Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Das übergeordnete Ziel dieser groß angelegten Elektronenmikroskopie bzw. eines Nanotomie-Experiments ist es, Veränderungen von der makromolekularen Ebene zur Gewebeebene, im heutigen Fall im degenerierenden Zebrafischgehirn, zu definieren. Die Nanotomie kann helfen, zentrale Fragen der Lebenswissenschaften zu beantworten. Zum Beispiel bei der Neurodegeneration und in der Typ-1-Diabetes-Forschung.

Der Hauptvorteil der Nanotomie besteht darin, dass unvoreingenommene Informationen gewonnen werden, die von Makromolekülen, Organellen, Zellen bis hin zu Geweben reichen. Dies ermöglicht die Quantifizierung und den Open-Access-Datenaustausch über nanotomy.org. Obwohl die Nanotomie Einblicke in die Immunerhaltung und Mikroglia im neurodegenerativen Gehirn des Zebrafisches bietet, wird sie auch auf andere Krankheitsmodelle angewendet, darunter Zellkulturen, Maus- und sogar menschliches Gewebe.

Im Allgemeinen haben Wissenschaftler, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da die Datenmenge überwältigend ist. Dies kann tausendmal mehr sein als mit herkömmlichem EM. Nach dem Fixieren der Zebrafischlarven gemäß dem Textprotokoll werden die Larvenköpfe rostral zum Hinterhirn geschnitten, um das Eindringen des Osmiums zu erleichtern. Legen Sie die Larven in 1 % Osmiumtetroxid, 1,5 % Kaliumferrocyanid, in 0,1 molare Natriumcacodylat und inkubieren Sie zwei Stunden lang auf Eis.

Verwenden Sie dann doppelt destilliertes Wasser, um die Embryonen dreimal für jeweils fünf Minuten zu spülen. Vor dem Einbetten müssen die Proben in einer Reihe von Ethanol dehydriert werden. Um die Embryonen einzubetten, entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht in verdünntem Epoxidharz gemäß dem Textprotokoll das verdünnte Harz und verwenden Sie reines Harz, um es zu ersetzen.

30 Minuten inkubieren, dann das Harz ein zweites Mal austauschen und weitere 30 Minuten inkubieren. Nachdem Sie das Harz ein drittes Mal aufgefrischt haben, inkubieren Sie es drei Stunden lang bei Raumtemperatur. Dann 15 Minuten lang bei 58 Grad Celsius inkubieren.

Zum Schluss eine Stunde lang unter niedrigem Druck bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie anschließend unter einem Präpariermikroskop eine Nadel oder einen Zahnstocher, um die Köpfe in handelsüblichen flachen Silikoneinbettungsformen auszurichten. Anschließend polymerisieren Sie das Epoxidharz über Nacht bei 58 Grad Celsius.

Wenn die Probe vollständig ausgehärtet ist, verwenden Sie Rasierklingen, um überschüssiges Harz vom Stummel zu entfernen. Um die richtige Positionierung zu erkennen, verwenden Sie ein Glasmesser oder ein Diamanthistomesser auf einem Ultramikrotom, um halbdünne Larvenschnitte für Toluidinblau/basisches Fuchsin zu schneiden. Übertragen Sie die halbdünnen Schnitte auf mikroskopische Objektträger, indem Sie sie mit einer Pasteurpipette aus Glas aufnehmen, deren Spitze durch Schmelzen in einer Flamme verschlossen wurde.

Auf einer heißen Platte trocknen, bis kein Wasser mehr übrig ist. Legen Sie anschließend die Proben in 1% Toluidinblau in Wasser und inkubieren Sie die Abschnitte 10 Sekunden lang auf einer heißen Platte, um sie zu färben. Nachdem Sie die Schnitte mit Wasser gespült haben, verwenden Sie 05 % basisches Fuchsin in 1 % Natriumtetraborat, um die Proben weitere 10 Sekunden lang zu färben.

