Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in Drosophila

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Schlaf und die Immunfunktion bei Drosophila zu bewerten. Dies wird zunächst durch die Aufzeichnung der Bewegungsaktivität infizierter Fliegen erreicht, um Schlaf und Überleben als zweiten Schritt zu messen, nachdem die Infektionsfliegen homogenisiert, verdünnt und auf LB-Agarplatten verteilt wurden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, die wachsen, zeigt die Fähigkeit der Fliegen an, die Infektion zu beseitigen.

Als nächstes werden infizierte Fliegen, die ein Transgen exprimieren, das den NF kappa b Luciferase-Reporter enthält, auf eine 96-Well-Platte gegeben, die Luciferian, das Substrat der Luciferase, enthält. Die Echtzeitmessung der Kappa-b-Luziferase zeigt die Aktivierung eines NF-Kappa-B-Signalwegs während der Infektion und das Überleben im Schlaf insgesamt an. Die bakterielle Clearance und die NF-KB-Reporteraktivität sind Messungen, die einen mechanistischen Einblick in den molekularen Zusammenhang zwischen Immunfunktion und Verhalten liefern.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da es Zeit und Übung braucht, um zu lernen, wie man Fliegen manuell und konsequent infiziert. Der Hauptvorteil der von Lucifer berichteten Technik gegenüber bestehenden Methoden wie QPCR besteht darin, dass die NF Kappa B-Aktivität kontinuierlich in Echtzeit im Leben gemessen werden kann. Fliegen Beginnen Sie mit der Bebrütung von Drosophila-Kulturen im späten Pupillenstadium für drei bis vier Tage, damit sich die erwachsenen Tiere an die Umweltbedingungen anpassen.

Hier werden die Fliegen unter konstantes Licht gesetzt, um den Einfluss der zirkadianen Uhr auf die Immunantwort und das Verhalten zu eliminieren. Als nächstes laden Sie ein bis vier Tage alte Fliegen in die Aktivität. Monitore zeichnen ihre Aktivität mindestens drei Tage vor der Infektion auf, einen Tag vor der geplanten Infektion.

Entnehmen Sie eine einzelne SIA-Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze und tauchen Sie die Spitze in ein Kulturröhrchen mit fünf Millilitern LB-Medium, um die sterile Technik zu überprüfen. Vergessen Sie nicht, eine Kontroll-Scheinkultur ohne Bakterien durchzuführen. Züchten Sie Bakterien über Nacht, bis sie am nächsten Tag die exponentielle Wachstumsphase erreichen.

Messen Sie die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern. Fügen Sie einen zweiten Q-Tierarzt als Rohling hinzu. Es ist fertig, wenn die Konzentration zwischen 0,5 und einer Absorptionseinheit Subkultur liegt oder die Kulturzeit nach Bedarf verlängert wird.

Bereiten Sie nun die bakterielle Lösung vor, um die Fliegen zu infizieren. Verdünnen Sie die Bakterien mit PBS auf eine erwartete Absorption von 0,1 bei 600 Nanometern. Fügen Sie dann Lebensmittelfarbe für die Injektionskontrolle hinzu.

Ersetzen Sie die Bakterien durch LB-Medium. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis. Stellen Sie anschließend mit einem Mikropipettenabzieher unter einem Präpariermikroskop Injektionsnadeln mit feiner Spitze her.

Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Spitze jeder Nadel ab, so dass die Öffnung groß genug ist, um sich durch Saugen mit Injektionsflüssigkeit zu füllen, aber auch klein genug, um Schäden an der Fliege zu minimieren. Befestigen Sie mit der Spritze eine Glasnadel an einer Kunststoffspritze mit einem Durchmesser von drei cm³ Kunststoff. Der Durchfluss des Injektionsmediums wird manuell gesteuert.

Vermeiden Sie es, den Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit zu kontaminieren, da das Spritzengerät sowohl für infektiöse als auch für Kontrollinjektionen verwendet wird. Überprüfen Sie den Fluss des Injektionsmediums mit einem Kim-Wischtuch. Zwei wichtige Details für eine erfolgreiche Injektion sind die optimale Nadelgröße und die sichere Abdichtung zwischen Nadel und Spritze.

