Name: Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie die Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme an äußeren Haarzellen von postnatalen Ratten zur Untersuchung der funktionellen Entwicklung des Hörvermögens. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen einzelner Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 973 Programm (2014CB943002) und die National Natural Science Foundation of China (11534013, 31500841) unterstützt.

Alle experimentelle Protokolle mit tierischen Probanden stimmten mit der Tier-Ethik-Kommission der Southern Medical University.
1. bereiten Sie Lösungen für Experimente
<ol><li>Vorbereiten die Narkose (siehe Tabelle der Materialien): 1,5 % Pentobarbital-Natrium aufgelöst in DdH2O.</li>
	<li>Bereiten Sie die Dissektion-Lösung (siehe Tabelle der Materialien): ein Beutel Leibovizs L-15 Pulver in 1 L des DdH2O. Adjust pH-Wert 7.3 mit 1 M NaOH zu lösen. Passen Sie Osmolarität, 300-330 mOsm mithilfe einer XR und 10 mM HEPES vor Gebrauch an.</li>
	<li>2 mg/mL Kollagenase IV auflösen (siehe Tabelle der Materialien) in Dissektion Lösung in Schritt 1.2 vorbereitet.</li>
	<li>Bereiten Sie die Immunostaining Lösungen (siehe Tabelle der Materialien): lösen Sie die 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Verdünnen Sie 0,3 % Durchlässigkeit Agent in PBS. Verdünnen Sie die 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer als die blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Prestin Antikörper 1: 200 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Alexa488-konjugierten Antikörper 1:600 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie Phalloidin-Tetramethylrhodamine B erfolgt 1: 200 mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien): Vorbereiten der Leiboviz L-15 Medium wie beschrieben (Schritt 1.2).</li>
	<li>Bereiten Sie die intrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>(2) ABR Aufnahme
Hinweis: ABR Aufnahme wurde zuvor ausführlich in unseren vorherigen Studie9beschrieben.
<ol><li>Sprague-Dawley (SD) Ratten (1-14 Tage alten Welpen und 2 - Monate alte Erwachsene beiderlei Geschlechts) mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg für Welpen und 30 mg/kg für Erwachsene, intraperitoneal (i.p.)) zu betäuben.</li>
	<li>Legen Sie das narkotisierten Tier in eine Form von Polyethylen-Schaum, Körper des Tieres zu immobilisieren. Legen Sie das Tier auf eine Anti-Vibrations-Tisch in einem Raum Klang-Dämpfung. Halten Sie das Tier Körpertemperatur bei 37,5 ° C mit einem Heizkissen.</li>
	<li>Wischen Sie den Kopfbereich mit Ethanol 70 % (Vol/Vol). Mithilfe einer feinen Schere machen Sie einen 1-2 mm Einschnitt ventrolateralen zu der externen Pinna, die Referenzelektrode oder Boden zu platzieren. Ein Subdermale Nadelelektrode (Aufnahme Elektrode) befindet sich über den Schädel Scheitelpunkt (Abbildung 1A).</li>
	<li>Der Funktionsgenerator mit kalibrierten Ton platzt (1 ms steigen/fallen, 3 ms Plateau) verschiedener Frequenzen erzeugen (2, 4, 8, 16, 24 und 32 kHz) und Intensitäten (verringerte sich von 85 auf 10 dB SPL in Schritt 5 dB). Variieren Sie die Frequenz und Amplitude manuell oder mit Hilfe eines Computers. Liefern Sie Ton Reize durch eine elektrostatische Lautsprecher 10 cm entfernt in Richtung zum Kopf des Tieres gelegen.</li>
	<li>(100-1.000 Hz) zu filtern, zu verstärken und durchschnittlich (256 mal) den Wirtschaftsteilnehmern Klangpotential mit einem Multi-Funktions-Prozessor, das ABR bekommen. Die ABR-Spuren wird überwacht, Online- und offline-Analyse gespeichert. Es dauert ca. 40 min, um die Aufnahme von einem Tier ABR abzuschließen. Hinweis: In der Regel drei bis sieben Gipfel (ich Welle auf Welle VII) mit Latenzen identifiziert weniger als 15 ms werden kann (Abbildung 1 b). Die ABR-Schwelle ist definiert als die minimale Lautstärke auf dem Wave I und II nachgewiesen werden konnte.</li>
	<li>Bevor die Tiere wach aus der Narkose (mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 mL 1,5 % Natrium Pentobarbital) einschläfern.</li>
</ol>(3) das Organ von Corti (OC)-Dissektion
<ol><li>Ratte Welpen zu betäuben. Für Ratten weniger als 6 Tage alt (< P6), halten Sie das Tier in der Kulturschale 100 mm und bedecken Sie die Schüssel mit Eis für 10 Minuten. Für Ratten > P6, Betäuben Sie das Tier mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Enthaupten Sie die Ratte Welpen nach der Narkose.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Kopf durch Besprühen mit 70 % Ethanol (Vol/Vol).</li>
	<li>Öffnen Sie den Schädel entlang der sagittalen Mittellinie mit einer Schere; Entfernen Sie das Gehirn, die das Innenohr aussetzen.</li>
	<li>Transfer im Innenohr in einer 35-mm-Petrischale gefüllt mit 3 mL eiskaltes L-15 (Abbildung 2A).</li>