Untersuchen Sie die Proben mit einem normalen Lichtmikroskop bei 10X bis 40X. Wenn die richtige Stelle oder Ausrichtung erreicht ist, verwenden Sie leicht identifizierbare anatomische Strukturen, einschließlich Riechgruben, Augen oder Grenzen zwischen grauer und weißer Substanz, um die interessierende Gehirnregion während der ultradünnen Schnitte zu identifizieren und den Schnittwinkel anzupassen, wenn die Probe gekippt wird. Fahren Sie mit dem Schneiden des Epoxidharzblocks mit einem Diamantmesser fort, um ultradünne 70-Nanometer-Abschnitte zu schneiden.

Montieren Sie jeden Abschnitt auf einem einzelnen Steckplatz L2 x 1 aus Kupfergitter mit Barcode, um die Erfassung ohne Unterbrechung durch Gitterstäbe zu ermöglichen. Ein Quadratmillimeter mag klein erscheinen. Es passt einfach in die Öffnung.

Auf diese Weise verhindern wir, dass Gitterstäbe unsere Probe blockieren. Beachten Sie, dass alle Artefakte, die in unserer Stichprobe eingeführt werden, im Vergleich zu herkömmlichen EM aufgezeichnet werden. Die Proben gemäß dem Textprotokoll mit Schwermetallen kontrastieren und in einer Gitterbox aufbewahren. Um die Probe in das Rasterelektronenmikroskop (REM) zu montieren, legen Sie das Gitter aus dem Transferkasten mit dem Abschnitt in den Probenhalter mit mehreren Gittern und übertragen Sie es in die Kammer des REM.

Nachdem Sie den Detektor gemäß dem Textprotokoll ausgerichtet haben, bestrahlen Sie die Probe vor, indem Sie herauszoomen, sodass der gesamte zu scannende Bereich in das Bildfenster passt. Nachdem Sie die Blende auf 120 Mikrometer geändert und das Bild unscharf gemacht haben, verwenden Sie die Option für einen Scan mit reduziertem Bereich, um den gescannten Bereich so eng wie möglich zu gestalten. Stellen Sie als Nächstes die Framerate so ein, dass der Frame in etwa ein bis zwei Sekunden gescannt wird.

Vergrößern Sie dann mindestens das 100-fache und scannen Sie einen kleinen Bereich 10 Sekunden lang. Wenn sich die Helligkeit in dem Bereich immer noch ändert, fahren Sie mit der Vorbestrahlung fort. Wenn sich die Helligkeit dieses Bereichs im Vergleich zu seiner Umgebung nicht ändert, ist eine Vorbestrahlung ausreichend.

Wählen Sie im Fokus den hellsten Bereich oder das hellste Merkmal aus und stellen Sie die Scangeschwindigkeit so ein, dass Details sichtbar sind. Passen Sie in der Mikroskopsoftware die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie das Histogramm sorgfältig beobachten, um alle Pixel im Dynamikbereich zu halten. Machen Sie dasselbe für die dunkelsten Bereiche und Merkmale.

Gehen Sie zurück in den hellen Bereich, und überprüfen Sie erneut, ob auf beiden Seiten des Histogramms etwas Platz ist. Bei den Schritten vier, sechs bis vier acht muss die Einstellung von Helligkeit und Kontrast sehr sorgfältig vorgenommen werden, damit der gesamte Bereich innerhalb des Dynamikbereichs liegt. Verkleinern Sie die Ansicht, sodass der gesamte zu scannende Bereich in das Vorstellungsfenster passt, und starten Sie das Programm zur Erfassung großer Bereiche.

Verwenden Sie dann die Assistentenoption, um ein Mosaik einzurichten, indem Sie einen Bereich auf dem Bildschirm auswählen. Verwenden Sie eine Pixelgröße von zwei bis fünf Nanometern, je nachdem, welche Details erforderlich sind, und stellen Sie eine Verweilzeit von drei Mikrosekunden für die Rastertransmissionselektronenmikroskopie, kurz STEM, ein. Drücken Sie auf Optimieren, um die Mikroskopeinstellungen zu überprüfen, und die benötigte Zeit wird angezeigt.

