Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die M-T-D-N-A-Replikation in kultivierten Neuronen zu markieren und zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem Neuronen zunächst zwei bis 24 Stunden lang mit dem Thymidin-Analogon EDU inkubiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das EDU, das ein Alkin enthält, durch eine kupferkatalysierte kovalente Reaktion mit dem fluoreszierenden Orgongrün 4 88 Azid zu markieren.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das grüne Orgonsignal mit dem Aramidsignalamplifikationsschritt zu amplifizieren, um die EDU zu visualisieren, die in die neu synthetisierte MT-DNA eingebaut wurde. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine MT-DNA-Replikation in spezifischen subzellulären Kompartimenten von Neuronen durch die Kombination von Clicka-EDU-Chemie und anschließender Tear-Mind-Signalamplifikation zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der BRDU-Markierung besteht darin, dass die EDU-Markierung einfacher und milder ist und eine zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung von neuronalen Markern ermöglicht.

Diese Methode kann Schlüsselfragen bei der Regulation der Mitochondrienzahl beantworten, z. B. wie Neuronen auf wechselnde Energielasten in ihren subzellulären Kompartimenten, einschließlich Zellkörpern, Axonen, Dendriten und synaptischen Terminals, reagieren. Diese Methode kann also einen Einblick in die Mechanismen geben, die der Pathogenese mehrerer mitochondrialer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Neuropathie und Neurodegeneration, zugrunde liegen. Wichtig ist jedoch, dass es auch auf andere Systeme angewendet werden kann, bei denen Veränderungen in der mitochondrialen DNA-Kopie wahrscheinlich der Pathogenese des Krankheitszustands zugrunde liegen, einschließlich Arzneimitteltoxizität, Krebs und Alterung.

Dieses Video zeigt, wie neu synthetisierte mitochondriale DNA, abgekürzt M-T-D-N-A, in Neuronen des Spinalgangliens markiert werden kann, die auf sterilen 12 Millimeter großen Glasdeckscheiben gezüchtet wurden. In einer 24-Well-Kulturplatte verdünnen Sie den 10-Millimolar-Stamm von fünf Ethanol-zwei Doxyuridin, abgekürzt EDU, aus dem Clicka EDO-Mikrotiterplatten-Assay-Kit von eins auf 100 in Kulturmedium für einen 10-XEDU-Stamm. Die 10 XEDU-Brühen werden dann direkt in das Medium gegeben, in jeder Vertiefung werden die behandelten Neuronen zwei bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem Abzug inkubiert.

Fixieren Sie die Neuronen 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2%Paraformaldehyd. Waschen Sie zweimal in einem XPBS für jeweils zwei bis fünf Minuten. Die fixierten Neuronen können in frischen XPBS bei vier Grad Celsius bis zu einem Monat gelagert werden.

Bereiten Sie eine Feuchtkammer vor, wie im Begleittext beschrieben. Verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um 28 feste Deckgläser, einschließlich positiver und negativer EDU-Kontrollen, auf Folien aus hydrophobem Paraform M in der Feuchtkammer zu übertragen. Tragen Sie erneut 200 bis 300 Mikroliter eines XPBS auf, um die Oberfläche jedes Deckglases zu bedecken.

Bereiten Sie das Click it Assay-Kit wie im Text und in den Herstellern und Anweisungen beschrieben vor, um mitochondriale DNA in 75 bis 80 Mikrolitern einer durchlässigen Lösung, die 0,1 % Tritton X in einem XPBS enthält, auf jede Abdeckung zu markieren, zu überschieben, abzudecken und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Verwenden Sie eine Kolbentransferpipette mit einer 200-Mikroliter-Spitze am Ende. Um die Flüssigkeit sanft zu entfernen, ohne Zellen zu verlieren.

Verwenden Sie eine Kolbenpipette, um die Abdeckung vorsichtig zu fluten. Gleiten Sie mit 200 bis 300 Mikrolitern eines XPBS, um die vorherige Lösung gründlich auszuwaschen. Waschen Sie jeden Einbezug zweimal.

Pipettieren Sie 75 bis 80 Mikroliter frisches 1%iges Wasserstoffperoxid in einem XPBS auf jeden Deckglas. Zugedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen. Spülen Sie wie zuvor zweimal mit einem XPBS und bereiten Sie den Click at Reaction Cocktail frisch zu, wie im Begleittext beschrieben.