	<li>Verwenden Sie unter dem Mikroskop Dissektion feine Zange um die knöchernen Kapsel der Cochlea (Abb. 2 b) zu entfernen.</li>
	<li>Packen Sie das OK und die damit verbundenen Stria Vascularis (SV) aus den Modiolus.</li>
	<li>Durch halten der basale Teil des SV mit der Pinzette, trennen die OC vom SV völlig entspannen langsam von Basis-zu-Spitze (Abbildung 2).</li>
	<li>Schneiden Sie die OC gleichmäßig mit feinen Schere (Abb. 2D) in drei Stücke.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenz-Färbung
<ol><li>Mithilfe einer 200 µL PIPETTENSPITZE die Segmente von OC (Schritt 3,8) auf einen Objektträger übertragen und fixieren mit 100 µL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Stunden bei 4 ° C. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Waschen Sie das Gewebe durch Verschieben der Paraformaldehyd mit 100 µL frische PBS. Waschen Sie das Gewebe drei Mal für 10 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe mit 0,3 % Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Den Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer zu verwerfen und das Gewebe dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Block mit 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit Anti-Prestin-C-Terminus Antikörper (1: 200) in blocking-Lösung für 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie für 5 min dreimal mit PBS.</li>
	<li>Mit Alexa488-konjugierten Sekundärantikörper (1:600) in blockierende Lösung für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.</li>
	<li>10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Rhodamin-Phalloidin (1: 200) inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.</li>
	<li>Auf einem Objektträger mit Eindeckmedium (mit DAPI) montieren. Bild mit konfokalen Mikroskopie mit 405 nm, 488 nm und 594 nm Laser. Legen Sie die Laserleistung bei 0,1-0,5 mW und der Scan bei 0,5 Frame/s Geschwindigkeit.</li>
</ol>5. Patch Clamp Aufnahme von isolierten OHCs
<ol><li>Verwenden Sie die Pipette Puller und Mikro-Fälscher zu Patch Pipetten mit einem Tipp-Durchmesser ca. 2-3 µm. Rücken-Füllung der Pipetten mit intrazellulären Lösung. In der Regel wurde der anfängliche Widerstand der Patch Pipette 2,5-3,5 MΩ in Bad-Lösung.</li>
	<li>Übertragen Sie durch die Verwendung einer PIPETTENSPITZE 200 µL ein Stück von der OC (aus Schritt 3,8) in ein 35 mm Petrischale. Das Gewebe mit 100 µL der enzymatischen Verdauung Medium zu verdauen (Kollagenase IV, siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die enzymatische Verdauung Medium mit 100 µL der L-15 zu verdrängen. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Mikro Skalpell um zu isolieren, die Haarzellen in kleine Stücke.</li>
	<li>Nach der sanften pipettieren, übertragen die Zellen in einer hausgemachten kleinen Kunststoff-Kammer (Durchmesser ~ 1,5 cm) gefüllt mit enzymfreien Bad-Lösung (~ 1,5 mL, siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Platzieren Sie die Kammer auf der Bühne von einem inversen Mikroskop. Die gesund erscheinenden einsame OHCs zu finden.</li>
	<li>Laden Sie die Patch-Pipette in den Kopf Bühne eines 700 b-Verstärkers. Bewegen Sie die Patch-Pipette vorsichtig mit einem Mikromanipulator und positionieren Sie es rund um die Unterseite der äußeren Haarzellen (Abb. 3A).</li>
	<li>Ganze Zelle Patch Clamp OHC durch Versiegelung der seitlichen Wand der Zellkörper. Wenden Sie leichte Saugwirkung, bis die Zellmembran gebrochen ist. Festgesetzt im Betrieb möglichen-70 mV. Zellen mit Zugang reichte von 10 bis 17 MΩ und Membran Beständigkeit reichte von 100 bis 500 MΩ und gelten als eine erfolgreiche ganz-Zell Konfiguration.</li>
	<li>Mit Computersteuerung, gelten hyperpolarizing und depolarisierende Spannung (250 ms Dauer und von −140 bis + 94 mV in 13 mV Schritten) in die Zelle ganz-Zell-Ströme zu entlocken.</li>
	<li>Verstärken Sie die gesamte Zelle Ströme zu, Filtern Sie (Ecke Frequenz von 5 kHz) von einem 700 b-Verstärker. Konvertieren Sie die Daten durch eine 1440A-Konverter und ein Geschäft für offline-Analyse.</li>
	<li>Messen Sie die Membran-Kapazität der OHCs mit einem zwei sinusförmige Spannung Stimulus-Protokoll durch eine Patch-Clamp-Software gesteuert. Legen Sie den Spannungsbereich stimulieren von-140 bis 110 mV. Speichern Sie die Daten für die offline-Analyse.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bei Ratten jünger als 11. Tag konnte kein Aktionspotential in Reaktion auf klangstimulation im auditorischen Kortex6,7beobachtet werden. Daher bezeichnet man als "Anhörung Ausbruch"10postnatale Tag 11. Die Entwicklung des Gehörs vor Beginn der mündlichen Verhandlung noch nicht gut untersucht wurde. Ähnliche Methode für Erwachsene ABR Aufnahme, wir zeigen, dass ABRs durch reinen Ton Burst Ratte Welpen jünger als P11 ausgelöst werden konnte ...

