Name: Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mtDNA-Replikation in kultivierten Neuronen mit EdU-Inkubation und Tyramid-Signalverstärkung visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Dynamik in neuronalen Subkompartimenten.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants NS-38849 und DK-076160, der Juvenile Diabetes Research Foundation Center for the Study of Diabetes Komplikationen in unterstützt, das Programm für Neurologische Forschung und Entdeckung und die A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Diese Arbeit verwendet die Morphologie und Bildanalyse Kern des Michigan Diabetes Research and Training Center, National Institutes of Health Grants 5P60 DK-20572 vom National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten finanziert. Die Autoren bedanken sich Scott T. Clarke von Molecular Probes / Invitrogen für seine wertvollen Ratschläge über die verschiedenen Click-iT EdU Labeling Kits und die großzügige Spende von Reagenzien, die anfängliche Entwicklung des EdU Amplifikationstechnik unterstützen.

1. Vorbereitung des Neurons <ol><li> Spinalganglion (DRG) Neuronen sind sterile (autoklaviert) 12 mm Deckgläschen in einer 24-well Platte gewachsen. </li><li> Die 10 mM Bestand von Edu (in DMSO, Click-iT EdU Microplate Assay Kit) ist in der Regel 1:100 in Kulturmedium verdünnt, um eine 10X EdU-Lösung (100 nM) zu machen und dann 1:10 verdünnt in die Kultur-Wells (z. B. 30 ul der 10X EdU Lösung in insgesamt 300 ul Kulturmedium). DRG-Neuronen sind mit einer Endkonzentration von 10 uM EdU bei 37 ° C und 5% CO 2 zwischen 2-24 Stunden. Die Länge der Zeit abhängt, wie Behandlungen auf die Rate der mtDNA-Synthese. </li><li> In einer Abzugshaube, sind DRG-Neuronen in 2% Paraformaldehyd für 10-15 min bei Raumtemperatur fixiert, zweimal in 1X PBS 2-5 Minuten jede Wäsche und in frischen 1X PBS für bis zu 1 Monat bei 4 ° C. </li><li> Deckgläser mit spitzen Pinzette, eine vorbereitete feuchte Kammer übertragen (Corning BioAssay Gericht mit schwarzen tapeziert unten für Kontrast, eingewickelt in Alufolie, um Licht empfindliche Bauteile und befeuchtet mit Wasser gesättigt Kimwipes zu schützen) und auf ein Blatt Parafilm M, bietet eine hydrophobe Oberfläche, um die Lösungen zu den Deckglas beschränken. Das Protokoll unten ist für 28 Deckgläser konzipiert und Lösungen sind für 32 Deckgläser (ca. 14% mehr Volumen) vorbereitet. Lösungen mit teuren oder beschränkt Komponenten werden so gefertigt, dass 75-80 ul auf jedem Deckglas verwendet werden. Ansonsten sind 200-300 ul für Wasch-und Block-Lösungen verwendet werden, um gründlich auswaschen bisherigen Lösungen. </li><li> Re-gelten 1X PBS, um die Oberfläche jedes Deckglas (200-300 ul) zu decken. Bereiten Sie die Click-iT-Assay und Tyramid Signalverstärkung Kits, wie unten beschrieben und in den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Vorbereitung der Click-iT EdU Microplate Assay Kit Die meisten Komponenten aus dem Click-iT EdU Microplate Assay Kit kommen vor und sind bei 4 ° C [2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E), CuSO4 (100 mM, Component F), Click-iT EdU Fixativ ( Die Komponente D) und Blocking Buffer (2x Component H)]. Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) wird bei -20 ° C gelagert, um es von sich gelb-braun im Laufe der Zeit zu verhindern. Diese Komponente, wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Die Oregon Green 488 Azid (Komponente B) sollte in kleinen Portionen (10-20 ul) geteilt werden, um Frost-Tau-Zyklen zu minimieren und bei -20 ° C. Zur Vorbereitung einer Stammlösung von der Anti-Oregon Green HRP-Konjugat (Komponente I), fügen Sie 75 ul Milli Q dH 2 O in das Fläschchen. Mix von sanften Pipettieren oder durch Umdrehen Schaumbildung zu vermeiden und lagern bei 4 ° C. Nicht vortexen. Vorbereitung der TSA Kit Nr. 12, mit HRP Goat Anti-Rabbit IgG und Alexa Fluor 488 Tyramid Kit Zur Vorbereitung der Tyramid Stammlösung lösen sich die festen Stoffe (Alexa Fluor 488 Tyramid, Komponente A) in 150 ul DMSO (Komponente B). Drehen Sie die Durchstechflasche einige Male zu lösen jede Tyramid Beschichtung den Seiten des Fläschchens. Lagerung der Stammlösung in kleinen Portionen (10-20 ul) bei ≤ -20 ° C, getrocknet und vor Licht geschützt. 