Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans
7. September 2021
Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.
Die Verwendung der gewebespezifischen Expression von Polyglutamin-Fluoreszenz-Reporter in C.elegans ist von Bedeutung, da sie die Entdeckung und Charakterisierung von Proteostase-Regulatoren im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung und Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs der zellulären Proteostase in vivo ermöglicht, was wesentlich ist, um einen tieferen mechanistischen Einblick in die Aufrechterhaltung der richtigen Faltung und Funktion des Proteoms durch Organismen und die Auswirkungen des Alterns zu erhalten. Die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, wird die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von altersassoziierten Krankheiten, bei denen die Proteostase beeinträchtigt ist, und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.
Der Zusammenbruch der Proteostase ist ein massives klinisches Problem, da er der Entwicklung von Proteinfehlfaltungskrankheiten zugrunde liegt, einschließlich Alzheimer, Parkinson, Huntington und amyotropher Lateralsklerose. Beginnen Sie mit der Verwendung von Petriplatten mit einem Durchmesser von 6 Zentimetern, um fünf Agarplatten für jede Testbedingung vorzubereiten. Induzieren Sie für Experimente mit RNAi die dsRNA-Produktion in transformierten HT115 E.coli und verwenden Sie RNAi-Agar.
Verwenden Sie OP50 E.coli auf Standard-NGM-Agar für Experimente ohne RNAi. Züchten Sie die E. coli-Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius, während Sie bei 220 U / min schütteln. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 2,400 G für 15 bis 20 Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Zehntel des Startvolumens von lb.
Aliquotieren Sie 200 Mikroliter konzentrierte Bakterien auf jede Platte und lassen Sie die offenen Platten in einer sauberen Umgebung trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit absorbiert wurde. Um die C.Elegans mit der Hypochloritbehandlung zu synchronisieren, waschen Sie gravide Hermaphrodite zweimal mit M9-Puffer, geben Sie sie dann in ein frisches Röhrchen und inkubieren Sie in 5 Milliliter Hypochloritlösung für fünf Minuten, wobei Sie sie jede Minute schütteln. Drehen Sie die Tiere nach der Inkubation herunter und waschen Sie sie dreimal mit M9-Puffer.
Lassen Sie die Embryonen über Nacht in Röhren in 3 Millilitern M9-Lösung mit einer Rotation bei 20 Grad Celsius schlüpfen. Berechnen Sie die Dichte von L1-Tieren, indem Sie 10 Mikroliter L1-Lösung dreimal auf eine 6-Zentimeter-Platte fallen lassen und die Anzahl der L1-Tiere zählen. Mischen Sie regelmäßig die L1-Lösungen, um zu verhindern, dass sich die Tiere niederlassen.
Säen Sie 50 L1 ein Tier auf jede Platte, zählen und notieren Sie die Anzahl der Ausgesäten und bewegen Sie die Platten in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator. Alternativ, um Tiere per Eiablage zu synchronisieren, legen Sie fünf bis zehn junge, gravide erwachsene Tiere für vier bis sechs Stunden auf jeden Teller und lassen Sie sie Eier legen, bis es ungefähr 50 Eier pro Teller gibt. Entfernen Sie alle graviden Erwachsenen und bewegen Sie die Platten mit den Eiern in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator.
Züchten Sie die Tiere bis zum L4-Stadium, das bei 20 Grad Celsius etwa 40 Stunden dauert. Dann fügen Sie 50 Mikroliter von 160 mal FUDR hinzu. Um den Rückgang der Proteostase im Muskelgewebe zu messen, wählen Sie 20 Tiere aus und montieren Sie sie auf einem Objektträger mit einem 3% Agarose-Pad und einem 5-Mikroliter-Tropfen 10 Millimol-Natriumazid.
Nachdem alle Würmer immobilisiert sind, stellen Sie sich den ganzen Körper der Tiere mit einer 10-fachen Vergrößerungslinse vor. Verwenden Sie einen FITC- oder YFP-Filter und die gleiche Exposition für jedes Tier. Wenn Sie fertig sind, verwerfen Sie die Folien.
Zählen Sie die Anzahl der Herde in den Körperwandmuskeln des ganzen Tieres. Foci sind hellere punktuelle Signale, die von dem dimmerlöslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können. Schauen Sie sich an den Scoring-Tagen die Teller mit den Tieren an und notieren Sie die Anzahl der gelähmten Tiere, dann entfernen Sie gelähmte Tiere von der Platte.
Berechnen Sie nach Abschluss des Experiments die Lähmungsrate für jede Bedingung und zeichnen Sie den Verlauf der Lähmung auf. Um den Rückgang der Proteostase im neuronalen Gewebe zu messen, montieren Sie die Würmer wie zuvor beschrieben auf einem Objektträger und nehmen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfes der Tiere auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einer 40-fachen Vergrößerungslinse auf. Verwerfen Sie die Objektträger nach der Bildgebung.
