Gleichzeitige Zuordnung und Quantifizierung der Purine im menschlichen mitochondrialen DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Position der eingebauten Ribonukleotide mit Einzelnukleotidauflösung zu kartieren und die Anzahl der in der menschlichen mitochondrialen DNA vorhandenen Ribonukleotide zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur DNA-Integrität, zu DNA-Replikationsmechanismen, DNA-Reparaturmechanismen und zur Frage, wie Defekte in einem dieser Mechanismen Krankheiten verursachen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sowohl die Lage als auch die Anzahl der eingebauten Ribonukleotide in der mitochondrialen DNA in einem einzigen Experiment bestimmt werden können.

Obwohl diese Methode einen Einblick in den Ribonukleotidgehalt in menschlicher mitochondrialer DNA geben kann, kann sie auch zur Untersuchung der Kern-DNA und des Ribonukleotidgehalts in Sequenzgenomen anderer Modellorganismen angewendet werden. In diesem Experiment wird genomische DNA verwendet, die zuvor aus HeLa-Zellen isoliert und in den Abschnitten zwei und drei des Textprotokolls beschrieben wurde. Um die DNA zu verdauen, mischen Sie das Folgende vorsichtig in einem Mikrofugenröhrchen.

Ein Mikrogramm DNA, fünf Mikroliter 10X-Puffer 3.1, ein Mikroliter HincII und nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern. Bei 37 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Wenn der Aufschluss abgeschlossen ist, fügen Sie jeder Probe 1,8 Volumen paramagnetischer Kügelchen hinzu, mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Legen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf ein Magnetgestell, um die Kügelchen zu pelletieren, und entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie das Pellet etwa 30 Sekunden lang mit 150 Mikrolitern 70%igem Ethanol, entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn. Wiederholen Sie die Wäsche mit 200 Mikrolitern 70%igem Ethanol für weitere 30 Sekunden.

Trocknen Sie die Proben etwa 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nehmen Sie anschließend die Röhrchen aus dem Magnetgestell. Eluieren Sie jedes Pellet in 45 Mikrolitern Elutionspuffer, gemischt durch vorsichtiges Pipettieren, und inkubieren Sie es fünf Minuten lang.

Pelletieren Sie die Kügelchen auf dem Magnetgestell und geben Sie 45 Mikroliter jeder DNA-Probe in ein neues Röhrchen. Zu jeweils 45 Mikrolitern isolierter oder gereinigter DNA werden fünf Mikroliter dreimolares Kaliumhydroxid oder fünf Mikroliter dreimolares Kaliumchlorid hinzugefügt, wodurch ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern entsteht. Die acht Reaktionen sind in dieser Tabelle zusammengefasst.

Inkubieren Sie zwei Stunden lang in einem Hybridisierungsofen bei 55 Grad Celsius und inkubieren Sie die Proben dann fünf Minuten lang auf Eis. Fältitieren Sie die DNA, indem Sie 10 Mikroliter drei molare Natriumacetate bei einem pH-Wert von 5,2 und 125 Mikroliter kaltes, 100%iges Ethanol hinzufügen und fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Pelletieren Sie die DNA, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 21.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie jedes DNA-Kügelchen mit 250 Mikrolitern kaltem Ethanol, 70 % Ethanol, zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand. Lassen Sie das Pellet etwa fünf bis 10 Minuten in der offenen Tube trocknen, bis die sichtbare Flüssigkeit verdunstet ist. Zum Schluss fügst Du 20 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und lässt das DNA-Pellet 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auflösen.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Reaktionsgemisch für jede Probe als Mastermix vorbereiten. Fügen Sie für jede Probe 2,5 Mikroliter 10x T4-Polynukleotidkinase-Reaktionspuffer, 2,5 Mikroliter ATP und einen Mikroliter drei Prime-Phosphatase-Minus-T4-Polynukleotidkinase hinzu. Übertragen Sie 19 Mikroliter jeder DNA-Probe in ein neues 200-Mikroliter-Röhrchen und denaturieren Sie sie drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius in einem Thermocycler.

Kühlen Sie dann die DNA-Proben auf Eis ab und geben Sie sechs Mikroliter des vorbereiteten Reaktionsgemisches zu jeder Probe. Inkubieren Sie die Reaktionsmischungen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 65 Grad Celsius für 20 Minuten, um die Reaktion zu stoppen. Reinigen Sie die DNA mit paramagnetischen Kügelchen, wie zuvor gezeigt, aber eluieren Sie mit 14 Mikrolitern Elutionspuffer.

Bereiten Sie das Reaktionsgemisch im Voraus als Mastermix vor, der für jede Probe folgende Angaben enthält. Fünf Mikroliter 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, fünf Mikroliter Hexammincobalt(III)chlorid, 0,5 Mikroliter ARC140-Oligonukleotid, 0,5 Mikroliter ATP und 25 Mikroliter 50%PEG 8000. Durch Pipettieren gut mischen.

Übertragen Sie 13 Mikroliter jeder gereinigten DNA in ein neues 200-Mikroliter-Röhrchen und denaturieren Sie sie drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius in einem Thermocycler. Kühlen Sie die DNA auf Eis ab und geben Sie dann 36 Mikroliter Reaktionsmischung zu jeder Probe, mischen Sie sie durch Pipettieren und schleudern Sie sie kurz herunter. Geben Sie zu jeder Reaktion einen Mikroliter T4-RNA-Ligase, mischen Sie durch Pipettieren und schleudern Sie kurz herunter.

Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht. Wenn die Einzelstrang-DNA-Ligation abgeschlossen ist, reinigen Sie die DNA wie zuvor gezeigt, verwenden Sie jedoch 0,8 Volumina paramagnetischer Kügelchen und pelletieren Sie die Kügelchen 10 Minuten lang. Eluieren Sie in 20 Mikrolitern Elutionspuffer und übertragen Sie 20 Mikroliter jeder DNA-Probe in ein neues 200-Mikroliter-Röhrchen.

Wiederholen Sie die Reinigung mit 0,8 Volumina paramagnetischer Kügelchen und eluieren Sie in 14 Mikrolitern Elutionspuffer. Bereiten Sie für jede Probe das Reaktionsgemisch als Mastermix vor, der aus zwei Mikrolitern 10x T7-DNA-Polymerase-Reaktionspuffer, zwei Mikrolitern ARC76/77, zwei Mikrolitern dNTPs und 0,8 Mikrolitern BSA besteht. Übertragen Sie 12,8 Mikroliter gereinigter DNA in ein neues 200-Mikroliter-Röhrchen und denaturieren Sie sie drei Minuten lang bei 85 Grad Celsius in einem Thermocycler.

Kühlen Sie die DNA auf Eis ab und geben Sie dann 6,8 Mikroliter Reaktionsmischung zu jeder Probe, mischen Sie durch Pipettieren, schleudern Sie kurz herunter und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie jeder Reaktion 0,4 Mikroliter T7-DNA-Polymerase hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Aufreinigung der DNA mit paramagnetischen Kügelchen eluieren Sie in 11 Mikrolitern Elutionspuffer.

Um mit der PCR-Amplifikation zu beginnen, bereiten Sie die Reaktionsmischung separat für jede Probe in einem neuen 200-Mikroliter-Röhrchen vor, das aus 7,5 Mikrolitern ARC49, 7,5 Mikrolitern einzigartigem Index-Primer und 25 Mikrolitern 2X Hot-Start-Ready-Mix besteht. Fügen Sie jeder Reaktion 10 Mikroliter DNA-Probe hinzu. Verstärken Sie die Bibliothek unter den folgenden Bedingungen.

Denaturieren Sie 45 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 18 Zyklen von 98 Grad Celsius für 15 Sekunden, 65 Grad Celsius für 30 Sekunden, 72 Grad Celsius für 30 Sekunden und enden Sie mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 Grad Celsius für zwei Minuten. Halten Sie die Proben nach der Amplifikation bei vier Grad Celsius. Reinigen Sie die Bibliotheken wie im Textprotokoll beschrieben und eluieren Sie in 20 Mikrolitern TE-Puffer.

Bestimmen Sie die Qualität und die durchschnittliche Fragmentgröße jeder Bibliothek mit einem digitalen Elektrophoresesystem. Repräsentativ sind die Ergebnisse geeigneter Bibliotheksprofile nach Kaliumhydroxid- oder Kaliumchlorid-Behandlung. Nach der Berechnung der Konzentration jeder Bibliothek ziehen Sie gleiche molare Mengen von bis zu 24 Bibliotheken, die mit unterschiedlichen Indexprimern für die Sequenzierung amplifiziert wurden, wie in den Abschnitten neun und 10 des Textprotokolls beschrieben.

Geben Sie TE-Puffer bis zu einem Endvolumen von 25 Mikrolitern und einer Konzentration von 10 Nanomolaren hinzu. Führen Sie nach der Sequenzierung eine bioinformatische Datenanalyse durch, wie in Abschnitt 11 des Textprotokolls beschrieben. Diese Diagramme zeigen die zusammengefassten Reads an allen HincII-Stellen in humaner mitochondrialer Leichtstrang- und Schwerstrang-DNA nach Kaliumchlorid-Behandlung.

Etwa 70% aller detektierten fünf Primzahlen lokalisierten sich an den Schnittstellen, was die hohe Effizienz des HincII-Aufschlusses zeigt. Die Behandlung von Bibliotheken mit Kaliumhydroxid zur Hydrolyse der DNA an eingebetteten Ribonukleotiden verringert die Anzahl der Reads bei HincII auf etwa 40 %Die relative Anzahl der Reads in der mitochondrialen und nukleären DNA zeigt Unterschiede in der Abdeckung und verdeutlicht die Bedeutung einer angemessenen Normalisierung, um die Strangverzerrung zu beseitigen. Die Normalisierung der Lesezahlen auf HincII ergibt ein quantitatives Maß für die Anzahl der Ribonukleotide pro mitochondrialem Genom auf dem schweren oder leichten Strang.

Die Reads nach Kaliumhydroxid-Behandlung für jedes Ribonukleotid, normiert auf die Sequenzzusammensetzung jedes Strangs, zeigen ein anderes Verhältnis als eins, was auf eine nicht zufällige Verteilung der Reads hinweist und auf ein ausgeprägtes Ribonukleotidmuster und eine hohe Bibliotheksqualität hindeutet. Die Normalisierung der Reads an den Stellen der eingebetteten Ribonukleotide auf die an den HincII-Stellen sowie auf den Nukleotidgehalt des Genoms erzeugt ein quantitatives Maß dafür, wie viele der einzelnen Ribonukleotide pro 1.000 komplementären Basen eingebaut werden. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die DNA in hohem Maße intakt zu halten und Doppelstrangbrüche während der Bibliotheksvorbereitung zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden durchgeführt werden, um die Ribonukleotid-Quantifizierungsdaten zu bestätigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bibliotheken für die Kartierung und Quantifizierung von Ribonukleotiden und DNA mithilfe von Next Generation Sequencing vorbereiten können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chemikalien wie Kaliumhydroxid gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Augenschutz und Handschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.