2. Click-iT 5-Ethinyl-2-desoxyuridin (EDU) Labeling Hinweis: Alle Lösungen sind mit einer Glühbirne Transferpipette mit 200 ul Spitze angebracht, um das Ende zu entfernen sanft Flüssigkeiten ohne Zellen entfernt. Vermeiden Sie die Verwendung eines Vakuums Linie, die in der Regel zu entfernen Lösungen zu heftig. Ein Vollpipette wird verwendet, um sanft Flut Deckgläser mit 200-300 ul der Waschlösungen gründlich auswaschen der bisherigen Lösung. <ol><li> Die Zellen werden mit 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer bedeckt permeabilisiert. Verwenden Sie 1% Triton-X-100 Stammlösungen. <ul><li> Machen Sie 3000 &amp;mgr; l 0,1% Triton-X-100 durch Zugabe von 300 ul 1% Triton-X-100 Lager zu 2700μL 1X PBS. </li><li> Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Entfernen Sie den Triton X-100-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. </li><li> Endogene Peroxidase-Aktivität wird durch eine 1% H 2 O 2 in 1X PBS-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgeschreckt. Verdünnen Sie 30% H 2 O 2-Lösung mit 1X PBS. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden, sondern können während der 10 Minuten Permeabilisierung Schritt vor (Schritt 3,1) vorgenommen werden. <ul><li> Machen Sie 3000 ul einer 1% igen H 2 O 2 durch Zugabe von 100 ul 30% H 2 O 2 bis 2900 ul 1X PBS. </li><li> Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li><li> Entfernen Sie die Peroxidase-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. </li></ul></li><li> Click-iT EdU Reaction <ul><li> Für 32 Deckgläser (32 x 80 ul =2560 ul) insgesamt von 2560 ul erforderlich ist. Die 2x Reaktion ist in 1280 ul, der die Hälfte des Gesamtvolumens der Reaktion ist. </li><li> Frisch bereitet die Click-iT Reaction Cocktail vor dem Start des 5 Minuten post fix (Schritt 3.5). </li><li> Mischen Sie die Cocktail-und Abpipettieren. Nicht vortexen bei der Bereitstellung dieser Reaktion. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x Reaction Cocktail Die Komponenten sind von Click-iT EdU Microplate Assay Kit </td><td> Die Hälfte Volume: 1280 ul </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 ul </td></tr><tr><td> 2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E) </td><td> 100,3 ul </td></tr><tr><td> Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) </td><td> 25,6 ul </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mM, Component F) </td><td> 25,6 ul </td></tr><tr><td> Oregon Green Azid (Komponente A) </td><td> 6,4 ul </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 1290,7 ul </td></tr></tbody></table> HINWEIS: Die Volumina eingesetzt oben sind proportional zu den Volumina in den Click-iT EdU Microplate Assay Kit Richtungen aufgeführt. Das Endvolumen der Reaktion Cocktail ist etwas mehr als 1280 ul. </li><li> Der 2X Click-iT Reaktion wird mit dem gleichen Volumen von Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) unmittelbar vor der Verwendung verdünnt. Das Mischen dieser zusammen macht eine einheitliche Reaktion Lösung für alle Deckgläser. </li><li> Add 1290,7 uL Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) auf die 1290,7 ul Reaktion Cocktail. Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Post-fix die Neuronen mit Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie fix und fügen Reaktion Cocktail von oben (Schritt 3,4). Abdeckung zum Schutz vor Licht und Inkubation für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig die Reaction Cocktail. Zweimal waschen mit verdünnter 1X Blocking Buffer (2x Component H). <ul><li> Machen Sie 5200 ul 1X Blocking Buffer durch Verdünnung 2600 ul Blocking Buffer (2x Component H) mit dem gleichen Volumen MilliQ d H 2 O (2600 ul). Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. </li></ul></li><li> Im Rahmen eines epi-Fluoreszenz-Mikroskop für Oregon Green Färbung in den Kernen von mitotisch aktiven Kontroll-Zellen zu überprüfen. </li></ol> 3. Tyramid Signalverstärkung (TSA) der EDU Signal <ol><li> Add 1% TSA-Block-Lösung in jede Deckglas und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. <ul><li> Machen Sie 6000 ul 1% TSA-Block-Lösung durch Wiegen 0,06 g TSA Blocking Reagent (TSA-Kit Nr. 12, Komponente D) und das Hinzufügen zu 6000 ul 1X PBS. Vortex mischen. Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung wird oft dazu beitragen, unspezifische Bindung zu reduzieren. </li></ul></li><li> Kurz Spin der Anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper Lager (Komponente I der Click-iT EdU Microplate Assay), hergestellt 2-24 Stunden im Voraus von TSA. Verdünnen Sie den Primärantikörper 1:300 in 1% TSA blockiert und Invertzuckersirup oder Pipette auf und ab sanft zu mischen. Nicht vortexen zu verhindern, dass die HRP-konjugierten Antikörper. Nehmen Sie 1% TSA-Block-Lösung, fügen Sie 75 &amp;mgr; l jedes Deckglas beimpft und über Nacht bei 4 ° C. <ul><li> Der verwendete Antikörper können mehr konzentriert werden, wie z. B. 1:150, aber es ist in begrenzten Mengen geliefert, so sollten Sie sie sparsam. Auch hier wird der Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung helfen oft unspezifische Bindung des anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper zu reduzieren. </li><li> Machen Sie 2560 ul einer 1:300-Antikörper-Lösung durch Zugabe von 8,53 ul der Aktie Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU Microplate Assay) bis 2560 ul 1% TSA Blocking. Mix von sanften Pipettieren oder Inversion. </li></ul></li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die Antikörper-Lösung und spülen Sie dreimal mit 1X PBS. Inkubieren Sie die Deckgläser in der letzten Wäsche für eine weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass ungebundene Primärantikörper entfernt wird. </li><li> Bereiten Tyramid Reaktion von 2560 ul (32 Deckgläser x 80 mL). <ul><li> Machen Sie 400 ul einer 0,15% H 2 O 2-Lösung (100X) durch Zugabe von 2 ul der 30% H 2 O 2 (TSA-Kit Nr. 12, Component F) bis 398 ul Amplification Buffer (TSA-Kit Nr. 12, Komponente E) . Dies sollte unmittelbar vor erforderlich sein. </li><li> Für ein Endvolumen von 2560 ul kombinieren: <ul><li> 25,6 ul Tyramid-488 (TSA-Kit Komponente A) </li><li> 2508,8 uL Amplification Buffer (TSA-Kit Komponente E) </li><li> 25,6 ul 0,15% H 2 O 2 (von oben für eine endgültige 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Entfernen 1X PBS und Inkubation mit dem Tyramid Reaktion für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ul></li></ul></li><li> Entfernen Tyramid Reaktion und spülen dreimal mit 1X PBS, Inkubation in der letzten Wäsche für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur wie zuvor. </li><li> Prüfen Sie, ob mtDNA Kennzeichnung unter einem epi-Fluoreszenz-Mikroskop. <ul><li> Berg Deckgläser auf Objektträger aus Glas mit einem Antifade Eindeckmedium, wie ProLong Gold mit DAPI. Alternativ kann der EDU Kennzeichnung und Verstärkung durch Standard-Leuchtstofflampen Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker Etikett beachten. </li></ul></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation als Marker für die mitochondrialen Biogenese Wir sind daran interessiert, wie sensorische Neuronen (Abbildung 1) regelt die Anzahl der Mitochondrien. Dieses Protokoll wird neu synthetisierten mtDNA mit einem fluoreszierenden Marker-Label als eine Möglichkeit zur Messung der neuen