Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Das übergeordnete Ziel dieses elektrophysiologischen Assays ist es, die morphologischen und funktionellen Veränderungen der Cochlea-Haarzellen während der postnatalen Entwicklung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Abteilung für akustische Assistenten zu beantworten, z. B. wann unsere Haarzellen ihre Funktionen während des Einsetzens des Hörens erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, die Funktion einzelner Haarzellen zu bewerten, die aus den postnatalen Rattenbabys isoliert wurden.

Das Verfahren wird von Wenlu Pan, Shasha Guo und Nana Xu demonstriert, die Studenten unseres Labors waren. Um diesen Vorgang zu beginnen, legen Sie das betäubte Tier in eine Form aus Polyethylenschaum, um den Körper des Tieres bewegungsunfähig zu machen. Stellen Sie das Tier dann auf eine Antivibrationsliege in einem schalldämpfenden Raum.

Halten Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem Heizkissen auf 37,5 Grad Celsius. Wischen Sie anschließend den Kopfbereich mit 70% Ethanol ab. Machen Sie einen ein bis zwei Millimeter großen Schnitt ventral-lateral an der äußeren Ohrmuschel, um die Referenzelektrode oder Masseelektrode zu platzieren.

Platzieren Sie dann eine subdermale Aufzeichnungselektrode über dem Schädelscheitel. Erzeugen Sie mit dem Funktionsgenerator kalibrierte Tonausbrüche verschiedener Frequenzen und Intensitäten. Geben Sie die Schallreize über einen elektrostatischen Lautsprecher ab, der sich 10 Zentimeter vom Kopf des Tieres entfernt befindet.

Um die auditiven Hirnstammreaktionen zu erhalten, werden die durch Schall ausgelösten Potentiale mit Hilfe eines Multifunktionsprozessors gefiltert, verstärkt und gemittelt. Die 40-minütige ABR-Aufzeichnung wird online überwacht und für die Offline-Analyse gespeichert. In diesem Abschnitt sterilisieren Sie den Kopf des Tieres, indem Sie ihn mit 70% Ethanol besprühen.

Öffnen Sie als Nächstes den Schädel entlang der sagittalen Mittellinie mit einer Schere und entfernen Sie das Gehirn, um das Innenohr freizulegen. Übertragen Sie dann das Innenohr in eine 35 Millimeter große Petrischale, die mit drei Millilitern eiskaltem L-15 Medium von Leibovitz gefüllt ist. Unter dem Präpariermikroskop entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die knöcherne Kapsel der Cochlea.

Entpacken Sie danach OC und SV, die mit modiolus verknüpft sind. Indem Sie den basalen Teil von SV mit einer Pinzette festhalten, trennen Sie OC vollständig von SV, indem Sie es langsam von der Basis zur Spitze abwickeln. Anschließend das OC mit einer feinen Schere gleichmäßig in drei Stücke schneiden.

Alle Arbeitsschritte sollten so schnell wie möglich in eiskaltem L-15 durchgeführt werden, um den Abbau und die Verschlechterung des Gewebes zu minimieren. In diesem Schritt übertragen Sie die OC-Segmente mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf einen Objektträger. Fixieren Sie sie mit 100 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd für mindestens vier Stunden bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie anschließend das Tuch, indem Sie das Paraformaldehyd durch 100 Mikroliter frisches PBS ersetzen. Waschen Sie dann das Taschentuch dreimal für jeweils 10 Minuten. Inkubieren Sie anschließend das Gewebe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,3 % Permeabilitätsmittel in PBS.

Entsorgen Sie nach 30 Minuten das Permeabilitätsmittel und waschen Sie das Tuch dreimal mit PBS. Blockieren Sie anschließend das Gewebe mit 10% normalem Ziegenserum und PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie das Gewebe mit Anti-Prestin, C-Terminus, Antikörper und Blockierungslösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius über Nacht.

Waschen Sie dann das Taschentuch dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Inkubieren Sie anschließend das Gewebe mit Alexa 488-konjugiertem Sekundärantikörper in Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie das Taschentuch dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten im Dunkeln.

Inkubieren Sie anschließend das Gewebe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Rhodamin-Phalloidin. Waschen Sie das Taschentuch dreimal fünf Minuten lang im Dunkeln mit PBS. Montieren Sie dann die Probe mit Einbettmedium auf einen Objektträger.

Bilden Sie es mit konfokaler Mikroskopie mit 405-Nanometer-, 488-Nanometer- und 594-Nanometer-Lasern ab. Verwenden Sie bei diesem Verfahren den Pipettenabzieher und den Mikroschmied. Stellen Sie Patch-Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von zwei bis drei Mikrometern her.

Füllen Sie dann die Pipetten mit intrazellulärer Lösung auf. Übertragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ein Stück OC in eine 35-Millimeter-Petrischale. Verdauen Sie das Gewebe mit 100 Mikrolitern enzymatischem Verdauungsmedium für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Als nächstes wird das enzymatische Verdauungsmedium durch 100 Mikroliter L-15 ersetzt. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Mikroskalpell in kleine Stücke, um die Haarzellen zu isolieren. Nach schonendem Pipettieren überführen Sie die Zellen in eine selbstgemachte kleine Plastikkammer, die mit enzymfreier Badelösung gefüllt ist.

Stellen Sie dann die Kammer auf den Tisch eines inversen Mikroskops und suchen Sie die gesund erscheinenden solitären OHCs. Laden Sie anschließend die Patch-Pipette in die Kopfstufe eines 700B-Verstärkers. Positionieren Sie die Patch-Pipette um den Boden der äußeren Haarzelle.

Anschließend wird das OHC mit einem Ganzzellpflaster geklemmt, indem die Seitenwand des Zellkörpers versiegelt wird. Wenden Sie einen leichten Sog an, bis die Zellmembran aufgerissen ist. Stellen Sie dann das Haltepotenzial auf 70 Millivolt ein.

Zellen mit einem Zugangswiderstand von 10 bis 17 Megaohm und einem Membranwiderstand von 100 bis 500 Megaohm gelten als erfolgreiche Ganzzellenkonfiguration. Wenden Sie hyperpolarisierende und depolarisierende Spannung an die Zelle an, um Ströme für die gesamte Zelle zu erzeugen. Messen Sie die Membrankapazität von OHCs mit einem Zwei-Sinus-Spannungs-Stimulusprotokoll, das von der Patch-Clamp-Software gesteuert wird.

Stellen Sie den Stimulationsspannungsbereich von 140 bis 110 Millivolt ein und speichern Sie die Daten für die Offline-Analyse. Nach schonender Verdauung wurden die OHCs aus dem OC isoliert. Ganzzell-Spannungsklemmen-Aufzeichnungen wurden von OHCs durchgeführt, die akut aus der Cochlea der Ratte isoliert waren. Ein repräsentatives Beispiel für den gesamten Zellstrom, der von einem isolierten P9-OHC als Reaktion auf ein von 140 auf 107 Millivolt geändertes Membranpotential aufgezeichnet wurde, ist hier dargestellt.

Diese Abbildung zeigt die nichtlineare Membrankapazität, die von zwei OHCs unterschiedlichen Alters erhalten wurde. Die kapazitiven Spannungsantworten wurden an die Boltzmann-Funktion angepasst. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie angemessen ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Messungen wie Western Blotting und PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bewertung des Expressionsniveaus einiger Proteine, wie z.B. Prestin in unseren Haarzellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Haarzellen, um die elektrophysiologischen Eigenschaften der Cochlea und des vestibulären Systems zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man morphologische und funktionelle Veränderungen der Cochlea-Haarzellen während der postnatalen Entwicklung untersucht.