Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, unerfahrene PTM-Forscher in die Lage zu versetzen, mit einem einzigen umfassenden System effektiv zu bestimmen, ob ihr Zielprotein endogen durch ein oder mehrere PTMs modifiziert wird. Diese Methode wird die Untersuchung des posttranslationalen Modifikationsfeldes verbessern, indem sie den Nachweis von Schlüssel-PTMs und potenziellem Crosstalk für jedes Zielprotein mit einem einzigen, vereinfachten System ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Nicht-PTM-Experten nachweisen können, ob ein Protein endogen durch ein oder mehrere PTMs in ihrem Modellsystem modifiziert wird.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir die Regulationsmechanismen für verschiedene zelluläre Signalwege untersuchten, und stellten fest, dass unsere benutzerfreundlichen Kits oder Systeme nicht wirklich für die Untersuchung von Nicht-Phospho-PTMs verfügbar waren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Präparation von A431-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie außerdem die Blasterlyse in Verdünnungspuffern mit Inhibitoren vor.

Gießen Sie den Nährboden ab und legen Sie die Zellen auf Eis. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit 10 Millilitern 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich, bevor Sie Blaster-Lysepuffer hinzufügen, um die Zelllyse zu maximieren.

Geben Sie 600 Mikroliter Blaster-Lysepuffer auf jede 150-Millimeter-Platte. Die Menge des Puffers richtet sich nach der erwarteten Proteinausbeute. Anschließend lysieren Sie die Zellen mit einem Zellschaber.

Das Lysat wird durch die Kernlyse zähflüssig. Verwenden Sie eine abgeschnittene Pipettenspitze, um das Rohlysat in einen Blasterfilter zu überführen, der in ein 15-Milliliter-Sammelröhrchen gegeben wurde. Verwenden Sie den mitgelieferten Filterkolben, um den Blasterfilter vollständig zu komprimieren, und sammeln Sie den Lysatdurchfluss einschließlich aller Blasen in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Der einfache, effiziente Blasterfilter entfernt genomische DNA, anstatt sie zu scheren, wie es bei anderen häufig verwendeten Methoden der Fall ist. Das geklärte Lysat wird mit Blaster-Verdünnungspuffer auf ein Endvolumen von drei Millilitern pro 150-Millimeter-Platte verdünnt. Das endgültige Volumen basiert auf der erwarteten Proteinausbeute.

Dieser Schritt ist wichtig, da die endgültige Pufferzusammensetzung die Stringenz der Aminofällungsreaktion beeinflusst. Bereiten Sie als Nächstes den Proteinquantifizierungsassay vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Messen Sie die Absorption der Lysatprobe bei 600 Nanometern und berechnen Sie die Proteinkonzentration.

Drehen Sie das Reagenzröhrchen mehrmals um, um sicherzustellen, dass die Kügelchen vollständig im Röhrchen resuspendiert sind. Für jeden IP-Assay aliquotiert die Bead-Suspension in separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Geben Sie hier 20 Mikroliter Ubiquitin-Affinitätskügelchen, 30 Mikroliter Phosphotyrosin-Affinitätskügelchen, 40 Mikroliter SUMOylierungs-2/3-Affinitätskügelchen oder 50 Mikroliter Acetylierungs-Affinitätskügelchen zu den einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen.

Drehen Sie die Reagenzröhrchen mit den Ubiquitinierungs-IP-Kontrollkügelchen und IGG-Kontrollkügelchen mehrmals um, um sicherzustellen, dass die Kügelchen vollständig im Röhrchen resuspendiert sind. Als nächstes aliquotieren Sie die Kontrollkügelchen pro Kontrollreaktion, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Geben Sie hier 20 Mikroliter Ubiquitin-Kontrollkügelchen, 30 Mikroliter Phosphotyrosin-Kontrollkügelchen, 40 Mikroliter SUMOylierungs-2/3-Kontrollkügelchen oder 50 Mikroliter Acetylierungskontrollkügelchen in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.

Sparen Sie 20 Mikroliter Lysat, um es als Western-Blot-Eingabe-Lysatkontrolle auszuführen. Geben Sie fünf Mikroliter 5x Probenpuffer in das reservierte Lysat und kochen Sie es fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Fügen Sie als Nächstes Lysat zu jeder IP-Röhre hinzu und steuern Sie die IP-Röhre.

Dabei wurde ein Milligramm Lysat pro IP und Kontrollreaktion verwendet, was zu insgesamt acht IP-Reaktionen führte. Inkubieren Sie die Röhrchen auf einer endseitigen und rotierenden Plattform bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Nach der Inkubation sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei drei bis 5.000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius.

Saugen Sie so viel Überstand wie möglich ab, ohne die Kügelchen zu stören, waschen Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang in einem Milliliter Blaster-Waschpuffer auf einer rotierenden Plattform mit vier Grad Celsius und sammeln Sie die Kügelchen wie zuvor durch Zentrifugation. Nach dem Zentrifugieren so viel Überstand wie möglich absaugen, ohne die Kügelchen zu stören, und den Waschschritt noch zwei Mal wiederholen. Nach der abschließenden Wäsche und Zentrifugation wird der größte Teil am Pufferüberstand abgesaugt und dann der restliche Überstand mit einer Proteinladespitze mit feiner Bohrung entfernt.

Eine minimale Störung des Bead-Pellets ist akzeptabel. Stellen Sie sicher, dass alle Waschpuffer entfernt wurden, während die Störung des Beat-Pellets minimiert wird, um die Rückgewinnung Ihrer PTM-Proteine zu maximieren. Fügen Sie als Nächstes 30 Mikroliter Bead-Elutionspuffer hinzu und resuspendieren Sie die Perlen, indem Sie vorsichtig auf die Seite des Röhrchens klopfen oder schnippen.

Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt keine Pipette. Inkubieren Sie die resuspendierten Kügelchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Schneiden Sie das Ende der Transferpipettenspitze ab und übertragen Sie jede Bead-Suspension vorsichtig in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugen-Spin-Säule, die in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben wurde.

Zentrifugieren Sie die Probe zwischen neun und 10.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur, um die IP-Probe zu entnehmen, fügen Sie dann jeder Probe zwei Mikroliter 2-Mercaptoethanol hinzu und mischen Sie sie gut. Legen Sie die Proben fünf Minuten lang in ein 95 Grad Celsius heißes Wasserbad. Nach der Inkubation wird die Probe durch Zentrifugation bei 10.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur entnommen.

Fahren Sie abschließend mit dem Ausführen von SDS PAGE, Transfer und Western Blot-Analyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Unbehandeltes und EGF-behandeltes A431-Zelllysat wurde zu Ubiquitin-, Phosphotyrosin-, SUMO 2/3- und Acetyllysin-Affinitätskügelchen hinzugefügt. Ein PD-L1-Antikörper wurde für die westliche Immunoblot-Analyse verwendet, um festzustellen, ob das PD-L1-Protein durch diese vier PTMs als Reaktion auf die EGF-Stimulation modifiziert wurde.

Repräsentative Ergebnisse, die hier gezeigt werden, deuten darauf hin, dass diese Methode endogene PTM-Modifikationen von PD-L1 effektiv identifiziert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis 4 1/2 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit diesem umfassenden PTM-Nachweissystem enogenes PTM oder Crosstalk für Ihr Zielprotein oder Ihren Signalweg nachweisen können.