Nachdem Sie die Bilder aufgenommen haben, flachen Sie die Z-Stacks ab und verwenden Sie sie, um die Anzahl der Herde in Neuronen zu quantifizieren, die sich im Nervenringbereich befinden. Zeichnen Sie den Verlauf der YFP-Foci-Akkumulation ab den Tagen 4, 6, 8 und 10 auf. Am zweiten Tag des Erwachsenenalters pflücken Sie 10 synchronisierte Tiere von der Platte und legen Sie sie auf einen 10 Mikroliter Tropfen M9-Puffer auf einem Objektträger.
Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal, um eine Probe von 40 oder mehr Tieren zu erhalten. Videoaufzeichnung der Bewegung der Tiere für einen Zeitraum von 30 Sekunden auf einem Stereomikroskop mit einer videofähigen Kamera. Sobald alle Videos mit den zu analysierenden Tieren aufgenommen wurden, spielen Sie das Video ab und bewerten Sie die Körperbeugen jedes Tieres.
Zeichnen Sie die Anzahl der Körperbiegungen für jedes Tier in einem Säulendiagramm auf, wobei jeder Punkt die Anzahl der Körperbiegungen in 30 Sekunden auf der Y-Achse und die verschiedenen auf der X-Achse getesteten Bedingungen darstellt. Das Polyglutamin-Wiederholungsmodell war maßgeblich an der Identifizierung von Genen beteiligt, die das proteostatische Netzwerk regulieren. Die muskelspezifische PolyQ-YFP-Expression führt zu einer Anhäufung von Fluoreszenzherden, die unter einem einfachen Fluoreszenz-Seziermikroskop leicht zu quantifizieren sind.
Die Tiere werden in der Lebensmitte gelähmt, da das Proteom im Muskel aufgrund der proteotoxischen Wirkung des Reporters zusammenbricht. Dem altersbedingten Rückgang der neuronalen Proteostase kann eine direkte Quantifizierung der Aggregatbildung und des Rückgangs der koordinierten Körperbeugen nach dem Einbringen von Tieren in Flüssigkeit folgen. Diese Methode wurde verwendet, um zu zeigen, dass die homöo-domäneninterwirkende Proteinkinase, ein transkriptioneller Cofaktor, die Proteostase während des Alterns beeinflusst, indem sie die Expression von Autophagie und molekularen Chaperonen reguliert.
Der Verlust von HPK-1 erhöht die Anzahl der Q35-YFP-Aggregate, die sich während des Alterns ansammeln. Kontrolltiere zeigten durchschnittlich 18 Aggregate, während die mit HPK1 null mutierten und HPK1 RNAi behandelten Tiere durchschnittlich 28 bzw. 26 Aggregate aufwiesen. Am achten Tag des Erwachsenenalters waren 77 bis 78% der TIERE mit HPK1-Mangel gelähmt, verglichen mit nur 50% der Kontrolle.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Überexpression von HPK1 die Bildung von Proteinaggregaten reguliert und alternde Tiere vor Q35-YFP-assoziierten Lähmungen während des Alterns schützt. Diese Methode misst den allgemeinen Rückgang des Proteoms innerhalb eines Zelltyps. Es gibt viele Methoden, um Veränderungen in bestimmten Komponenten des Prostatanetzwerks zu bewerten.
Zusammen ergeben sie ein umfassendes Bild. Abnehmende Proteostase ist ein Kennzeichen des Alterns. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, diesen Rückgang zu quantifizieren.
In Kombination mit der genetischen Analyse ist es ein mächtiges Werkzeug für die Entdeckung.
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Übersicht
Diese Studie untersucht den Rückgang der Proteostase als einen zentralen Faktor bei Alterung und neurodegenerativen Erkrankungen unter Verwendung eines C. elegans-Modells. Die Autoren nutzen die gewebespezifische Expression von polyglutaminhaltigen fluoreszierenden Reportern, um die Proteostase in vivo quantitativ zu messen, wodurch Einblicke in die altersassoziierten zellulären Funktionsminderungen ermöglicht werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Alterung
- Neurodegenerative Erkrankungen
- Proteostase
Hintergrund
- Der Rückgang der Proteostase ist mit Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson assoziiert.
- Das Verständnis der Mechanismen der Proteostase ist entscheidend für mögliche therapeutische Eingriffe.
- Die Verwendung eines vielzelligen Organismusmodells (C. elegans) erleichtert die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo.