Mitochondrien. Die Einbeziehung der synthetische Nukleotid EdU durch die Klick-Chemie der Oregon Green-Azid und nachfolgenden Amplifikation mit den Alexa-Fluor 488 Tyramid Ergebnisse in der Etikettierung von mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals (Abbildung 2). Wenn es richtig gemacht, ist das verstärkte grüne Signal ausreichend höher als Hintergrund-Fluoreszenz (wie zelluläre Autofluoreszenz oder ein Nebeneffekt der HRP-TSA-Reaktion). Diese Technik wurde entwickelt, um neu repliziert mtDNA-Label, um zu visualisieren und zu quantifizieren mtDNA Biogenese in subzellulären Kompartimenten von Neuronen (Abbildung 3). Die EDU Kennzeichnung ermöglicht anschließende Fluoreszenz-Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker wie Neurofilament (Abbildung 3D) Label. Die TSA Reaktion kann auch mit anderen fluoreszierenden Alexa Fluor tyramides wie Alexa Fluor 594-Tyramid durchgeführt werden. Daraus ergibt sich ein grün fluoreszierendes nuklearen Signal von der Oregon Green-Azid-Klick-Reaktion in den Zellkern, aber kein grünes Signal in mtDNA, die nachweisbar vor TSA ist. Die Verstärkung mit Alexa Fluor 594-Tyramid intensiviert die nukleare Label und zeigt die eingearbeitet EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal (Abbildung 4). Eine ähnliche Verstärkung Verfahren verwendet wird, um BrdU-Einbau in neu synthetisierte mtDNA (Abbildung 5) sichtbar zu machen, jedoch erfordert diese Methode einen weiteren Schritt auf die BrdU-Epitop entweder durch eine harte Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht für EdU notwendig erholen Kennzeichnung. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vertreter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder von embryonalen (links) und Erwachsenen (rechts) Spinalganglien (DRG) Neuronen, die normalerweise für die Analyse. Bars = 10 pm eingesetzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Gr verstärkeneen-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 488 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu grün-Signal in mtDNA zu visualisieren. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. EdU Kennzeichnung von mtDNA in Spinalganglien (DRG) Neuronen. Neuronen sind mit der EDU inkubiert und das Signal wird anschließend verstärkt auf mtDNA, die eingearbeitet EdU offenbaren. Vertreter Fluoreszenzbilder auf Durchlicht zeigt grün punktförmige Signale verstärkt EDU (Edu-OG-TSA, grün) in neu synthetisierte mtDNA sowohl embryonale (A) und Erwachsenenbildung (BD) DRG-Neuronen aufgenommen überlagert. Die EDU Kennzeichnung Verfahren ermöglicht die anschließende Immunfluoreszenzfärbung der neuronalen Marker wie Neurofilament (D, αNF, in rot). Maßstabsbalken = 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Green-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green verstärken, gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 594 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu visualisieren rotes Signal in mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. BrdU-Markierung und Tyramid Signalverstärkung mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal in mtDNA. Die schematische Darstellung stellt das Verfahren für die Kennzeichnung BrdU in neu synthetisierte mtDNA entweder mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal. Ein erster Schritt ist erforderlich, um die BrdU-Epitop entweder durch eine Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht notwendig ist für EdU Kennzeichnung erholen. Der nächste Schritt ist mit einer Maus primären anti-BrdU-Antikörper inkubiert. Dies wird durch Inkubation mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziege anti-Maus-Antikörper. Schließlich wird das Signal mit einem grünen oder roten fluoreszenzmarkierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu signalisieren, in mtDNA visualisieren verstärkt.

