird. Überprüfen Sie den Durchfluss des Injektionsmediums mit Hilfe eines Kim-Wipe-Tuchs. Zwei entscheidende Faktoren für erfolgreiche Injektionen sind die Verwendung der optimalen Nadelgröße und die dichte Abdichtung zwischen Nadel und Spritze. Wenn das Injektionssystem vollständig vorbereitet ist, betäuben Sie die Fliegen mit einem minimalen Strom von Kohlendioxid und arbeiten Sie schnell, sodass keine Fliege länger als fünf Minuten betäubt bleibt. Injizieren Sie nun die Fliegen, indem Sie die Glasnadel in den Bereich oberhalb des Skutellums des dorsalen Thorax stechen. Das Eindringen des Injektionsmediums in die Fliege wird durch die Lebensmittelfarbe bestätigt, die sichtbar wird, sobald sich die injizierte Lösung ausbreitet.Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle für dieses Verfahren verwendeten Materialien mindestens einen Tag im Voraus autoklaviert wurden. Bereiten Sie 10-Zentimeter-Petri-Schalen mit LV-Agar-Medium vor. Am Tag des Experiments betäuben Sie die Fliegen und geben sie in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Bereiten Sie pro experimenteller Bedingung mindestens zwei Gruppen mit jeweils 10 Fliegen vor. Bereiten Sie außerdem eine Kontrollgruppe mit nicht infizierten Fliegen vor, insbesondere wenn Sie einen Bakterienstamm ohne Antibiotikaresistenz verwenden. Lagern Sie alle beladenen Röhrchen auf Eis.Fügen Sie anschließend 400 Mikroliter LB-Medium zu jedem mit Fliegen beladenen Röhrchen hinzu. Homogenisieren Sie die Fliegen mithilfe eines kleinen Stößels und führen Sie diesen Schritt in der Nähe einer Flamme durch, um Kontaminationen zu vermeiden. Verdünnen Sie nun mittels abgeschnittener Pipettenspitzen das Homogenat in Schritten von Faktor 10 in Volumina von jeweils 200 Mikrolitern.Falls das Homogenat unmittelbar nach der Infektion mit Sia hergestellt wird, verdünnen Sie es bis zu einem Verhältnis von 1 zu 1000; für das Homogenat 24 Stunden nach der Infektion verdünnen Sie bis zu einem Verhältnis von 1 zu 100.000. Anschließend impfen Sie die beiden höchsten Verdünnungen auf 10-Zentimeter-Platten unter Verwendung von Glasbällchen aus, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen, und inkubieren die Platten über Nacht. Am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der Platte entweder durch direkte Beobachtung oder mithilfe einer Koloniezählsoftware.Berechnen Sie anschließend die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Fliege. Dieser Test verwendet transgene Fliegen, die den Kappa-B-Luciferase-Reporter tragen, zum geeigneten Zeitpunkt. Für den Test werden außerdem kultivierte Bakterien wie SCIA benötigt, die gemäß der Beschreibung im vorherigen Abschnitt für die Injektion vorbereitet wurden.Passt die Fliegen an die experimentellen Lichtbedingungen an. In diesem Beispiel werden ein bis vier Tage alte Kappa-b-Luciferase-Fliegen in Vials mit einem Nährmedium aus 5 % Saccharose und 2 % Agar gehalten und für zwei Tage in Dauerlicht gegeben. Bereiten Sie nun eine 96-Well-Mikroplatte für die Fliegen vor.Füllen Sie jedes Well mit zwei Schichten Nahrung. Zuerst Medium: geben Sie 300 µL einer 5%igen Saccharose-Lösung mit 2% Agar in jedes Well. Bedecken Sie die Platte anschließend mit einem feinen Netzgewebe und lassen Sie die Platte bis zu einer Stunde lang gründlich trocknen.Fügen Sie danach eine 50 µL dicke Deckschicht zu jedem Loch hinzu, die 5 % Saccharose, 1 % Agar und zwei Millimolar Lucifer enthält. Da Lucifer lichtempfindlich ist, lassen Sie die Platte ab sofort im Dunkeln trocknen. Minimieren Sie die Lichtexposition der Platte.Nachdem das Agar abgekühlt ist, bedecken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Klebefolie. Anschließend perforieren Sie die Folie mit einer feinen Nadel zweimal über jedem Brunnen. Diese Löcher ermöglichen den Gasaustausch und eine gasförmige Anästhesie.Danach, um das Beladen der Fliegen zu erleichtern, einen Schnitt zwischen jeder Spalte mit einer scharfen Klinge und einer geraden Kante einfügen. Die Fliegen mit Kohlendioxid betäuben und sie einzeln Spalte für Spalte in die Vertiefungen laden. Falls eine Fliege an der Folie hängen bleibt, sollte man ihr die Möglichkeit geben, sich selbst zu befreien, bevor man eingreift.Bringen Sie die Mikrotiterplatte für acht bis 24 Stunden zurück in den Inkubator unter konstantem Licht. Um die in den Vertiefungen befindlichen Fliegen zu betäuben, verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, die an eine Niederdruck-Kohlendioxidleitung angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass das Gas in harmlos niedrigem Druck vorliegt, und platzieren Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Belüftungsöffnungen, um jeweils acht Fliegen einzeln zu betäuben.Überführen Sie jede Fliege auf ein CO2-Kissen und infizieren Sie sie wie zuvor mit Bakterien. Bringen Sie anschließend jede Fliege in das ursprüngliche Loch zurück und versiegeln Sie die Mikrotiterplatte erneut. Messen Sie die Lumineszenz jeder Fliege mithilfe eines Luminometers, das sich in einem temperaturgeregelten Raum unter einem definierten Beleuchtungsplan befindet.Die Platten in die Stapelkassette einlegen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Platten mit den Fliegen zwischen klaren, leeren Platten gestapelt werden. Das Luminometer gemäß den Herstellerangaben programmieren und mindestens 24 Stunden lang stündlich Messwerte erfassen. In diesem Beispiel sind die Detektoren so programmiert, dass jede Vertiefung 10 Sekunden lang ausgelesen wird.Nach Abschluss die Datendateien in eine Tabellenkalkulation exportieren und eine Standardanalyse durchführen, bei der die Ergebnisse grafisch dargestellt werden. Die Beispieldaten können analysiert werden. Rabatte pro Sekunde, gemittelt aus drei Messwerten pro Mulde.Wildtyp-Fliegen vom Typ Canton S und relish. E20-Mutanten-Fliegen, denen das NF-kappa-B-Gen fehlt, wurden in zwei Aktivitätsmonitore bei konstantem Licht geladen und mit sia infiziert. In diesem Beispiel förderte die Infektion den Schlaf.Es zeigte sich, dass relish E 20-Mutanten nach der Infektion weniger Schlaf erhielten als Canton-s-Kontrollfliegen. In Übereinstimmung mit früheren Befunden starben die relish E 20-Mutanten außerdem rasch an der Infektion im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen.Die meisten Fliegen überlebten die aseptische Kontrollinjektion, was darauf hindeutet, dass die Fliegen an der Infektion und nicht an der Verletzung durch die Injektion starben. Da die relish-Mutanten so schnell starben, wurden nur Canton-s-Fliegen verwendet, um die bakterielle Belastung nach der Infektion zu demonstrieren. Sia proliferierte weiterhin in der Fliege 24 Stunden nach der Infektion. Die Reporteraktivität von Lucifer wies große Variationen zwischen einzelnen Fliegen und zwischen den einzelnen Datenpunkten auf. Obwohl das Signal von allen Geweben innerhalb der Fliege stammt, wird nicht erwartet, dass jedes Gewebe dieselbe Menge an Signal abgibt, und die Sichtbarkeit des Gewebes für den Detektor variiert, während sich die Fliege bewegt. In diesem Beispiel wurden Fliegen infiziert und mit einer behandelten Kontrollgruppe verglichen.Fliegen, die verstarben, wurden bei der Analyse einer Fliegengruppe ausgeschlossen. Die Luciferase-Reporteraktivität von Kappa b stieg nach der Infektion kontinuierlich an. Die Aktivität des Kappa b-Luciferase-Reporters stieg auch nach einer aseptischen Verletzung kontinuierlich an.Die maximale Aktivität lag bei beiden, nach Verletzung und nach Infektion, bei etwa 12 Stunden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Immunfunktion und den Schlaf nach einer Infektion bei SSO quantifizieren kann. Wir können Schlaf, Überleben, Zeit, bakterielle Eliminierung und die Echtzeit-Aktivität eines un copy Transkriptionsreporters messen.

