Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Die Verwendung der gewebespezifischen Expression von Polyglutamin-Fluoreszenz-Reporter in C.elegans ist von Bedeutung, da sie die Entdeckung und Charakterisierung von Proteostase-Regulatoren im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung und Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs der zellulären Proteostase in vivo ermöglicht, was wesentlich ist, um einen tieferen mechanistischen Einblick in die Aufrechterhaltung der richtigen Faltung und Funktion des Proteoms durch Organismen und die Auswirkungen des Alterns zu erhalten. Die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, wird die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von altersassoziierten Krankheiten, bei denen die Proteostase beeinträchtigt ist, und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.

Der Zusammenbruch der Proteostase ist ein massives klinisches Problem, da er der Entwicklung von Proteinfehlfaltungskrankheiten zugrunde liegt, einschließlich Alzheimer, Parkinson, Huntington und amyotropher Lateralsklerose. Beginnen Sie mit der Verwendung von Petriplatten mit einem Durchmesser von 6 Zentimetern, um fünf Agarplatten für jede Testbedingung vorzubereiten. Induzieren Sie für Experimente mit RNAi die dsRNA-Produktion in transformierten HT115 E.coli und verwenden Sie RNAi-Agar.

Verwenden Sie OP50 E.coli auf Standard-NGM-Agar für Experimente ohne RNAi. Züchten Sie die E. coli-Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius, während Sie bei 220 U / min schütteln. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 2,400 G für 15 bis 20 Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Zehntel des Startvolumens von lb.

Aliquotieren Sie 200 Mikroliter konzentrierte Bakterien auf jede Platte und lassen Sie die offenen Platten in einer sauberen Umgebung trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit absorbiert wurde. Um die C.Elegans mit der Hypochloritbehandlung zu synchronisieren, waschen Sie gravide Hermaphrodite zweimal mit M9-Puffer, geben Sie sie dann in ein frisches Röhrchen und inkubieren Sie in 5 Milliliter Hypochloritlösung für fünf Minuten, wobei Sie sie jede Minute schütteln. Drehen Sie die Tiere nach der Inkubation herunter und waschen Sie sie dreimal mit M9-Puffer.

Lassen Sie die Embryonen über Nacht in Röhren in 3 Millilitern M9-Lösung mit einer Rotation bei 20 Grad Celsius schlüpfen. Berechnen Sie die Dichte von L1-Tieren, indem Sie 10 Mikroliter L1-Lösung dreimal auf eine 6-Zentimeter-Platte fallen lassen und die Anzahl der L1-Tiere zählen. Mischen Sie regelmäßig die L1-Lösungen, um zu verhindern, dass sich die Tiere niederlassen.

Säen Sie 50 L1 ein Tier auf jede Platte, zählen und notieren Sie die Anzahl der Ausgesäten und bewegen Sie die Platten in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator. Alternativ, um Tiere per Eiablage zu synchronisieren, legen Sie fünf bis zehn junge, gravide erwachsene Tiere für vier bis sechs Stunden auf jeden Teller und lassen Sie sie Eier legen, bis es ungefähr 50 Eier pro Teller gibt. Entfernen Sie alle graviden Erwachsenen und bewegen Sie die Platten mit den Eiern in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator.

Züchten Sie die Tiere bis zum L4-Stadium, das bei 20 Grad Celsius etwa 40 Stunden dauert. Dann fügen Sie 50 Mikroliter von 160 mal FUDR hinzu. Um den Rückgang der Proteostase im Muskelgewebe zu messen, wählen Sie 20 Tiere aus und montieren Sie sie auf einem Objektträger mit einem 3% Agarose-Pad und einem 5-Mikroliter-Tropfen 10 Millimol-Natriumazid.

Nachdem alle Würmer immobilisiert sind, stellen Sie sich den ganzen Körper der Tiere mit einer 10-fachen Vergrößerungslinse vor. Verwenden Sie einen FITC- oder YFP-Filter und die gleiche Exposition für jedes Tier. Wenn Sie fertig sind, verwerfen Sie die Folien.