Verwendete Methoden
- Gewebespezifische Expression eines fluoreszierenden Polyglutamin-Reporters
- Caenorhabditis elegans
- Mikroskopie zur Quantifizierung von Foci und Lähmungsrate
Hauptergebnisse
- Die Studie zeigt die Ansammlung fluoreszierender Aggregate in Muskel- und neuronalen Geweben von C. elegans als Zeichen eines Rückgangs der Proteostase.
- Ein Mangel an HPK-1 führte mit dem Alter zu einer erhöhten Bildung von Aggregaten.
- Es wurde eine Korrelation zwischen Proteostase und der Verschlechterung der motorischen Funktion nachgewiesen.
Schlussfolgerungen
- Diese Forschung unterstreicht die entscheidende Rolle der Proteostase bei Alterungsprozessen.
- Die Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklung von Maßnahmen zur Bekämpfung altersbedingter Erkrankungen durch Fehlfaltung von Proteinen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Abbaus bei C. elegans ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen in frühen Stadien neurodegenerativer Krankheitsmechanismen. Das Modell liefert quantitative, in-vivo-Lesewerte zur Proteinaggregation und zum funktionellen Verfall und stützt so die Vorhersagekraft bezüglich der Modulation von Signalwegen. Dieser Ansatz erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem genetische Störungen mit Proteostase-Ergebnissen in einem intakten, vielzelligen System verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung des altersassoziierten Proteostase-Zusammenbruchs in spezifischen Geweben.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung fluoreszierender Foci und Beweglichkeitsdefekte als phänotypische Messgrößen.
- Prädiktiver Wert: Korreliert molekulare Veränderungen mit verhaltensbezogenen Ausgaben und erhöht dadurch das Vertrauen in die Relevanz des Zielmoleküls für Krankheitsmechanismen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Bildgebungsdaten für das Hochdurchsatz-Screening von Proteostase-Modulatoren.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet synchronisierte Wurmpopulationen und konsistente Bildgebungsparameter, um eine zuverlässige Zählung von Foci über verschiedene Bedingungen hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Anpassbar an Mehrfach-Well-Formate und automatisierte Bildgebungssysteme zur Auswertung von Substanzbibliotheken.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert den Rückgang der Proteostase, der Alzheimer, Parkinson, Huntington und ALS zugrunde liegt, und ermöglicht die Identifizierung von Zielstrukturen für Erkrankungen durch Proteinfehlfaltung.
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Treffer (z. B. HPK-1) mit der Regulation von Autophagie und Chaperonen und liefert damit Einblicke in mechanistische Signalwege für therapeutische Ansatzpunkte.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der aggregierten Belastung und dem Fortschreiten der Lähmung und verringert so falsch-positive Ergebnisse bei der Leitstrukturauswahl.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in frühe Entdeckungs- bis präklinische Arbeitsabläufe integrierbar und liefert mechanistische Erkenntnisse nach der Zielidentifizierung und vor der Leitstruktur-Optimierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung des gewebespezifischen Verfalls der Proteostase als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Störungen.
- Screening: Bietet gebrauchsfertige, quantitative Messgrößen (Anzahl der Foci, Lähmungsrate) zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Proteinhomöostase.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich der Aggregationskinetik und des funktionellen Abbaus zwischen Genotypen oder Behandlungsgruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Chaperon- und Autophagiewege mit phänotypischen Ergebnissen und unterstützt so die biomarkerbasierte Zielstrukturauswahl.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur chronischen Beurteilung der Proteostase in mehreren gewebe- und genetikspezifischen, krankheitsrelevanten Kontexten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die Mechanismen von Proteostase-Netzwerken und reduziert die Uneindeutigkeit bei der Zielvalidierung für neurodegenerative Indikationen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, quantitative, bildbasierte Assays mit definierten Bewertungskriterien für Foci und Motilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem molekulare Zielstrukturen mit funktionellem Leistungsabfall in einem physiologisch relevanten Kontext verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen durch Quantifizierung des Proteostase-Rettungspotenzials in neuronalen und Muskelgeweben.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit C. elegans, in Mikroskopie sowie in der Pflege transgener Stämme.
- Abhängig von Fluoreszenzmikroskopiesystemen mit FITC/YFP-Filtern und kontrollierten Umweltbedingungen für Alterungsassays.
- Benötigt Synchronisationsprotokolle und standardisierte Bewertungskriterien zur Quantifizierung von Foci und Beurteilung von Lähmungen.
- Die Anpassung an verschiedene Gewebe beruht auf promotorgetriebener Expression und erfordert möglicherweise eine Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses in unterschiedlichen zellulären Kontexten.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen Durchsatzlimitierungen bei manueller Bildaufnahme und Variabilität in der Eindringtiefe von Aggregaten in dicken Geweben.