Zwei unterschiedliche Funktionen von Cochlea-sensorischen Haarzellen sind für Säugetiere hören: Mechanoelectric Transduktion (MET) und Electromotility1,2. Durch MET-Kanäle in das Haarbündel, IHC (IHC) und OHCs konvertieren Klangschwingung Membran potenzielle Veränderungen sowie die elektrischen Signale der innervierten Spirale Ganglion Neuronen gelegen. OHCs ihre Zelle Länge mit dem Membranpotential ändern und die Schwingung des Low-Level-Sound zu verstärken. Diese Tätigkeit als Electromotility bezeichnet wird durch den motor Protein Prestin befindet sich in der Seitenwand des OHCs3abgeleitet.
In vielen Arten, einschließlich der Nagetiere ist die Anhörung Funktion unreif in frühen postnatalen Epoche4,5. Kein Aktionspotential in Reaktion auf akustische Signale konnte im auditorischen Kortex vor der mündlichen Verhandlung Anfang6,7nachgewiesen werden. Entwicklung der Morphologie und Funktion der Cochlea ist weit verbreitet in Maus, Rennmaus und Ratte4,5,8untersucht worden. Der mechanotransduktion und Electromotility der Haarzellen entstehen auch in den frühen Leben Epoche5.
Um die Hörfähigkeit Empfindlichkeit von Ratten in verschiedenen Altersstufen postnatale zu bewerten, haben wir eine Methode für auditory Brainstem Response (ABR) Aufnahme in Ratte Welpen entwickelt. Ganze Zelle Patch-Clamp ist eine ideale Technologie um die OHCs Elektrophysiologisch untersuchen. Allerdings begrenzt die niedrige Rate der gesamten Zelle Versiegelung im Vergleich mit der Patch-Clamp in Neuronen und anderen epithelialen Zellen durchgeführt, die Untersuchung der Electromotility der isolierten OHCs.
Hier beschreiben wir ein Verfahren um die OHCs morphologisch und Elektrophysiologisch in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Diese Methode kann geändert werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die inneren Haarzellen Entwicklung und Funktion regulieren.