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</ol>

Wir entwickelten eine sensitive Assay neu synthetisierten mtDNA in einzelnen Zellen mit einem Tyramid Signalverstärkung von EDU-Label. Eines der größten Probleme bei der Optimierung dieses Protokolls war die inkonsistente Ergebnisse zwischen Deckgläsern. Es wurden Änderungen an der Invitrogen Kit-Protokolle, um zu verhindern Mischen kleiner Volumina einzelner Deckgläser und macht Master-Lösungen für alle Deckgläser verwendet werden. Die 75-80 ul für jeden 12 mm runden Deckglas verwendet ist ein ideales Volumen vollständig bedecken die Oberfläche und bietet genügend Lösung, um konsistente Ergebnisse zwischen den Proben zu geben. Inkubationszeiten und Reagenz-Konzentrationen wurden optimiert, sondern Verbesserungen könnten durch die Einstellung von ihnen gesehen zu werden. Das Protokoll wurde entwickelt, um jeden Prozess einmal durchlaufen. Allerdings haben einige der Schritte, mit neuen Lösungen wiederholt, um Proben, die nach dem ersten Versuch gescheitert zu erholen. Insbesondere haben die EDU klicken Reaktionsschritte (3,4-3,6), ohne einen signifikanten Anstieg in Hintergrundfluoreszenz wiederholt worden. Die Anti-Oregon Green-HRP Antikörper-Inkubation (4.1-4.3) und die Tyramid Verstärkung (4,4-4,5) wurden ebenfalls Schritte wiederholt, aber immer häufiger zu einem schlechten Signal-Rausch-Verhältnis wegen des erhöhten Hintergrundfluoreszenz. Die empfindlichsten Reagenzien sind die Click-iT EdU Buffer Additive (Komponente G) und dem Kaninchen-Anti-Oregon Green-HRP Antikörper (Komponente I) von der Click-iT EdU Microplate Assay-Kit. Die Click-iT EdU Buffer Additive färbt sich allmählich gelb im Laufe der Zeit bei 4 ° C gelagert und zwischen 6-12 Monaten merklich dunkler,. Die Lagerung der Click-iT EdU Buffer Additive bei -20 ° C wird zur Lösung dieses Problem. Die Kennzeichnung und Tyramid Verstärkung Schritte funktionieren am besten, wenn die Kaninchen-Anti-Oregon Green-HRP-Antikörper innerhalb von 4-6 Monaten Neugründung in MilliQ dH 2 O wird verwendet, Das milde Kennzeichnung von Edu in mtDNA erlaubt den direkten Vergleich mit weiteren zellulären Marker 9-11 und steigert den Nutzen dieser Technik gegenüber anderen Thymidin-Analoga, wie 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU), die eine harte Behandlung zur Wiederherstellung erfordert sein Epitop innerhalb der DNA. Unser Labor 11-12 und 13-15 andere haben erfolgreich BrdU zur mtDNA-Label. Die BrdU-Markierung Technik ist ähnlich dem für EdU verwendet, hat aber einige wichtige Unterschiede (Abbildung 5). Nach der Permeabilisierung Schritt oben genannten (3,1-3,2), ist der BrdU-Epitop mit einem Denaturierungsschritt erholt (2 N HCl für 30 min bei 37 ° C durch drei Wäschen in 1X PBS). Die BrdU wird dann mit einem primären Antikörper gegen BrdU markierte (Vector Laboratories 1:50 in 1% Blocking-Lösung aus dem TSA-Kit und inkubiert über Nacht bei 4 ° C). Ein sekundärer Antikörper Schritt ist notwendig, um die BrdU-Signal (Ziege anti-Maus IgG, konjugiert mit HRP von der TSA-Kits # 2 und # 5, 1:100 verdünnt in 1% Blocking-Lösung inkubiert und für 45 min bei Raumtemperatur), bevor verstärken die TSA Schritte (4,3-4,5 oben). Mit zwei Thymidinanaloga, Edu und BrdU, zu beschriften mtDNA ist vorteilhaft für die Durchführung von Dual-Label Experimente, in denen mtDNA nacheinander in Puls-Kennzeichnung Paradigmen 11 bezeichnet werden kann. Unser Labor ist mit der EDU und BrdU-Markierung der mtDNA, die Regulierung der mitochondrialen Biogenese im Rahmen der diabetischen Neuropathie, eine häufige Komplikation des Diabetes zu untersuchen. Wir haben erfolgreich die Signalverstärkung verwendet, um Änderungen in mtDNA Biogenese in einzelnen Neuronen 11-12 zu messen. Diese Technik wird in anderen Experimenten entwickelt, um die Mechanismen der mtDNA-Replikation und Umsatz oder zur Identifizierung von Drogen, die mtDNA-Synthese zu hemmen erkunden nützlich. Darüber hinaus können die Grundprinzipien der Verstärkung Edu und BrdU-Signale zu anderen Studien angewendet werden, messen die DNA-Replikation oder Reparatur.