Zum Mischen auf und ab spritzen. Wirbeln Sie die Neuronen nicht mit 75 bis 80 Mikrolitern Klick bei EDU-Fixiermittel pro Deckglas bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren. Während der Postfix-Inkubation verdünnen Sie den Reaktionscocktail mit einem gleichen Volumen Clicka-EDU-Fixiermittel.

Geben Sie den Reaktionscocktail zum Lichtschutz auf jeden Deckbezug und inkubieren Sie ihn 25 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Reaktionscocktail, waschen Sie ihn zweimal mit einem verdünnten x Blockierungspuffer unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop. Prüfen Sie, ob die EDU-Färbung in den Zellkernen auf Orgongrünfärbung überprüft wurde.

Beginnen Sie mit der Termitensignalverstärkung oder TSA, fügen Sie 1%ige TSA-Blocklösung zu jedem Deckglas hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Schleudern Sie kurz den konjugierten Antion-Antikörper mit grünem Meerrettichperoxidase, der zwei bis 24 Stunden vor der TSA-Behandlung vorbereitet wurde, verdünnen Sie den primären Antikörper eins zu 300 in TSA-Blockierungslösung und drehen Sie ihn um oder pipettieren Sie ihn, um den Knotenwirbel zu mischen. Geben Sie 75 Mikroliter in jede Abdeckung, ziehen Sie sie hinein und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag dreimal mit einem XPBS bei Raumtemperatur spülen. Inkubieren Sie die Deckgläser in der letzten Wäsche weitere 30 bis 60 Minuten, um sicherzustellen, dass der ungebundene Primärantikörper entfernt wird. Bereiten Sie die IDE-Reaktion gemäß dem Textteil dieses Protokolls unmittelbar vor der Verwendung vor.

Inkubieren Sie die Deckgläser mit der IDE-Reaktion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dreimal mit einem XPBS, das in der letzten Wäsche 30 bis 60 Minuten lang inkubiert, wie zuvor unter dem Mikroskop. Prüfen Sie, ob MT-DNA-Markierung erfolgreich gefärbte Neuronen auf Objektträgern mit einem ANTIFA-Eindeckmedium mit DPI färbte: Hier sehen Sie repräsentative differentielle Interferenzkontrastbilder von embryonalen und adulten Spinalganglienneuronen, die typischerweise für die Analyse verwendet werden.

Diese schematischen Diagramme stellen das Verfahren zur Markierung von EDU in MTD NA mit einem grün fluoreszierenden Signal dar. Mitotisch aktive F 11-Neuroblastomzellen dienen als Positivkontrolle und veranschaulichen das Markierungsmuster von EDU, das in die nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde, in diesen repräsentativen Fluoreszenzbildern, die über ein Hellfeld gelegt werden. Die grün punktierten Signale zeigen das verstärkte EDU-Signal, das in neu synthetisierte M-D-D-N-A von embryonalen und adulten Spinalganglienneuronen eingebaut wurde.

Das EDU-Markierungsverfahren ermöglicht die anschließende Immunfluoreszenzfärbung von neuronalen Markern wie Neurofilament in Rot. Diese schematischen Diagramme stellen das Verfahren zur Markierung von EDU und MTD NA mit einem roten Fluoreszenzsignal dar. Mitotisch aktive F 11-Neuroblastomzellen dienen als Positivkontrolle und veranschaulichen das Markierungsmuster von EDU, das in die nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde.

Dieses schematische Diagramm zeigt das Verfahren zur Markierung von BRDU in neu synthetisiertem M-T-D-N-A mit einem grünen oder roten Fluoreszenzsignal. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Kontrollen mit mitotisch aktiven Zellen durchzuführen, um die erfolgreiche EDU-Markierung und die Zellkerne zu überprüfen, bevor Sie mit den Amplifikationsschritten fortfahren, um die MT-DNA-Markierung nach diesem Verfahren zu visualisieren. Andere Methoden wie die Standard-Immunfluoreszenz können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die DNA-Synthese von Mitochondrien in bestimmten Subpopulationen von Neuronen oder neuronalen Kompartimenten reguliert wird. Aufgrund ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg ebnen, die Regulation der Mitochondrienzahl sowohl in Kulturmodellen der normalen Physiologie als auch in Kulturmodellen, die eine beeinträchtigte Krankheit simulieren, zu erforschen.

Neurologische Zustände.