Name: Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung des proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans mit gewebespezifischen Polyglutamin-Fluoreszenzreportern. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung altersassoziierter Proteinaggregation in vivo.

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Wir möchten den ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Samuelson-Labors für ihre Unterstützung bei der Verfeinerung dieser Methode und/oder Diskussion danken, die die Entwicklung dieses Manuskripts unterstützt hat. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute on Aging der National Institutes of Health unter den Award-Nummern RF1AG062593 und R21AG064519 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das Altern ist durch einen allmählichen Rückgang der Proteostase gekennzeichnet. Die Proteostase wird durch ein komplexes System, das proteostatische Netzwerk, zur koordinierten, dynamischen, stressreaktionsschnellen Steuerung von Proteinfaltung, -abbau und -translation aufrechterhalten. Warum die Proteostase im Laufe des Alterns versagt, ist kaum verstanden, aber ein zerfallendes Epigenom, eine abnehmende Induzierbarkeit von Stressreaktionen und der Verlust von kompensatorischem Crosstalk fallen alle mit diesem Zusammen...

Proteinhomöostase (Proteostase) ist definiert als die zelluläre Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms aufrechtzuerhalten. Die inhärente Herausforderung für die Proteostase besteht darin, sicherzustellen, dass alle Proteine ordnungsgemäß gefaltet und in einer nativen Konformation gehalten werden, die durch die vielfältige Natur der Proteingröße, der Aminosäurezusammensetzung, der strukturellen Konformation, der Stabilität, des Umsatzes, der Expression, der subzellulären Kompartimentierung und der Modifikationen weiter verstärkt wird1. Die Proteostase wird durch die koordinierte Wirkung eines großen proteostatischen Netzwerks aufrechterhalten, das aus etwa 2000 einzigartigen Proteinen besteht, die die ordnungsgemäße Synthese, Faltung, den Transport und den Abbau innerhalb des Proteoms regulieren2,3. Die Arbeitspferdkomponenten des proteostatischen Netzwerks sind neun Hauptfamilien molekularer Chaperone4. Jeder Gewebe- und Zelltyp verwendet bevorzugt spezifische Untergruppen molekularer Chaperone, vermutlich in Übereinstimmung mit den unterschiedlichen Anforderungen verschiedener Proteome5.
Ein Kennzeichen der normalen organismischen Alterung ist der fortschreitende Rückgang und Zusammenbruch der zellulären Proteostase, von der angenommen wird, dass sie eine zugrunde liegende Grundlage für den Beginn und das Fortschreiten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten ist. Zum Beispiel haben Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ein gemeinsames Merkmal: In jedem Fall wird die Manifestation der Neurodegeneration durch genetische Veränderungen angetrieben, die ein mutiertes Protein für die Aggregation prädisponieren (Amyloid-β / Tau, α-Synuclein, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Während des Alterns nimmt die Integrität und Induzierbarkeit des proteostatischen Netzwerks ab, was zur Anhäufung von proteotoxischen Aggregaten führt, die zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration führen. Bemerkenswert ist, dass Protein-Konformationskrankheiten nicht nur auf Neuronen beschränkt sind und in mehreren Geweben auftreten, wie Typ-II-Diabetes, multiples Myelom und Mukoviszidose11,12,13,14. Daher wird die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von Krankheiten und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.
Der kleine Bodennematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) war maßgeblich an der Entdeckung von Genen und der Aufklärung von Signalwegen beteiligt, die die Proteostase verändern. Viele Komponenten des proteostatischen Netzwerks und der Signaltransduktionswege, die die Proteostase regulieren, sind evolutionär konserviert. Darüber hinaus hat C. elegans die Komplexität und Redundanz im Vergleich zu Wirbeltiersystemen reduziert, was es für die genetische Analyse und Genentdeckung zugänglicher macht. Weitere Vorteile von C. elegans, die dazu geführt haben, dass es als Modellsystem zur Untersuchung der Proteostase weit verbreitet ist, sind: leistungsstarke genetische und funktionelle Genomik, ein kurzer Lebenszyklus (3 Tage) und eine kurze Lebensdauer (3 Wochen), ein kompaktes und gut annotiertes Genom, die Verfügbarkeit einer breiten Palette genetischer Mutanten und die einfache Visualisierung gewebespezifischer Veränderungen in der Zellbiologie mit fluoreszierenden Reportern.