<table><tbody><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>BioAssay-Schale, 245 mm × 245 mm</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10X-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid, 30 % in Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Mikroplatten-Assay-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>TSA-Kit Nr. 12, mit HRP&amp;#8212;Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 488-Tyramid</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>TSA-Kit Nr. 15, mit HRP&amp;#8211;Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 594-Tyramid</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade-Reagenz mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Neurofilament-Antikörper</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>Maus-monoklonaler Anti-BrdU-Antikörper</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>TSA-Kit Nr. 2, mit HRP&amp;#8212;Ziegen-Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 488-Tyramid</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>TSA-Kit Nr. 5, mit HRP&amp;#8212;Ziegen-Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 594-Tyramid</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der mitochondrialen dna-replikation in einzelnen zellen von edu signalverstärkung

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondrien sind wichtige Regulatoren der zellulären Energie-und mitochondrialen Biogenese ist ein wesentlicher Bestandteil der Regulierung Mitochondrien Zahlen in gesunden Zellen 1-3. Ein Ansatz für die Überwachung der mitochondrialen Biogenese ist die Rate der mitochondrialen DNA (mtDNA) Replikation 4 zu messen. Wir entwickelten eine empfindliche Technik zur neu synthetisierten mtDNA in einzelne Zellen markieren, um mtDNA Biogenese zu studieren. Die Technik vereint die Aufnahme von 5-Ethinyl-2&#39;-desoxyuridin (EDU) 5-7 mit einem Tyramid Signalverstärkung (TSA) 8 Protokoll zur mtDNA-Replikation in subzellulären Kompartimenten von Neuronen zu visualisieren. Edu ist besser als bei anderen Thymidin-Analoga, wie 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU), weil die ersten Klick Reaktion auf Etikett EdU 5-7 nicht erforderlich ist die harte Säure-Behandlungen oder Enzym verdaut, dass für das Freilegen der BrdU-Epitop erforderlich sind . Die milderen Kennzeichnung EdU ermöglicht den direkten Vergleich ihrer Gründung mit anderen zellulären Marker 9-10. Die Fähigkeit zu visualisieren und zu quantifizieren mtDNA Biogenese bietet ein wesentliches Instrument für die Untersuchung der Mechanismen zur mitochondrialen Biogenese regulieren und einen Einblick in die Pathogenese mit Medikamententoxizität, Alterung, Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbundene Dienstleistungen zu erbringen. Unsere Technik ist für sensorische Neuronen sowie andere Zelltypen. Der Einsatz dieser Technik auf mtDNA Biogenese Maßnahme hat erhebliche Auswirkungen in der Förderung des Verständnisses der beiden normalen zellulären Physiologie sowie beeinträchtigt Erkrankungen.

Wir entwickelten eine empfindliche Technik zur neu synthetisierten mitochondrialen DNA (mtDNA) in einzelne Zellen markieren, um mtDNA Biogenese zu studieren. Die Technik verbindet die Einbeziehung von EDU zusammen mit einem Tyramid Signalverstärkung (TSA) Protokoll, um mtDNA Replikation innerhalb subzellulären Kompartimenten von Neuronen zu visualisieren.

Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung

Mitochondrien sind entscheidende Regulatoren der zellulären Energie, und die mitochondriale Biogenese ist eine wesentliche Komponente der Regulierung der Mitochondrienzahl in gesunden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die M-T-D-N-A-Replikation in kultivierten Neuronen zu markieren und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Neuronen zunächst zwei bis 24 Stunden mit dem Thymidin-Analogon EDU inkubiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das EDU, das ein Alkin enthält, durch eine kupferkatalysierte kovalente Reaktion mit dem fluoreszierenden Orgon Green 488-Azid zu markieren.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Orgon-Grün-Signal mit einem Aramid-Signalverstärkungsschritt zu verstärken, um die in die neu synthetisierte mtDNA eingebaute EDU sichtbar zu machen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die mtDNA-Replikation in spezifischen subzellulären Kompartimenten von Neuronen durch die Kombination der Click-EDU-Chemie und der anschließenden Signalverstärkung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der BRDU-Markierung liegt darin, dass die EDU-Markierung einfacher und schonender ist und dadurch zusätzliche immunfluoreszenzbasierende Färbungen neuronaler Marker ermöglicht.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Regulation der Anzahl von Mitochondrien beantworten, beispielsweise wie Neuronen wechselnden Energiebedarf in ihren subzellulären Kompartimenten decken, einschließlich Zellkörpern, Axonen, Dendriten und synaptischen Endigungen. Somit kann diese Methode Einblicke in die Mechanismen gewähren, die der Pathogenese mehrerer mitochondrienerkrankungsbedingter neurologischer Erkrankungen zugrunde liegen, darunter Neuropathie und Neurodegeneration. Doch wichtig ist, dass sie auch auf andere Systeme angewendet werden kann, bei denen Veränderungen der Kopienzahl der mitochondrialen DNA wahrscheinlich der Pathogenese des Krankheitszustands zugrunde liegen, einschließlich Arzneimittelt oxizität, Krebs und Alterung.Dieses Video zeigt, wie neu synthetisierte mitochondriale DNA, abgekürzt mtDNA, in Wurzelhautganglien-Neuronen markiert wird, die auf sterilen 12-Millimeter-Glas-Deckgläsern kultiviert wurden. In einer 24-Loch-Kulturplatte wird der 10-Millimolar-Stammlösung von 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin, abgekürzt EdU, aus dem Click-iT EdU-Mikroplatten-Assaykit im Verhältnis 1:100 in Kulturmedium verdünnt, um eine 10× EdU-Stammlösung herzustellen. Die 10× EdU-Stammlösung wird anschließend direkt in das Medium jedes Wells gegeben. Die behandelten Neuronen werden dann zwei bis 24 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid in einem Abzug inkubiert.Fixieren Sie die Neuronen für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2 % Paraformaldehyd. Waschen Sie zweimal in 1× PBS, wobei jeder Waschschritt zwei bis fünf Minuten dauert. Die fixierten Neuronen können bis zu einem Monat lang in frischem 1× PBS bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.Bereiten Sie eine feuchte Kammer wie im begleitenden Text beschrieben vor. Verwenden Sie feine Pinzette, um 28 fixierte Deckgläser, einschließlich positiver und negativer EDU-Kontrollen, auf Blätter aus hydrophober Paraform M in der feuchten Kammer zu übertragen. Geben Sie erneut 200 bis 300 Mikroliter einer XPBS-Lösung auf, um die Oberfläche jedes Deckglases zu bedecken.Bereiten Sie das Click-it-Assay-Kit gemäß der Beschreibung im Text und den Herstelleranweisungen vor, um mitochondriale DNA in 75 bis 80 Mikroliter einer permeabilisierenden Lösung, die 0,1 % Tritton X in 1× PBS enthält, pro Deckglas zu markieren. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Pipettenspritzbirne mit einer 200-Mikroliter-Spitze am Ende, um die Flüssigkeit vorsichtig zu entfernen, ohne die Zellen zu verlieren.Benutzen Sie eine Pipettenspitze, um die Decke vorsichtig zu überfluten. Spülen Sie mit 200 bis 300 Mikrolitern einer XPBS-Lösung, um die vorherige Lösung gründlich zu entfernen. Spülen Sie jede Decke zweimal.Pipettieren Sie 75 bis 80 Mikroliter frisches 1 % Wasserstoffperoxid in 1× PBS auf jedes Deckglas. Inkubieren Sie abgedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu hemmen. Waschen Sie zweimal mit 1× PBS wie zuvor beschrieben und bereiten Sie frisch das Click-Reaktionscocktail gemäß dem begleitenden Text vor.Pipettieren Sie die Probe mehrmals auf und ab, um sie zu mischen. Vortexen Sie die Neuronen nicht. Fixieren Sie die Neuronen mit 75 bis 80 Mikrolitern Click-iT EDU-Fixiermittel pro Deckglas und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Während der Nachfixierung verdünnen Sie die Reaktionsmischung mit einem gleichen Volumen Click-iT EDU-Fixiermittel.Fügen Sie das Reaktionsgemisch zu jedem Deckglas hinzu, um es vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie es 25 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig und waschen Sie zweimal mit verdünntem 1×-Blockierpuffer unter einem epifluoreszierenden Mikroskop. Überprüfen Sie nach Abschluss der EDU-Färbung die Orgon-Gr&uuml;n-F&auml;rbung in den Kernen.Beginnen Sie die Signalverstärkung für Termiten oder TSA, indem Sie 1 % TSA-Blockierungslösung zu jedem Deckglas geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie kurz die Antikörper-Stammlösung gegen grünes Horsenradish-Peroxidase-Konjugat, die zwei bis 24 Stunden im Voraus vorbereitet wurde; verdünnen Sie den primären Antikörper im Verhältnis 1:300 in TSA-Blockierungslösung und mischen Sie durch Vorsichtiges Invertieren oder Pipettieren; vermeiden Sie Wirbelbildung. Geben Sie 75 Mikroliter auf jedes Deckglas, inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag dreimal mit jeweils einem XPBS bei Raumtemperatur spülen. Die Deckgläser zur zusätzlichen Entfernung nicht gebundener primärer Antikörper in der letzten Waschung weitere 30 bis 60 Minuten inkubieren. Die IDE-Reaktion unmittelbar vor der Anwendung gemäß dem Textteil dieses Protokolls vorbereiten.Die Deckgläser 15 Minuten bei Raumtemperatur mit der IDE-Reaktion inkubieren. Dreimal mit jeweils einem XPBS waschen und bei der letzten Wäsche 30 bis 60 Minuten inkubieren, wie zuvor unter dem Mikroskop. Auf MT-DNA-Färbung prüfen; erfolgreich gefärbte Neuronen auf Objektträgern mit einem ANTIFA-Einbettmedium, das DPI enthält, wurden hier abgebildet. Dargestellt sind repräsentative Differentialinterferenzkontrast-Aufnahmen von embryonalen und adulten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions, die typischerweise für die Analyse verwendet werden.Diese schematischen Diagramme veranschaulichen das Verfahren zur Markierung von EDU in mtDNA mit einem grünen fluoreszierenden Signal. Mitotisch aktive F11-Neuroblastomzellen dienen als positive Kontrolle und zeigen das Markierungsmuster von EDU, das in nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde, in diesen repräsentativen Fluoreszenzbildern, die über Hellfeldaufnahmen gelegt sind. Die grünen punktförmigen Signale zeigen das verstärkte EDU-Signal, das in die neu synthetisierte mtDNA sowohl embryonaler als auch adulter Neuronen des dorsalen Wurzelganglions eingebaut wurde.Das EDU-Markierungsverfahren ermöglicht anschließende immunfluoreszenzfarbliche Färbungen neuronaler Marker wie Neurofilament in Rot. Diese schematischen Abbildungen veranschaulichen das Verfahren zur Markierung von EDU und mtDNA mit einem roten fluoreszierenden Signal. Mitotisch aktive F11-Neuroblastomzellen dienen als positive Kontrolle und zeigen das Markierungsmuster von EDU, das in nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde.Dieses schematische Diagramm zeigt das Verfahren zur Markierung von BRDU in neu synthetisierter M-T-D-N-A mit einem grünen oder roten fluoreszierenden Signal. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontrollen mit mitotisch aktiven Zellen durchzuführen, um eine erfolgreiche EDU-Markierung und Zellkerne zu überprüfen, bevor mit den Amplifikationsschritten zur Visualisierung der MT-DNA-Markierung fortgefahren wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Standard-Immunfluoreszenz angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die mitochondriale DNA-Synthese in spezifischen Subpopulationen von Neuronen oder neuronalen Kompartimenten reguliert wird. Aufgrund ihrer Entwicklung wird diese Technik es Forschern im Bereich der Neurobiologie ermöglichen, die Regulation der Mitochondrienanzahl in Kulturmodellen sowohl der normalen Physiologie als auch von Kulturmodellen, die eine beeinträchtigte Erkrankung simulieren, zu untersuchen.Neurologische Zustände.

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