Name: Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Tiefen-Proteom-Profilierung durch isobare Kennzeichnung und LC-MS/MS zur Quantifizierung von über 10.000 Proteinen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Proteinveränderungen unter verschiedenen Bedingungen.

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Die Autoren danken allen anderen Lab und Anlage Mitgliedern für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, und gewährt ALSAC. Die MS-Analyse wurde in der St. Jude Children Hospital Proteomics Forschungseinrichtung, teilweise unterstützt von NIH Cancer Center Support Grant P30CA021765 durchgeführt. Die Autoren danken Nisha Badders um Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
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<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex isobare Kennzeichnung Strategie, die erfolgreich in mehreren Publikationen12,13,14,32 umgesetzt worden . In diesem Protokoll können wir bis zu 10 verschiedene biologische Proteinproben in 1 Experiment analysieren. Wir können routinemäßig identifizieren und quantitate weit über 10.000 Proteine mi...

Next Generation Sequencing technologische Fortschritte führten zu einer neuen Landschaft für die Untersuchung biologischer Systeme und Krankheit beim Menschen. Dies hat eine große Anzahl von Messungen des Genoms, Transkriptom, Proteom, Metabolom und andere molekulare Systeme greifbar werden erlaubt. Massenspektrometrie (MS) ist eine der empfindlichsten Methoden in der analytischen Chemie und ihre Anwendung in der Proteomik expandierte schnell nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms. In der Proteomik haben die letzten Jahren erhebliche technische Fortschritte in der MS-basierten quantitativen Analysen, einschließlich Isobaren Kennzeichnung und multiplexing Fähigkeiten kombiniert mit umfangreichen Flüssigchromatographie, neben Instrumentierung ergab. Vorschüsse, ermöglicht schnellere und genauere Messungen mit weniger Probenmaterial erforderlich. Quantitative Proteomik geworden ein mainstream-Ansatz für die Profilerstellung Zehntausende von Proteinen und posttranslationale Modifikationen im sehr komplexen biologischen Proben1,2,3,4 , 5 , 6.
Gemultiplexten isobare Kennzeichnung Methoden wie isobare Tag für relative und absolute Quantifizierung (d.h. iTRAQ) und Tandem-Massen-Tag (TMT) MS haben stark verbesserte Probendurchsatz und stieg die Zahl der Proben, die in einem einzigen analysiert werden können 1,6,7,8zu experimentieren. Zusammen mit anderen MS-basierte Quantifizierung Methoden wie markierungsfreie Quantifizierung und stabilen Isotop Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (d.h.SILAC), das Potenzial dieser Techniken in der Proteomik ist Feld beträchtliche9 ,10,11. Die TMT-Methode erlaubt zum Beispiel 10 Proteinproben zusammen mit 10-Plex-Reagenzien 1 Experiment analysiert werden. Diese baugleichen TMT-Tags haben die gleiche allgemeine Masse, aber schweren Isotope sind differentiell verteilt auf Kohlenstoff oder Stickstoff-Atome, wodurch eine einzigartige Reporter Ion während MS/MS Zersplitterung der einzelnen Tags, damit die relative Quantifizierung zwischen den 10 Proben. Die TMT-Strategie wird routinemäßig angewendet, um Studium biologischer Signalwege, Krankheitsverlauf und zelluläre Prozesse12,13,14.
Wesentliche technische Verbesserungen haben Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Systeme, sowohl in Bezug auf LC Trennungen und MS Parameter Proteinidentifikation zu maximieren, ohne Einbußen bei der Quantifizierung Genauigkeit verbessert. Erste Dimension Trennung von Peptiden durch eine Trennung Technik mit hoher Orthogonalität, die zweite Dimension ist entscheidend bei dieser Art der Schrotflinte Proteomics-Methode, um maximale Ergebnisse20zu erreichen. Hohem pH-Wert umgekehrt Phase flüssige Chromatographie (RPLC) bietet eine bessere Leistung als herkömmliche starke Kationenaustausch-Chromatographie20tut. Bei hohem pH-Wert RPLC-mit einer zweiten Dimension der Low-pH-RPLC-kombiniert wird, sind analytische Dynamikbereich und Protein Abdeckung verbessert wiederum die Möglichkeit, den Großteil der exprimierten Proteine zu identifizieren, wenn ganze Proteom Analysen15 durchführen, ,16,17,18. Andere technische Fortschritte sind kleine Partikel in C18 (1,9 µm) und lange Spalte (~ 1 m)19erweitert. Darüber hinaus sind andere bemerkenswerten Verbesserungen neue Versionen von Massenspektrometern mit schnellen Abtastraten, verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung20und anspruchsvolle Bioinformatik Pipelines für MS Data Mining21.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die neuesten Methoden mit Änderungen zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Durchsatz, während der Fokussierung auf Qualität Kontrollmechanismen in das Experiment beinhaltet. Das Protokoll enthält Proteingewinnung und Verdauung, TMT 10-Plex Kennzeichnung, grundlegende pH-Wert sauren pH-Wert RPLC-Fraktionierung, hochauflösende MS-Detektion und MS Datenverarbeitung (Abbildung 1). Darüber hinaus realisieren wir mehrere Qualitätskontrolle Schritte zur Fehlerbehebung und Auswertung experimenteller Variation. Dieses ausführliche Protokoll soll helfen Forschern neu auf dem Gebiet routinemäßig zu identifizieren und genau quantitate Tausende von Proteinen aus einem lysate oder Gewebe.