Der fortschreitende Zerfall der Proteostase während des Alterns kann leicht in C. elegans quantifiziert werden. Das Morimoto-Labor zeigte zunächst, dass eine Polyglutaminexpansion, die mit gelb fluoreszierendem Protein (polyQ::YFP) verschmolzen ist, zur Quantifizierung des proteostatischen Rückgangs von C. elegans während des Alterns verwendet werden kann15,16,17,18. YFP-Fusionen zu 35 Glutamin-Wiederholungen oder mehr führen zu einer altersbedingten Bildung von Fluoreszenzherden zusammen mit Anzeichen einer zellulären Pathologie. Bemerkenswert ist, dass dieser Bereich der Glutaminexpansion die Länge des Polyglutamintraktes des Huntingtin-Proteins widerspiegelt, bei dem die Pathologie der Huntington-Krankheit beim Menschen beobachtet wird (typischerweise >35 CAG-Wiederholungen)19. Stämme mit Expression von polyQ::YFP in Muskel-, Darm- oder neuronalen Zellen wurden verwendet, um zu bestätigen, dass der altersbedingte Rückgang der Proteostase über verschiedene Zell- und Gewebetypen hinweg auftritt. Die muskelspezifische PolyQ::YFP-Expression (d.h. unc-54p::Q35::YFP)war der am weitesten verbreitete gewebespezifische Reporter, da akkumulierende fluoreszierende Herde in den ersten Tagen des Erwachsenenalters mit einem einfachen fluoreszierenden Seziermikroskop leicht zu quantifizieren sind (Abbildung 1A-1B). Zusätzlich werden Tiere in der Lebensmitte gelähmt, da das Proteom im Muskel aufgrund der proteotoxischen Wirkung des Reporters kollabiert (Abbildung 1C). In ähnlicher Weise kann der altersbedingte Rückgang der neuronalen Proteostase (rgef-1p::Q40::YFP) durch direkte Quantifizierung der Herde/Aggregatbildung und altersassoziierter Rückgänge in koordinierten Körperbeugen nach dem Einbringen von Tieren in Flüssigkeit verfolgt werden (Abbildung 2).
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, wie das altersabhängige Fortschreiten der Proteinaggregatakkumulation und die damit verbundene Proteotoxizität, die durch die Expression von Polyglutamin-Wiederholungen in neuronalem und Muskelgewebe in C. elegansinduziert wird, gemessen werden kann. Wir liefern Beispiele für typische Ergebnisse, die mit diesen Stämmen und Methoden generiert werden. Darüber hinaus zeigen wir, wie wir diese Methoden verwendet haben, um die transkriptionelle Regulation des proteostatischen Netzwerks zu untersuchen. Wir besprechen zusätzliche Möglichkeiten, wie diese Reporter einfach in andere vorhandene Reagenzien integriert oder für größere Bildschirme angepasst werden können.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Kulturplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L 96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>96-poliger Plattenreplikator</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>Luftdurchlässige Plattendichtung</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>bakteriologischer Agar</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien - Ahringer</td><td>Quelle: Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Siehe auch Kamath et. al., Nature 2003.</td></tr><tr><td>C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Siehe auch Rual et. al., Genome Research 2004. Diese Bibliothek ist auch bei Dharmacon erhältlich.</td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluor-2'-desoxyuridin)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>Glasmikroskop-Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Objektträger</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-beta-D-1-thigalactopyranosid)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige, unbehandelte Single-Well-Platte, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td>242811</tr><tr><td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M2m Mikroskop mit AxioVision v4.8.2.0 Software</td><td>Zeiss</td><td>unbekannt</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>unbekannt</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen rückgangs bei caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Die Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms (Proteinhomöostase) aufrechtzuerhalten, nimmt während des normalen Alterns ab, was das Auftreten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten erleichtert. Zum Beispiel sind Proteine mit Polyglutamin-Expansionen anfällig für Aggregation, wie das Huntingtin-Protein und der gleichzeitige Ausbruch der Huntington-Krankheit zeigen. Die altersbedingte Verschlechterung des Proteoms wurde umfassend durch die Verwendung von transgenen Caenorhabditis elegans untersucht, die PolyQ-Wiederholungen exprimieren, die mit einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) verschmolzen sind. Dieses transgene PolyQ::YFP-Tiermodell ermöglicht die direkte Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs des Proteoms durch Abbildung der fortschreitenden Bildung von Fluoreszenzherden (d.h. Proteinaggregaten) und des anschließenden Auftretens von Fortbewegungsdefekten, die sich als Folge des Zusammenbruchs des Proteoms entwickeln. Darüber hinaus kann die Expression des polyQ::YFP-Transgens durch gewebespezifische Promotoren gesteuert werden, was die Beurteilung der Proteostase über Gewebe hinweg im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Dieses Modell ist für die genetische Analyse sehr gut geeignet und bietet somit einen Ansatz zur Quantifizierung des Alterns, der die Lebensdauerassays ergänzt. Wir beschreiben, wie die Bildung von PolyQ::YFP-Herden in Neuronen oder Körperwandmuskeln während des Alterns und das anschließende Auftreten von Verhaltensdefekten genau gemessen werden kann. Als nächstes zeigen wir auf, wie diese Ansätze für einen höheren Durchsatz und mögliche zukünftige Anwendungen mit anderen aufkommenden Strategien für die genetische Analyse von C. elegans angepasst werden können.