Schalten Sie dann den externen Scan-Generator wieder ein und drücken Sie auf Weiter. Um die STEM-Daten zu analysieren, öffnen Sie ein groß angelegtes EM-Dateibetrachtungsprogramm und öffnen Sie die Datei mit dem Namen mosaic info, die die gekachelten TIF-Dateien öffnet. Wählen Sie die Option "Gesamtes Mosaik automatisch zusammenfügen" und wählen Sie die folgenden Parameter aus: Der Überlappungsmodus entspricht der Hälfte, der Stitching-Schwellenwert beträgt 0,90 und die Rauschunterdrückung entspricht der Automatik.

Wenn die Fügekriterien nicht erfüllt werden können, vergrößern Sie die Maus, platzieren Sie die Kachel manuell an ihrer Position und klicken Sie auf Weiter wie sie sind.Exportieren Sie die Daten als HTML-Datei oder als einzelnes TIF. Geben Sie die endgültige Pixelgröße und den Dateinamen an, um spätere Messungen zu ermöglichen, und analysieren Sie die Daten dann gemäß dem Textprotokoll. Wie hier gezeigt, zeigt die Nanotomie von Schnitten des Kontrollgehirns typische ultrastrukturelle Merkmale des Nervengewebes des rostralen Vorderhirns, einschließlich olfaktorischer Faserbündel, neuronaler Kerne und neuronaler Unterkompartimente einschließlich Synapsen.

Hier umfassen subzelluläre Strukturen unterschiedliche Kernmorphologien und -herde in verschiedenen Zelltypen und Organellen, einschließlich des Golgi-Apparats, des endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrien, der synaptischen Vesikel und der postsynaptischen Dichten. Unerwarteterweise sind die Zellkerne der Zellen, die den Ventrikel auskleiden, im Vergleich zu anderen Zellen, die im Gehirn weiter seitlich verteilt sind, sehr elektronendicht. In Mikroglia zeigen die Zellkerne auch dunkle Herde, möglicherweise Heterochromatin, die in anderen Zellen des Gehirns fehlen.

Dieses Bild einer großflächigen EM eines koronalen Schnitts in einer Zebrafischlarve, die sich einer neuronalen Ablation unterzieht, zeigt phagozytäre Mikroglia. Merkmale, die für Mikroglia in Säugetierzellen charakteristisch sind, wurden auch in diesen Zellen gefunden, darunter ein markanter Golgi-Apparat und zahlreiche Einschlüsse wie Lysosomen. Einmal gemeistert, kann die Akquisition innerhalb eines Tages durchgeführt werden, wobei traditionelle EM Sie mindestens eine Woche kosten wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass ein Mikroskopbediener eine entscheidende Rolle bei der Erzielung qualitativ hochwertiger Bilder spielt. Dies ist nicht nur eine Technik auf Knopfdruck. Wir haben die Nanotomie nun nicht nur auf das Zebrafischmodell der neuronalen Degeneration angewendet, sondern auch für die Immunmarkierung von Zellen und zur Untersuchung von Geweben von Fliegen, menschlichem Gewebe und mehr.

Diese Technik ebnet den Weg für alle Forscher in jedem Bereich. Sie können die Datensätze online auf nanotomy.org erneut aufrufen. Sie können dann mutmaßliche Veränderungen untersuchen, die von der Nanometer- bis zur Millimeterskala reichen, und alle untersuchten Modelle.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Nanotomie auf Ihre Forschungsfrage und das Zell- oder Gewebesystem, das Sie untersuchen, anwenden können. Vergessen Sie nicht, dass nur ein Fachmann die Probenvorbereitung durchführen sollte, wegen der giftigen Reagenzien und der ethischen Überlegung, aber jeder kann die Website Nanotomie ausprobieren. org zu Hause.