Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Rahmens ist es, Gene zu identifizieren, die an einer weitreichenden Ernährungseinschränkung beteiligt sind, die Umweltinformationen zu quantifizieren, die durch ihre Expressionsniveaus kodiert werden, und die zugrunde liegende Kodierungsstrategie zu verstehen, die die Umwelt mit der Lebensdauer verbindet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie des Alterns zu beantworten, z. B. welche Gene Informationen aus der Umwelt übertragen, um die Lebensdauer zu modulieren. Obwohl dieser Rahmen einen Einblick in das sensorische System von C Elegan geben kann, kann er auch allgemeiner auf jedes biologische System angewendet werden, dessen Komponenten zusammenarbeiten, um Umweltinformationen zu verarbeiten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die von Gruppen der Neuronen kodierten Umgebungsinformationen quantifiziert und die Kodierungsstrategie bestimmt, die von Neuroselquiten verwendet wird, um diese Informationen an nachgeschaltete Ziele zu übermitteln. Nach der Kultivierung von OP50 auf MGM-Platten gemäß dem Textprotokoll werden jeweils 500 Milliliter LB-Medium in zwei Liter-Erlenmeyerkolben hergestellt und autoklavieren. Beimpfen Sie jeden Kolben mit einer einzelnen Kolonie OP50 und züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für etwa 14 Stunden.

Ergänzen Sie anschließend die Kulturen mit 50 Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter. Schütteln Sie die Kolben dann weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Kolben 15 Minuten lang auf Eis legen. Füllen Sie 450 Milliliter jeder Kultur in separate sterile 500-Milliliter-Zentrifugenflaschen um und bewahren Sie die übrig gebliebene Kultur auf Eis auf, da sie zur Bestimmung der Bakterienkonzentration verwendet wird.

Schleudern Sie die Flaschen 25 Minuten lang bei 4500 x G und vier Grad Celsius, entsorgen Sie dann den Überstand und lagern Sie die Flaschen auf Eis. Mit 900 Mikrolitern sterilem LB werden 100 Mikroliter übrig gebliebene Kultur aus jedem Kolben verdünnt. Verwenden Sie einen Milliliter steriles LB, um das Spektralphotometer auf Null zu setzen, und bestimmen Sie dann den OD600 der 10-fachen Verdünnung jeder Kultur.

Wenn zum Beispiel der OD600 der 10-fachen Verdünnung der Overnight-Kultur 0,28 beträgt, dann hatte die Kultur einen tatsächlichen OD600 von 2,8. Um aus diesem Beispiel zu einer Arbeitslösung von 1,12 x 10 bis zur 10. OP50-Zellen pro Milliliter zu gelangen, was einer OD600 von 56 entspricht, resuspendieren Sie das Pellet aus der 450-Milliliter-Kultur in einem 20stel des ursprünglichen Volumens oder 22,5 Millilitern steriler S-Basallösung oder SB, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin. Alle nachfolgenden Konzentrationen, die in Versuchen mit SB und Streptokokken verwendet werden, sind aus seriellen Verdünnungen des Arbeitsmaterials unter Verwendung der in dieser Tabelle aufgeführten Verdünnungsfaktoren zu ermitteln.

Nach der Kultivierung und Synchronisierung der C Elegans Reporterstämme gemäß dem Textprotokoll werden mit 15 Millilitern SB die Würmer nacheinander von den drei Platten abgewaschen und die Flüssigkeit in einem sterilen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Lassen Sie die L4-Larven auf natürliche Weise sedimentieren und saugen Sie dann bis auf etwa 0,5 Milliliter der Flüssigkeit alles ab. Bei den Wildtyp-Reporterstämmen entfernt dieser Typ alle Larven, die jünger als L4.In mutierten Hintergrund sind, dieser Schritt hilft bei der Entfernung aller verhafteten Larven, wie z. B. unsere, im Falle des Todes eines OK3125.

Verwenden Sie als Nächstes neun Milliliter SB, um die Würmer wieder zu suspendieren. Überwachen Sie erneut die Sedimentationsgeschwindigkeit der L4-Larven und saugen Sie dann alle bis auf etwa 0,5 Milliliter des Überstands ab, sobald die meisten L4-Larven pelletiert sind, bevor Sie den Vorgang wiederholen. Geben Sie 10 Mikroliter steriles S-Basalmedium, ergänzt mit 0,1 % pluronic F127, zu der Flüssigkeit, die die L4-Larven enthält.

Dieses wirkt als Tensid und verhindert, dass die Larven an der Innenfläche der Kunststoff-Pipettenspitzen haften bleiben. Mit einer P200-Pipettenspitze mit niedriger Retention werden die Larven vorsichtig wieder suspendiert und dann 150 Mikroliter auf drei 10 Zentimeter große RNAi-Platten aliquotiert, die mit 5 x 225 Mikrolitern Ei und fünf RNAi-Bakterien besiedelt sind. Achten Sie darauf, dass die Würmer gleichmäßig auf alle fünf Bakterienrasenflächen verteilt sind.

Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde, entfernen Sie alle Nicht-L4-Larven von den Platten, die nicht durch den Waschvorgang entfernt wurden, indem Sie sie manuell abpfen. Lagern Sie die Platten dann 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Um eine Breitband-DR einzuleiten, entfernen Sie alle jungen Larven, die dem vorherigen manuellen Entnahmeschritt entkommen sind, und lassen Sie nur die einen Tag alten Erwachsenen auf den Tellern zurück.

Verwenden Sie für jeden Stamm 15 Milliliter sterile SB-Streptokokken, um die einen Tag alten Erwachsenen von den drei Platten in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu waschen. Lassen Sie die Würmer auf natürliche Weise sedimentieren und saugen Sie dann alle bis auf 0,5 Milliliter des Überstands ab. Suspendieren Sie die Würmer erneut mit 9,5 Millilitern SB-Streptokokken und wiederholen Sie die Sedimentations- und Waschschritte.

Nach dem abschließenden Waschen und Absaugen aller bis auf 0,5 Milliliter des Überstands fügen Sie 10 Mikroliter SB Plu hinzu und verwenden Sie eine P200-Pipettenspitze, um die Larven vorsichtig wieder zu suspendieren. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter der Larven auf eine NSC-Platte, die mit 5 x 225 Mikrolitern Bakterien besiedelt ist, in einer Konzentration von 2 x 10 bis zur neunten Zellzahl pro Milliliter. Verteilen Sie die 100 Mikroliter gleichmäßig auf alle fünf Bakterienrasenflächen.

Schätzen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der Tiere auf der Platte, wobei Sie zwischen 100 und 150 Würmer pro Platte anstreben. Bestimmen Sie das Flüssigkeitsvolumen, das erforderlich ist, um eine Wurmdichte innerhalb dieses Bereichs zu erreichen, und aliquotieren Sie es dann auf zwei zusätzliche Platten. Passen Sie die Anzahl der Würmer auf der ersten Platte so an, dass sie ebenfalls in diesen Bereich fällt.

Und dann lagern Sie die Platten 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Am nächsten Tag sammeln Sie die zwei Tage alten Erwachsenen und verteilen die Würmer auf neue NSC-Platten, die mit dem Wunsch nach experimenteller Konzentration von Nahrung besät sind. Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde, stellen Sie die Platten für 24 Stunden auf die gewünschte experimentelle Temperatur ein.

Am nächsten Tag sammeln Sie die drei Tage alten erwachsenen Tiere und verteilen sie auf frische NSC-Teller, die mit der gleichen experimentellen Futterkonzentration besät werden. Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde, bringen Sie die Platten für 48 Stunden auf die experimentelle Temperatur zurück. Verwenden Sie abschließend ein mikrofluidisches Gerät, um die Tiere abzubilden, bevor Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll zusammenstellen und quantifizieren.

Wie hier gezeigt, zeigt die mittlere Lebensdauer des Wildtyp-n2-Stammes eine komplexe Reaktion auf Breitbereichs-DR. Das Ausmaß dieser Reaktion wird in einer Gesamtmutante des daf-7-Gens abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass dieses Gen die Fähigkeit des Wurms beeinflusst, korrekt auf Veränderungen des Nahrungsangebots zu reagieren. Die mittleren Expressionsniveaus eines transkriptionellen Reporters für das daf-7-Gen und den Wildtyp-Hintergrund zeigen ebenfalls eine komplexe nicht-monotone Reaktion auf einen breiten Bereich DR.In dem daf-7(genetischen Hintergrund), die Expression dieses transkriptionellen Reporters ist stark abgeschwächt und zeigt eine geringe Reaktion auf Veränderungen des Nahrungsgehalts. Diese Abbildung veranschaulicht die Schätzung der gemeinsamen Verteilung der TPH1-Expression in ADF-Neuronen und der daf-7-Expression in ASI-Neuronen für eine gegebene Nahrungsmenge.

Diese Balkendiagramme zeigen die Lebensmittelinformationen, die entweder kombinatorisch oder einzeln von ADF-, ASI- und NSM-Neuronen kodiert werden, basierend auf den Genexpressionsniveaus von TPH1 und daf-7. Redundante und synergistische Charaktere der Kodierung ergeben sich aus dem Vergleich zwischen kombinatorischen und individuellen Informationen, die von Neuronen kodiert werden, dargestellt durch den Höhenunterschied der gestapelten Balken auf der rechten Seite, und der Information, die von der vollständigen Schaltung kodiert wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Replikation der Informationstheorie zur Quantifizierung der Kodierungsstrategie eine genaue Schätzung der Genexpressionsverteilungen erfordert.

Aus diesem Grund ist die Stichprobengröße ein kritischer Faktor für die allgemeine Anwendbarkeit dieses Frameworks. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie breit angelegte Experimente zur Ernährungseinschränkung durchführen können, um neue Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, die den Nahrungsreichtum mit der Lebensdauer verbinden.