Isolierung und Kultivierung embryonaler Neuronen von Küken auf einem Multi-Elektroden-Array

Nehmen Sie ein befruchtetes Hühnerei, das einen Embryo im Frühstadium enthält.

Sterilisieren Sie die Schale und öffnen Sie sie vorsichtig.

Entferne den Embryo. Präparieren Sie den Kopf und geben Sie ihn in eine Kulturplatte, die einen Puffer enthält. Entferne den Augapfel.

Machen Sie einen Schnitt und entfernen Sie die Hautschichten, wobei das Vorder- und Mittelhirn freigelegt werden.

Entfernen Sie die innere Membranschicht und die Blutgefäße. Präparieren Sie das Vorderhirn und überführen Sie es in eine Kulturplatte mit einem Puffer.

Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Fragmente und geben Sie diese in ein konisches Rohr. Sobald sich die Fragmente abgesetzt haben, entfernen Sie den Puffer.

Fügen Sie eine proteolytische Enzymlösung hinzu. Inkubieren, um die extrazelluläre Matrix des Gewebes zu verdauen und Neuronen zu lockern.

Entfernen Sie enzymreiche Medien, waschen Sie sie mit neurobasalen Medien und entfernen Sie alle verbleibenden Enzyme.

Neurobasale Medien hinzufügen. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, um eine neuronale Suspension zu erhalten.

Säen Sie diese Neuronen auf ein Mehrelektroden-Array-System, das mit einer extrazellulären Matrix beschichtet ist. Neurobasale Medien hinzufügen und inkubieren.

Neuronen heften und verlängern Projektionen und bilden ein neuronales Netzwerk.

Nehmen Sie am Tag der Neuronenbeschichtung ein Fläschchen mit extrazellulärer Matrix aus dem -20 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Mit 70% Ethanol besprühen und auf Eis legen. Achten Sie darauf, die extrazelluläre Matrix auf dem Eis aufzutauen. Nicht bei Raumtemperatur auftauen, da die ECM über 0 Grad Celsius polymerisiert.

Arbeiten Sie in der BSL-2-Haube, um die extrazelluläre Matrix auf 25 % zu verdünnen, indem Sie dem 100-Mikroliter-Aliquot 300 Mikroliter kaltes neurobasales Medium hinzufügen. Verwenden Sie dann eine P200-Pipette, um 100 Mikroliter 25%ige extrazelluläre Matrixlösung in die Mitte des Multielektrodenarrays zu geben, wobei Sie darauf achten, die Elektroden nicht zu berühren. Entfernen Sie sofort das ECM und hinterlassen Sie einen dünnen Film auf der Oberfläche.

Decken Sie das Multielektroden-Array ab und legen Sie es in den Gewebekultur-Inkubator, bis es bereit ist, die Neuronen zu plattieren. Beginnen Sie mit der Isolierung von Kükenneuronen, indem Sie die äußere Schale eines E7-Eies mit 70% Ethanol sterilisieren. Von diesem Zeitpunkt an ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente mit 70 % Ethanol sterilisiert sind und die Lösungen steril sind. Es ist hilfreich, eine Präparierhaube zu verwenden, aber für Präparierungen nicht unbedingt notwendig, wenn es schnell geht.

Nachdem Sie den Embryo entnommen und enthauptet haben, schneiden Sie um die Augen herum und entfernen Sie die Augäpfel. Als nächstes verwenden Sie eine Dumont Nummer 5 feine Pinzette und eine Federschere, um einen Schnitt auf der Bauchseite zu machen und die äußeren Hautschichten zu entfernen, um das Vorderhirn und das optische Tectum freizulegen. Schälen und entfernen Sie die Schälmembran vorsichtig.

Übertragen Sie das Vorderhirn in eine andere Petrischale, die HBS enthält, und schneiden Sie es mit einer Federschere in kleine Stücke von etwa 2 Millimetern. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um die Stücke des Vorderhirns in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Nachdem die Stücke des Vorderhirns auf den Boden des Zentrifugenröhrchens gesunken sind, entfernen Sie so viel HBS wie möglich.

Als nächstes 1 Milliliter vorgewärmtes 0,5%iges Trypsin-EDTA hinzufügen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um das Trypsin vorsichtig zu entfernen, ohne die Gewebestücke zu stören. Fügen Sie 1 Milliliter neurobasales Medium hinzu und lassen Sie die Gewebestücke auf den Boden sinken. Nach dem Entfernen des Mediums und dem Wiederholen des Waschvorgangs fügen Sie 2 Milliliter neurobasales Medium hinzu und zerkleinern Sie vorsichtig, bis keine Gewebestücke mehr zu sehen sind.

Verdünnen Sie die resuspendierten Zellen 1 bis 10 mit neurobasalem Medium und zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau-Farbstoff und einem Hämozytometer. Nach der Zählung plattieren Sie die zugehörigen Zellen auf ECM-beschichteten Multielektroden-Arrays mit einer Dichte von 2.200 Zellen pro Quadratmillimeter.