In C. eleganswar das Polyglutamin-Wiederholungsmodell maßgeblich an der Identifizierung von Genen beteiligt, die das proteostatische Netzwerk regulieren. Zum Beispiel haben wir zuvor gezeigt, dass die homöodomain-interagierende Proteinkinase (hpk-1), ein transkriptioneller Cofaktor, die Proteostase während des Alterns beeinflusst, indem sie die Expression der Autophagie und der molekularen Chaperone reguliert31. Wir fanden heraus, dass der Verlust von hpk-1,entweder durc...

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Die Verwendung der gewebespezifischen Expression von Polyglutamin-Fluoreszenz-Reporter in C.elegans ist von Bedeutung, da sie die Entdeckung und Charakterisierung von Proteostase-Regulatoren im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung und Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs der zellulären Proteostase in vivo ermöglicht, was wesentlich ist, um einen tieferen mechanistischen Einblick in die Aufrechterhaltung der richtigen Faltung und Funktion des Proteoms durch Organismen und die Auswirkungen des Alterns zu erhalten. Die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, wird die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von altersassoziierten Krankheiten, bei denen die Proteostase beeinträchtigt ist, und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.Der Zusammenbruch der Proteostase ist ein massives klinisches Problem, da er der Entwicklung von Proteinfehlfaltungskrankheiten zugrunde liegt, einschließlich Alzheimer, Parkinson, Huntington und amyotropher Lateralsklerose. Beginnen Sie mit der Verwendung von Petriplatten mit einem Durchmesser v

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der Lebensdauer von Nematoden auf festen Medien mit UV-getötet bakterielle Lebensmittel erhalten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Dieses Video zeigt einen auf Bildgebung basierenden In-vivo-Assay zur Bestimmung des altersbedingten Rückgangs der Proteostase. Der Assay verwendet Caenorhabditis elegans, das Polyglutamin-YFP-Fusionsprotein in der Körperwandmuskulatur exprimiert, um die altersassoziierte Aggregation von Polyglutamin und die Induktion von Proteotoxizität zu messen, die zu Lähmungen führt.

Fluoreszierender Reporter-basierter Lähmungsassay: Eine Technik zur Beurteilung der altersassoziierten progressiven Bildung von Polyglutamin-Fluoreszenz-Reportern und der damit verbundenen Lähmung bei Caenorhabditis elegans

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen C. elegans

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus der gleichen Probe in einer Bemühung zu reduzieren Variation, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Interpretationen zu erleichtern.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir eine nicht-radioaktive und nichtinvasive Methode zur Bewertung der de novo Proteinsynthese in vivo vor und beschreiben sie unter Verwendung des Nematoden Caenorhabditis elegans und der Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP). Diese Methode kann mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens kombiniert werden, um neuartige Modulatoren der Proteinsynthese zu identifizieren.

Bewertung der de novo Proteinsyntheseraten bei Caenorhabditis elegans

Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die Quantifizierung des proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans mit gewebespezifischen Polyglutamin-Fluoreszenzreportern. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung altersassoziierter Proteinaggregation in vivo.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

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