<table><tbody><tr><td>Anesthetic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>sodium Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5% in Wasser</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Dissektionslösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 Packung in 1 L Wasser</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/ml in L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Immunfärbelösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7,3</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0,3% in PBS</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% in PBS</td></tr><tr><td>prestin Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamin B isothiocyanat</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Name</td><td> Firma</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Extrazelluläre Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 Packung in 1 L Wasser</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Intrazelluläre Lösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>Pinzette dumont</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini Betriebssystem</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Geräuscharmes Datenerfassungssystem</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 Lautsprecher</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT-System 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>><>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP Software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRP Software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD</td><td>Ratte Experimental Animal Center der Southern Medical University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

auditory brainstem response und äußeren haarzellen whole-cell patch clamp aufnahme bei postnatalen ratten

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Die äußeren Haarzellen ist eines der zwei Arten von sensorischen Haarzellen in der Säugetier-Cochlea. Sie verändern ihre Zelle Länge mit dem Rezeptor potential um die schwache Vibration der Low-Level-akustisches Signal zu verstärken. Die Morphologie und elektrophysiologische Eigentum der äußeren Haarzellen (OHCs) im frühen postnatalen Alter zu entwickeln. Die Reifung der äußeren Haarzellen kann zur Entwicklung des auditorischen Systems. OHCs Entwicklungsprozess ist jedoch nicht gut untersucht. Dies ist zum Teil wegen der Schwierigkeit, ihre Funktion an eine elektrophysiologische Ansatz zu messen. Mit dem Ziel der Entwicklung einer einfachen Methode zur Lösung des obigen Problems, beschreiben wir hier eine Schritt für Schritt Protokoll, um die Funktion des OHCs in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir bewerten die Cochlea-Reaktion auf reinen Ton Reize und untersuchen die Ausdruck Ebene und die Funktion der motorischen Protein Prestin in OHCs. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die inneren Haarzellen (IHC) zu untersuchen.

ABR kann von narkotisierten Ratte Welpen älter als postnatale 7.Tag (P7) mit reinen Ton platzt (Abbildung 1A) hervorgerufen werden. Wie in Abbildung 1 bgezeigt, erhielt die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen zeigte nur drei bis vier unterschiedliche Wellen mit kleiner Amplitude. In der Regel bis zu sieben Gipfel in ABR Wellenformen adulter Tiere (Abbildung 1 b) beobachtet.
<p class="jove_content" ...

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Das übergeordnete Ziel dieses elektrophysiologischen Assays ist es, die morphologischen und funktionellen Veränderungen der Cochlea-Haarzellen während der postnatalen Entwicklung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Abteilung für akustische Assistenten zu beantworten, z. B. wann unsere Haarzellen ihre Funktionen während des Einsetzens des Hörens erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, die Funktion einzelner Haarzellen zu bewerten, die aus den postnatalen Rattenbabys isoliert wurden.Das Verfahren wird von Wenlu Pan, Shasha Guo und Nana Xu demonstriert, die Studenten unseres Labors waren. Um diesen Vorgang zu beginnen, legen Sie das betäubte Tier in eine Form aus Polyethylenschaum, um den Körper des Tieres bewegungsunfähig zu machen. Stellen Sie das Tier dann auf eine Antivibrationsliege in einem schalldämpfenden Raum.Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen auf 37,5 Grad Celsius. Wischen Sie anschließend den Kopfbereich mit 70% Ethanol ab. Machen Sie einen ein bis zwei Millimeter großen Schnitt ventral-lateral an der äußeren Ohrmuschel, um die Referenzelektrode oder Masseelektrode

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Whole-Cell-Patch-Clamp Messungen von auditiven Nervenfaser Dendriten an der inneren Haarzelle ribbon Synapsen im Säuger-Cochlea.

