Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, die Auswirkungen von endokrin wirksamen Verbindungen, wie Bisphenolen, auf die Netzwerk-Spike-Aktivität von neuronalen Netzwerken von Wirbeltieren zu testen, die auf Multi-Elektroden-Arrays etabliert sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsneurobiologie und Umwelttoxikologie zu beantworten, wie z.B. den Wirkmechanismus von Umweltgiften auf die Entwicklung der Netzwerkaktivität im embryonalen Gehirn. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nun die Auswirkungen auf neuronale Netzwerkparameter, wie die mittlere Feuerrate, die Gesamtzahl der Spikes und die Spike-Amplitude sowie die Synchronität, untersucht werden können.

Unsere vorherige Studie zeigte, dass EDCs Wort und Verhalten beeinflussen, was eine direkte Ausgabe von neuronalen Netzwerken ist, und unser Protokoll zielt nun darauf ab, die Wirkung von EDCs auf diese Netzwerke zu verstehen. Nehmen Sie am Tag der Neuronenbeschichtung ein Fläschchen mit extrazellulärer Matrix aus dem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius, besprühen Sie es mit 70 % Ethanol und legen Sie es auf Eis. Achten Sie darauf, die extrazelluläre Matrix auf dem Eis aufzutauen.

Nicht bei Raumtemperatur auftauen, da die ECM über null Grad Celsius polymerisiert. Arbeiten Sie in der BSL2-Haube, um die extrazelluläre Matrix auf 25 % zu verdünnen, indem Sie dem 100-Mikroliter-Aliquot 300 Mikroliter kaltes neurobasales Medium hinzufügen. Verwenden Sie dann eine P200-Pipette, um 100 Mikroliter 25%ige extrazelluläre Matrixlösung in die Mitte des Mehrelektrodenarrays zu geben, wobei Sie darauf achten, die Elektroden nicht zu berühren.

Entfernen Sie sofort das ECM und hinterlassen Sie einen dünnen Film auf der Oberfläche. Decken Sie das Mehrelektrodenarray ab und stellen Sie es in den Gewebekultur-Inkubator, bis es bereit ist, die Neuronen zu plattieren. Beginnen Sie mit der Isolierung von Kükenneuronen, indem Sie die äußere Schale eines E7-Eies mit 70 % Ethanol sterilisieren.

Von diesem Zeitpunkt an ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente mit 70 % Ethanol sterilisiert sind und die Lösungen steril sind. Es ist hilfreich, eine Präparierhaube zu verwenden, aber sie ist für Präparierungen nicht unbedingt notwendig, wenn sie schnell durchgeführt werden.

Nachdem Sie den Embryo entnommen und enthauptet haben, schneiden Sie um die Augen herum und entfernen Sie die Augäpfel. Verwenden Sie als Nächstes eine Dumont Nummer fünf feine Pinzette und eine Federschere, um einen Schnitt auf der Bauchseite zu machen und die äußeren Hautschichten zu entfernen, um das Vorderhirn und das optische Tectum freizulegen. Schälen und entfernen Sie die Schälmembran vorsichtig.

Übertragen Sie das Vorderhirn in eine andere Petrischale, die HBSS enthält, und schneiden Sie es mit einer Federschere in kleine Stücke von etwa zwei Millimetern. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um die Stücke des Vorderhirns in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Nachdem die Stücke des Vorderhirns auf den Boden des Zentrifugenröhrchens gesunken sind, entfernen Sie so viel HBSS wie möglich.

Als nächstes fügen Sie einen Milliliter vorgewärmtes 0,5%iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um das Trypsin vorsichtig zu entfernen, ohne die Gewebestücke zu stören. Fügen Sie einen Milliliter neurobasales Medium hinzu und lassen Sie die Gewebestücke auf den Boden sinken.

Nach dem Entfernen des Mediums und dem Wiederholen des Waschvorgangs fügen Sie zwei Milliliter neurobasales Medium hinzu und verreiben Sie vorsichtig, bis keine Gewebestücke mehr zu sehen sind. Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen eins bis 10 mit neurobasalem Medium. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau-Farbstoff und einem Hämozytometer.

Nach der Zählung plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf ECM-beschichteten Mehrelektrodenarrays mit einer Dichte von 2.200 Zellen pro Quadratmillimeter. Am nächsten Tag fügen Sie 10 mikromolare BPA in neurobasalem Medium zu den behandelten Mehrelektrodenarrays hinzu. Ersetzen Sie am Tag der Aufnahme das Kulturmedium durch frisches neurobasales Medium und stellen Sie die Arrays vor der Aufzeichnung mindestens zwei Stunden lang in den CO2-Inkubator zurück.

Starten Sie die Aufnahmesoftware und stellen Sie die Temperatur des Multi-Elektroden-Arrays auf 37 Grad Celsius ein, indem Sie auf das Temperatursymbol klicken. Stellen Sie die Erfassungsparameter ein, indem Sie im linken Fensterbereich Streams auswählen und mit der rechten Maustaste auf das Muse-Symbol klicken. Wählen Sie dann Verarbeitung und Spike-Detektor hinzufügen aus und klicken Sie im Popup-Fenster auf OK.

Spike detector six von STD wird unter dem Dateinamen angezeigt. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf den Spike-Detektor, wählen Sie Verarbeitung und Burst-Detektor hinzufügen und klicken Sie im Popup-Fenster auf OK. Der Burst-Detektor ISI wird unter dem Muse-Symbol angezeigt.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den Burst-Detektor und wählen Sie Verarbeitung und Compiler für neuronale Statistik hinzufügen. Stellen Sie im Popup-Fenster sicher, dass Dateiheader, aggregierte Well-Statistiken und Synchronisierung ausgewählt sind, und klicken Sie auf OK. Der Statistik-Compiler wird unten angezeigt. Klicken Sie auf das Uhrsymbol am unteren Bildschirmrand und ändern Sie die Informationen im Einstellungsbereich, um alle 5,1 Minuten und fünf Minuten lang aufzunehmen.

Diese wird sofort gestartet und einmalig ausgeführt. Nachdem Sie das Multi-Elektroden-Array aus dem Inkubator entnommen haben, legen Sie es auf die Aufzeichnungseinheit und verriegeln Sie es. Starten Sie die Aufzeichnung der Netzwerkaktivität, indem Sie im Abschnitt "Geplante Aufzeichnung" auf "Aufzeichnung starten" klicken.

In der Regel ist eine Aufnahmezeit von fünf Minuten ausreichend, obwohl auch längere Aufnahmen von bis zu 10 Minuten möglich sind. Bringen Sie das Multi-Elektroden-Array nach der Aufzeichnung wieder in den Inkubator zurück. Die durchschnittliche Anzahl der Spikes ist in BPA-behandelten E7-Küken-Vorderhirnkulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen signifikant niedriger.

Der durchschnittliche Synchronieindex ist in BPA-behandelten E7-Küken-Vorderhirnkulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen signifikant niedriger. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, auch während der Aufzeichnung der Spike-Aktivität jederzeit sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Nach diesem Verfahren kann die Wirkung potenzieller Medikamente, wie Antiepileptika und Antidepressiva, auf die Netzwerkaktivität als ein Schritt zum Verständnis ihres Wirkmechanismus bewertet werden. Viele EDCs haben während der Entwicklung subtile Auswirkungen auf das Gehirn, die sich in Verhaltensänderungen äußern. Das Verhalten ist eine direkte Ausgabe der zugrunde liegenden Netzwerkaktivität.

Unser Protokoll zielt darauf ab, die Auswirkungen dieser Verbindungen auf die Netzwerkaktivität zu analysieren.