Sobald das Injektionssystem vollständig vorbereitet ist, betäuben Sie die Fliegen mit einem minimalen Kohlendioxidfluss und fahren Sie schnell fort, damit keine Fliegen länger als fünf Minuten betäubt werden. Injizieren Sie nun Fliegen, indem Sie die Glasnadel in den Bereich über dem schrägen Tellum des dorsalen Thorax stechen. Der Übergang des Injektionsmediums in die Fliege wird durch die Lebensmittelfarbe bestätigt, die beim Ausbreiten der injizierten Lösung zu sehen ist.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Materialien, die für dieses Verfahren verwendet werden, mindestens einen Tag im Voraus autoklaviert wurden. Bereiten Sie 10 Zentimeter große Petrischalen mit LV-Agar-Medium zu. Am Tag des Experiments die Fliegen anästhesieren und in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen legen.

Bereiten Sie mindestens zwei Gruppen von je 10 Fliegen pro Versuchsbedingung vor. Bereiten Sie auch eine Kontrollgruppe von Fliegen ohne Infektion vor, insbesondere wenn Sie einen Bakterienstamm ohne Antibiotikaresistenz verwenden. Lagern Sie alle geladenen Röhrchen auf Eis.

Geben Sie als Nächstes 400 Mikroliter LB-Medium in jedes fliegenbeladene Röhrchen. Homogenisieren Sie die Fliegen mit einem kleinen Geläut und tun Sie dies in der Nähe einer Flamme, um eine Kontamination zu vermeiden. Verdünnen Sie nun mit den abgeschnittenen Pipettenspitzen das Homogenat seriell um den Faktor 10 in einem Volumen von 200 Mikrolitern.

Wenn das Homogenat unmittelbar nach der Infektion mit Sia hergestellt wird, machen Sie Dilu bis zu eins zu 1000, aber für 24 Stunden, nach der Infektion Homogenat, machen Sie bis zu eins zu 100.000. Der nächste Samen, die beiden größten Dilu auf 10 Zentimeter großen Platten, mit Glaskugeln, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, brüten die Platten über Nacht aus. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Völker auf dem Teller durch direkte Beobachtung oder über eine Koloniezählsoftware.

Berechnen Sie dann die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Fliege. Bei diesem Assay werden transgene Fliegen verwendet, die den Kappa-b-Luciferase-Reporter zum richtigen Zeitpunkt tragen. Der Assay erfordert auch kultivierte Bakterien wie SCIA, die für die Injektion vorbereitet wurden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

Passen Sie die Fliegen an die experimentellen Lichtverhältnisse an. In diesem Beispiel werden ein- bis vier Tage alte Kappa-b-Luziferase-Fliegen in Fläschchen mit 5 % Saccharose und 2 % Agar-Lebensmittelmedium untergebracht und zwei Tage lang in konstantem Licht gelagert. Bereite nun eine 96 Well Mikroplatte für die Fliegen vor.

Füllen Sie jede Mulde mit zwei Schichten Futter. Zuerst 300 Mikroliter 5%ige Saccharose- und 2%Agar-Lösung hinzufügen. Decken Sie die Platte gut mit einem feinmaschigen Tuch ab und lassen Sie die Platte bis zu einer Stunde lang gründlich trocknen.

Fügen Sie als Nächstes eine 50-Mikroliter-Deckschicht zu jeder Vertiefung hinzu, die 5 % Saccharose, 1 % Agar und zwei Millimolare Luzifer enthält. Da Luzifer lichtempfindlich ist, lassen Sie die Platte im Dunkeln trocknen und gehen Sie weiter. Minimieren Sie die Lichteinwirkung der Platte.

Sobald der Agar abgekühlt ist, decken Sie die Platte mit klarer Klebefolie ab. Perforieren Sie dann die Folie mit einer feinen Nadel zweimal über jede Vertiefung. Diese Löcher ermöglichen den Luftaustausch und die Gasanästhesie.