<table><tbody><tr><td>1220 LC System</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% Hydroxylamin</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Schmetterling Portfolio Heizung</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 Spitzen</td><td>Harvard Apparatur</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Fraktionssammler</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 Harz, 1,9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Säulen</td><td>Neues Objektiv</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Reagenz mit isobarer Markierung</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Säule C18 Säule</td><td>Wasser</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Wasser</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

tiefen proteom profilierung durch isobare kennzeichnung, umfangreiche flüssigchromatographie-massenspektrometrie und softwaregestützte quantifizierung

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Viele außergewöhnliche Fortschritte wurden in der Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics, mit bestimmten technischen Fortschritte in der Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und isobare Kennzeichnung multiplexing Kapazität. Hier stellen wir eine tief-Proteomics Profilerstellungs-Protokoll, die 10-Plex Tandem Masse Tag (TMT) Kennzeichnung mit einem umfangreichen LC/LC-MS/MS-Plattform und Korrektur der Post-MS numerische Störungen genau ganze Proteome quantitate kombiniert. Dieses Protokoll enthält die folgenden Hauptschritten: Proteingewinnung und Verdauung, TMT Kennzeichnung, 2-dimensionale (2D) LC, hochauflösende Massenspektrometrie und computergestützte Datenverarbeitung. Qualitätskontrolle-Schritte sind für die Fehlersuche und Auswertung experimenteller Variation enthalten. Mehr als 10.000 Proteine in Säugetieren Proben können getrost mit diesem Protokoll quantitated. Dieses Protokoll kann auch auf die Quantifizierung der post-translationalen Modifikationen mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Diese gebündelte, robuste Methode ist ein leistungsstarkes Tool für die Proteomik-Analyse in einer Vielzahl von komplexen Proben, einschließlich Zellkultur, tierischen Geweben und menschlichen klinischen Proben.

Wir verwendet eine zuvor beschriebenen Cross-Arten Peptid-Mischung, um die Wirkung der Kompression Verhältnis in 3 großen Protokoll-Schritte, einschließlich pre-MS Fraktionierung, MS-Einstellungen und post-MS Korrektur23systematisch zu analysieren. Die pre-MS Fraktionierung wurde bewertet und optimiert mithilfe einer Kombination von grundlegenden pH RPLC und sauren pH-Wert RPLC. Für die post-MS Analyse galten nur artspezifische Peptide. Diese Störungen-Modell verwe...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, über 10.000 Proteine aus Zell- oder Gewebelysat über verschiedene medikamentöse Behandlungen, Zeitverläufe oder biologische Bedingungen hinweg zu identifizieren und genau zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen aus dem Bereich der Medizin oder Biologie zu beantworten, z. B. welche Proteine sich als Reaktion auf ein Medikament oder einen anderen biologischen Reiz verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in der Lage ist, über 70% des exprimierten Proteoms über 10 verschiedene experimentelle Bedingungen genau zu quantifizieren.Die Implikation dieser Technologie kann durch die Entdeckung potenzieller Biomarker auf die Diagnose menschlicher Krankheiten ausgeweitet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine optimale Zelllyse und Flüssigkeitsschätzung eine Schlüsselrolle bei nachgelagerten Verdauungs-, Markierungs- und Trennverfahren spielen. Um dieses Protokoll zu beginnen, besorgen Sie sich kultivierte Zellen von Interesse.Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern PBS für jede Wäsche. Kratzen Sie die gewaschenen Zellen ab und sammeln

deep-proteome-profiling-isobaric-labeling-extensive-liquid

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschreiben wir ein robustes Verfahren für die Fraktionierung von pflanzlichen Plasmamembranen in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Membranen auf der Basis einer Mischung von unmarkierten und in vivo vollständig 15 N markierten Arabidopsis thaliana Zellkulturen. Das Verfahren ist für die vergleichende Proteom-Studien angewendet, um Signalprozesse zu verstehen.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Eingehende Analysen von Krebszellproteomen erleichtern die Identifizierung neuer Wirkstoffziele und diagnostischer Biomarker. Wir beschreiben einen experimentellen Workflow zur quantitativen Analyse von (Phospho-)Proteomen in Krebszell-Subpopulationen, die aus flüssigen und festen Tumoren stammen. Dies wird durch die Kombination von zellulären Anreicherungsstrategien mit quantitativer Super-SILAC-basierter Massenspektrometrie erreicht.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Wir präsentieren ein optimiertes Tandem-Massen-Tag-Etikettierungsprotokoll (TMT), das detaillierte Informationen für jeden der folgenden Schritte enthält: Proteinextraktion, Quantifizierung, Niederschlag, Verdauung, Etikettierung, Einreichung an eine Proteomik-Anlage und Datenanalysen.

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Die kombinierte Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobarische Kennzeichnung (cPILOT) ist eine verbesserte Sample-Multiplexing-Strategie, die in der Lage ist, die Anzahl der Proben zu erhöhen, die gleichzeitig mit verfügbaren isobarischen Tags analysiert werden können. Die Integration einer Roboterplattform hat den experimentellen Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit erheblich erhöht.

Automatisiertes Sample-Multiplexing mit kombinierter Vorläufer-Isotop-Etikettierung und isobaischer Kennzeichnung (cPILOT)

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Erfahren Sie die Tiefen-Proteom-Profilierung durch isobare Kennzeichnung und LC-MS/MS zur Quantifizierung von über 10.000 Proteinen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Proteinveränderungen unter verschiedenen Bedingungen.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung (Video) | JoVE Journal

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

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