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben Verfahren zur Erfassung täglichen Bewegungsaktivität...

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Messung der bakteriellen Belastung von E. coli nach der Injektion von E. coli in den Thorax von Drosophila melanogaster.

Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum schnellen und genauen Messung der Flugleistung in Drosophila, was eine Hochdurchsatz-Screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Vermeidung von gestressten Personen. Dieses Paradigma ist leistungsfähig und dennoch benutzerfreundlich und kann verwendet werden, um den Einfluss von Genen und Umwelt auf eine Art von sozialer Interaktion bei Drosophila melanogaster zu bewerten.

Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunsystems und der physiologischen Folgen von Infektionen und Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt, wie robuste und quantitativ wiederholbare bakterielle Infektionen an D. melanogaster verabreicht werden können und wie der Schweregrad der Infektion anschließend gemessen und die Immunantwort des Wirts quantifiziert werden kann.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.

Der Schlaf-Nullifizierungsapparat: Eine hocheffiziente Methode zur Schlafentzugs-Drosophila

Vorgestellt wird ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening zur Verbesserung des Schlafes durch Überwachung des Schlafverhaltens von Fruchtfliegen in einem älteren Drosophila-Modell .

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll bietet einen Rahmen zur Bewertung stressinduzierter Verhaltensänderungen bei Drosophila melanogaster. Die Kombination komplementärer Assays ermöglicht die Quantifizierung von Aktivität, Erkundung und Entscheidungsfindung für einzelne Fliegen. Der Ansatz ist flexibel und kann an eine Vielzahl von Studien angepasst werden, die Stressbiologie, Stoffwechsel und neurobehaviorale Funktionen untersuchen.

Multimodale verhaltensbezogene Phänotypisierung stressbedingter depressionähnlicher Zustände bei Drosophila melanogaster

Erfahren Sie, wie Sie Immunantwort und Schlafverhalten in Drosophila quantitativ messen. Diese Methode nutzt NFκB-Luciferase-Reporter und Lokomotionsanalysen, um den Zusammenhang zwischen Infektion und Verhalten zu untersuchen.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in

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