Grundlagenforschung in der Plasmamedizin - ein Durchsatz von Flüssigkeiten zu Zellen Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieser Multi-Well-basierten Sequenzassays ist es, die Auswirkungen von kaltem physikalischem Plasma auf Oxidantien auf biologische Reaktionen in vitro besser zu verstehen, und zwar unter Verwendung von optischer Emissionsspektroskopie, Flüssigkeitsanalyse und zellulärer Aktivität, Mikroskopie und Durchflusszytometrie-Assays. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Plasmamedizin zu beantworten, insbesondere im Hinblick auf aus Plasma gewonnene Direktivenspezies, die für die Induktion des immunogenen Krebszelltods wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihr halbautomatisierter Ansatz.

Es werden 96-Well-Platten verwendet, um die Geschwindigkeit und Produktivität der Forschung zu erhöhen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf zukünftige Plasmatherapien, wie z.B. in der Dermatologie oder Onkologie. Und, da sie die Mittel zur Identifizierung der aus dem Plasma abgeleiteten Direktivenspezies bieten, die für die biologischen Reaktionen relevant sind.

Das Verfahren wird von Felix Niessner, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Positionieren Sie für die Überwachung der Plasmaspezies einen atmosphärischen Plasmajet senkrecht zur Fahnenachse vor einem optischen Emissionsspektrophotometer und verwenden Sie die spezielle Software, um die Photoemission und die Wellenlänge jedes Gaszustands bei einem Standard-Speisegasfluss von zwei Litern pro Minute aufzuzeichnen. Für die plasmabehandelte Superoxid-Analyse erstellen Sie ein endgültiges Protokoll für den XYZ-Tisch mit den entsprechenden Behandlungszeiten und Well-Positionen.

Geben Sie dann 100 Mikroliter frisch zubereiteten Mastermix in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen einer durchsichtigen 96-Well-Platte mit flachem Boden und verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 550 Nanometern zu messen. Um die Auswirkungen der Plasmabehandlung auf die metabolischen Reaktionen der Zellen zu analysieren, säen Sie in einer Laminar-Flow-Haube eins mal 10 zu den vier interessierenden Zellen in 100 Mikrolitern vollständig ergänztem Zellkulturmedium pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden aus und inkubieren Sie über Nacht. Nach der nächtlichen Kultivierung in einem Zellkultur-Inkubator verwenden Sie den XYZ-Tisch, um die Vertiefungen gemäß der experimentellen Analyse nur mit Plasma oder Gas zu behandeln, und stellen Sie die Zellen für weitere 20 Stunden in den Inkubator zurück.

Am Ende der zweiten Inkubation geben Sie 25 Mikroliter frisches Zellkulturmedium, ergänzt mit 500 mikromolaren Resazuurin zu den Zellen sowie zu den drei reinen Resazurin-Vertiefungen der Hintergrundkontrolle. Bringen Sie die Zellen für eine dreistündige Inkubation in den Inkubator zurück. Messen Sie dann die Fluoreszenz in einem Mikroplatten-Reader.

Für die Bildgebung der plasmabehandelten Zellen werden nach dem Ablesen der Fluoreszenz die Überstände durch 100 Mikroliter frisches Zellkulturmedium ersetzt, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid. Platzieren Sie die Platte auf einem motorisierten Mikroskoptisch und wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus, um die Zellen abzubilden. Verwenden Sie dann die entsprechende quantitative Bildanalysesoftware, um die gesamte zytosolische Fläche in digitalen Phasenkontrastbildern aller in jeder Vertiefung abgebildeten Sichtfelder zu bestimmen.

Für die durchflusszytometrische Analyse der plasmabehandelten Zellen waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung nach der Bildgebung zweimal mit 200 Mikrolitern PBS, ergänzt mit Kalzium und Magnesium pro Waschgang, gefolgt von der Markierung mit 15 Anagramm pro Milliliter monoklonalem Anti-Maus-Calreticulin-Antikörper in 50 Mikrolitern PBS plus Kalzium und Magnesium pro Vertiefung. Nach 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern vollständigem Zellkulturmedium und geben Sie 100 Mikroliter Zellablösungslösung für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in jede Vertiefung. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, laden Sie die Platte auf das Durchflusszytometer und erfassen Sie mindestens 1.000 Ereignisse in der Vorwärts- und Seitenstreupopulation, die normalerweise mit lebensfähigen Zellen verbunden ist.

Verwenden Sie dann die geeignete Durchflusszytometrie-Analysesoftware, um die interessierende Population zu ermitteln und die mittlere Fluoreszenzintensität der Calreticulin-Expression zu bestimmen. Die optische Emissionsspektroskopie kann verwendet werden, um die unterschiedlichen Peaks zu verfolgen, die mit reaktiven Plasmakomponenten unter verschiedenen Speisegasbedingungen verbunden sind. Bei der Plasmabehandlung von Flüssigkeiten wird zunächst die Verdampfung durch das Argongas und das Argonplasma bestimmt, wobei die Bedingungen zu unterschiedlichen Verdampfungsergebnissen führen, da das Plasma auch Einfluss auf die Temperatur hat.

Ähnlich wie bei den Ergebnissen der optischen Emissionsspektroskopie für Hydroxylradikale nimmt die Wasserstoffperoxidabscheidung bei Sauerstoff- oder Stickstoffbeimischung deutlich ab, nimmt aber bei befeuchtetem Speisegas zu. Darüber hinaus führt die Zugabe von Stickstoff zum Einsatzgas zu deutlich höheren Nitratkonzentrationen im Vergleich zu mit Argonplasma behandelten Flüssigkeiten. Das meiste Superoxid wird unter trockenen Argongasbedingungen hergestellt, wobei Sauerstoff- und/oder Stickstoffbeimischungen die Superoxidbildung erheblich unterdrücken, außer in Gegenwart von befeuchtetem Argon-Sauerstoffplasma.

Die Fluoreszenzintensitäten von Resazuurin und plasmabehandelten Zellen ähneln den visuell beobachteten physikalischen Veränderungen an den Überständen der Zellkulturen, was die zytotoxische Wirkung einer längeren Plasmabehandlung bestätigt. Eine Abnahme der Gesamtzellfläche wird auch in den Probenvertiefungen der Plasmabehandlung beobachtet, insbesondere unter den befeuchteten Speisegasbedingungen, mit einer allgemeinen Hochregulierung der Calreticulin-Färbung auf Miren-Melanomzellen als Reaktion auf kürzere Expositionen gegenüber der Plasmabehandlung. Bei sachgemäßer Durchführung können die mytoplex-zellulären Assays und die Auslesung in nur wenigen Stunden abgeschlossen werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden durchgeführt werden, wie z.B. die Co-Kultur mit Immunzellen oder die Analyse von Zellkulturüberständen. Dies hilft, zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. zur Freisetzung von Muttertieren, Zyto-Clients oder Redux-Proteinen sowie zur Immunerkennung von plasmabehandelten Melanomzellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für weitere Forschungen zu Melanomzyklen, zum Beispiel mit 3D-Tumorsphäroiden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Grundlagenforschung in der Plasmamedizin betreibt, von der Plasmagasphase über reaktive Moleküle und Flüssigkeiten bis hin zu biologischen Reaktionen in Melanomzellen.