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Dieses Video zeigt eine Methode zur Aufzeichnung von auditiven Hirnstammreaktionen (ABRs) von Rattenwelpen. Es beschreibt die Schritte für die Elektrodenplatzierung, die Anwendung von Schallreizen und die Signalverarbeitungsanalyse im Hirnstamm, um neuronale Reaktionen zu bewerten.

Aufzeichnung auditiver Hirnstammreaktionen bei einem Rattenwelpen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation eines Cochlea-Geräts in eine taube Maus und zum Anwenden elektrischer Stimuli zur Aufzeichnung der auditorischen Hirnstammreaktionen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die grundlegenden Mechanismen des elektrischen Hörens zu verstehen und kann zu Fortschritten in der Cochlea-Implantat-Technologie und den auditorischen Neurowissenschaften beitragen.

Aufzeichnung elektrisch evozierter auditiver Hirnstammreaktionen bei einer tauben Maus

Dieses Video demonstriert die Patch-Clamp-Technik zur Messung von Ionenströmen in sensorischen Neuronenzellkörpern des Innenohrs. Darin wird die Herstellung und Verwendung einer polierten Patch-Clamp-Pipette beschrieben, die mit einer internen Lösung gefüllt ist, die Amphotericin B enthält und die Membran perforiert, um die Bewegung der Ionen zu ermöglichen und gleichzeitig die intrazellulären Bedingungen zu erhalten. Spannungsimpulse werden angelegt, um die Aktivität der Ionenkanäle auszulösen...

Perforierte Patch-Clamp-Aufnahmen von sensorischen Neuronenzellkörpern des Innenohrs

Dieses Video zeigt die Untersuchung der Erregbarkeit sensorischer Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, um die Rheobase und das Membranpotential zu messen und die Reaktionen der Neuronen auf inkrementelle Strominjektionen zu analysieren.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an intakten Spinalwurzelganglien der Ratte

Dieses Manuskript beschreibt, wie man intakte dorsale Wurzelganglien für Patch-Clamp-Aufnahmen vorbereitet. Dieses Präparat erhält die Mikroumgebung für Neuronen und Satelliten-Gliazellen aufrecht und vermeidet so die phänotypischen und funktionellen Veränderungen, die bei dissoziierten DRG-Neuronen beobachtet werden.

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Wir präsentieren Ihnen eine Technik für lokalisierte Verabreichung von Medikamenten durch die Trans-Trommelfells Route in die Cochlea. Drug-Delivery über diesen Weg würden die Anti-Krebs-Wirksamkeit von Chemotherapeutika wie Cisplatin nicht beeinträchtigen.

Trans-Trommelfells Drug-Delivery für die Behandlung von Ototoxizität

Brainstem evozierte Reaktion Audiometrie ist ein wichtiges Werkzeug in der klinischen Neurophysiologie. Heutzutage wird die Hirnstamm-Evokologie auch in der Grundlagenforschung und in präklinischen Studien angewendet, an denen sowohl pharmakologische als auch genetische Tiermodelle beteiligt sind. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung, wie auditive Hirnstammreaktionen erfolgreich bei Mäusen aufgezeichnet und analysiert werden können.

Datenerfassung und -analyse in Brainstem Evokierte Reaktion Audiometrie bei Mäusen

Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.

Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

Lernen Sie die Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme an äußeren Haarzellen von postnatalen Ratten zur Untersuchung der funktionellen Entwicklung des Hörvermögens. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen einzelner Zellen.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Weitere Videos entdecken