Um das Laden der Fliegen zu erleichtern, verwenden Sie als Nächstes eine scharfe Klinge und eine gerade Kante, um einen Schnitt zwischen den einzelnen Spalten einzuführen. Betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und laden Sie sie Spalte für Säule in jede Vertiefung. Sollte eine Fliege an der Folie hängen bleiben, geben Sie ihr die Möglichkeit, sich zu befreien, bevor Sie eingreifen.

Stellen Sie die Mikrotiterplatte wieder acht bis 24 Stunden lang unter konstantem Licht in den Inkubator. Um die gut gebundenen Fliegen zu betäuben, verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, die an einer Niederdruck-Kohlendioxidleitung befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das Gas einen harmlos niedrigen Druck hat, und platzieren Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Beatmungslöchern, um eine Fliege in Achtergruppen einzeln zu betäuben.

Setze jede Fliege auf ein CO2-Pad und infiziere sie wie bisher mit Bakterien. Setzen Sie dann jede Fliege wieder in ihre ursprüngliche Vertiefung ein und verschließen Sie die Mikroplatte wieder. Messen Sie die Lumineszenz in jeder Fliege mit einem Luminometer, das in einem klimatisierten Raum unter einem definierten Beleuchtungsplan untergebracht ist.

Legen Sie die Platten in die Stapelkassette ein und achten Sie darauf, dass die Platten mit den Fliegen zwischen durchsichtigen Blankoplatten gestapelt werden. Programmieren Sie das Luminometer gemäß den Herstellerangaben und erfassen Sie mindestens 24 Stunden lang stündlich Messwerte. In diesem Beispiel sind die Detektoren so programmiert, dass sie jede Vertiefung 10 Sekunden lang lesen.

Exportieren Sie die Datendateien anschließend in eine Tabelle und führen Sie eine Standardanalyse durch, in der die Ergebnisse grafisch dargestellt werden. Die Beispieldaten können analysiert werden. Die Abschläge pro Sekunde wurden im Durchschnitt von drei Messwerten pro Vertiefung berechnet.

Der Wildtyp Canton S fliegt und genießt. E 20 mutierte Fliegen, denen das NF kappa B-Gen fehlte, wurden bei konstantem Licht in zwei Aktivitätsmonitore geladen und mit Sia infiziert. In diesem Beispiel förderte die Infektion den Schlaf.

Es zeigte sich, dass relish E 20-Mutanten nach der Infektion weniger Schlaf erlebten als Canton-Mutanten. In Übereinstimmung mit früheren Befunden erlagen auch die Relish-E-20-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen schnell der Infektion.

Die meisten Fliegen überlebten die aseptische Kontrollinjektion, was darauf hindeutet, dass die Fliegen der Infektion und nicht der Verletzung durch die Injektion erlagen. Da die Relish-Mutanten so schnell starben, wurden nur Kanton-Fliegen verwendet, um die Bakterienlast nach der Infektion nachzuweisen. Sia vermehrte sich 24 Stunden nach der Infektion in der Fliege weiter.

Luzifers Reporteraktivität zeigte große Unterschiede zwischen einzelnen Fliegen und zwischen dem Erfolg der Datenpunkte. Obwohl das Signal von allen Geweben in der Fliege abgeleitet wird, ist nicht zu erwarten, dass jedes Gewebe die gleiche Signalmenge aussendet, und die Sichtbarkeit des Gewebes für den Detektor würde variieren, wenn sich die Fliege bewegt. In diesem Beispiel wurden Fliegen infiziert und mit einer kontrollierten Kontrollgruppe verglichen.

Fliegen, die starben, wurden von der Analyse einer Gruppe von Fliegen ausgeschlossen. Die Aktivität der Luziferase-Reporter steigt nach der Infektion stetig an. Auch die Aktivität des Kappa b Luciferase-Reporters stieg nach aseptischen Verletzungen stetig an.

Die Spitzenaktivität lag sowohl nach der Verletzung als auch nach der Infektion bei etwa 12 Stunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Immunfunktion und den Schlaf bei SSO nach einer Infektion quantifizieren können. Wir können Schlaf, Überleben, Zeit, bakterielle Clearance und die Echtzeitaktivität eines Un-Kopien-Transkriptionsreporters messen.