Zählen Sie die Anzahl der Herde in den Körperwandmuskeln des ganzen Tieres. Foci sind hellere punktuelle Signale, die von dem dimmerlöslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können. Schauen Sie sich an den Scoring-Tagen die Teller mit den Tieren an und notieren Sie die Anzahl der gelähmten Tiere, dann entfernen Sie gelähmte Tiere von der Platte.

Berechnen Sie nach Abschluss des Experiments die Lähmungsrate für jede Bedingung und zeichnen Sie den Verlauf der Lähmung auf. Um den Rückgang der Proteostase im neuronalen Gewebe zu messen, montieren Sie die Würmer wie zuvor beschrieben auf einem Objektträger und nehmen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfes der Tiere auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einer 40-fachen Vergrößerungslinse auf. Verwerfen Sie die Objektträger nach der Bildgebung.

Nachdem Sie die Bilder aufgenommen haben, flachen Sie die Z-Stacks ab und verwenden Sie sie, um die Anzahl der Herde in Neuronen zu quantifizieren, die sich im Nervenringbereich befinden. Zeichnen Sie den Verlauf der YFP-Foci-Akkumulation ab den Tagen 4, 6, 8 und 10 auf. Am zweiten Tag des Erwachsenenalters pflücken Sie 10 synchronisierte Tiere von der Platte und legen Sie sie auf einen 10 Mikroliter Tropfen M9-Puffer auf einem Objektträger.

Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal, um eine Probe von 40 oder mehr Tieren zu erhalten. Videoaufzeichnung der Bewegung der Tiere für einen Zeitraum von 30 Sekunden auf einem Stereomikroskop mit einer videofähigen Kamera. Sobald alle Videos mit den zu analysierenden Tieren aufgenommen wurden, spielen Sie das Video ab und bewerten Sie die Körperbeugen jedes Tieres.

Zeichnen Sie die Anzahl der Körperbiegungen für jedes Tier in einem Säulendiagramm auf, wobei jeder Punkt die Anzahl der Körperbiegungen in 30 Sekunden auf der Y-Achse und die verschiedenen auf der X-Achse getesteten Bedingungen darstellt. Das Polyglutamin-Wiederholungsmodell war maßgeblich an der Identifizierung von Genen beteiligt, die das proteostatische Netzwerk regulieren. Die muskelspezifische PolyQ-YFP-Expression führt zu einer Anhäufung von Fluoreszenzherden, die unter einem einfachen Fluoreszenz-Seziermikroskop leicht zu quantifizieren sind.

Die Tiere werden in der Lebensmitte gelähmt, da das Proteom im Muskel aufgrund der proteotoxischen Wirkung des Reporters zusammenbricht. Dem altersbedingten Rückgang der neuronalen Proteostase kann eine direkte Quantifizierung der Aggregatbildung und des Rückgangs der koordinierten Körperbeugen nach dem Einbringen von Tieren in Flüssigkeit folgen. Diese Methode wurde verwendet, um zu zeigen, dass die homöo-domäneninterwirkende Proteinkinase, ein transkriptioneller Cofaktor, die Proteostase während des Alterns beeinflusst, indem sie die Expression von Autophagie und molekularen Chaperonen reguliert.

Der Verlust von HPK-1 erhöht die Anzahl der Q35-YFP-Aggregate, die sich während des Alterns ansammeln. Kontrolltiere zeigten durchschnittlich 18 Aggregate, während die mit HPK1 null mutierten und HPK1 RNAi behandelten Tiere durchschnittlich 28 bzw. 26 Aggregate aufwiesen. Am achten Tag des Erwachsenenalters waren 77 bis 78% der TIERE mit HPK1-Mangel gelähmt, verglichen mit nur 50% der Kontrolle.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Überexpression von HPK1 die Bildung von Proteinaggregaten reguliert und alternde Tiere vor Q35-YFP-assoziierten Lähmungen während des Alterns schützt. Diese Methode misst den allgemeinen Rückgang des Proteoms innerhalb eines Zelltyps. Es gibt viele Methoden, um Veränderungen in bestimmten Komponenten des Prostatanetzwerks zu bewerten.

Zusammen ergeben sie ein umfassendes Bild. Abnehmende Proteostase ist ein Kennzeichen des Alterns. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, diesen Rückgang zu quantifizieren.

In Kombination mit der genetischen Analyse ist es ein mächtiges Werkzeug für die Entdeckung.