Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, über 10.000 Proteine aus Zell- oder Gewebelysat über verschiedene medikamentöse Behandlungen, Zeitverläufe oder biologische Bedingungen hinweg zu identifizieren und genau zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen aus dem Bereich der Medizin oder Biologie zu beantworten, z. B. welche Proteine sich als Reaktion auf ein Medikament oder einen anderen biologischen Reiz verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in der Lage ist, über 70% des exprimierten Proteoms über 10 verschiedene experimentelle Bedingungen genau zu quantifizieren.

Die Implikation dieser Technologie kann durch die Entdeckung potenzieller Biomarker auf die Diagnose menschlicher Krankheiten ausgeweitet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine optimale Zelllyse und Flüssigkeitsschätzung eine Schlüsselrolle bei nachgelagerten Verdauungs-, Markierungs- und Trennverfahren spielen. Um dieses Protokoll zu beginnen, besorgen Sie sich kultivierte Zellen von Interesse.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern PBS für jede Wäsche. Kratzen Sie die gewaschenen Zellen ab und sammeln Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das einen Milliliter PBS enthält. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 600 mal g und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius, bis die Zellen lysiert werden können. Sammeln und wiegen Sie das gewünschte Gewebe schnell nach der Dissektion. Danach sofort in flüssigem Stickstoff lagern und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Bereiten Sie den Lysepuffer am Tag des Versuchs vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie Lysepuffer in die gefrorene Probe so, dass das Verhältnis von Puffer zu Probe 10 zu eins beträgt und die endgültige Proteinkonzentration zwischen fünf und 10 Milligramm pro Milliliter liegt. Fügen Sie dann Glasperlen hinzu und verwenden Sie einen Mixer, um die Proben bei vier Grad Celsius und Stufe acht zu lysieren, indem Sie 30 Sekunden lang mischen und dann fünf Sekunden ruhen lassen, wobei Sie dies fünfmal wiederholen oder bis die Proben homogenisiert sind.

Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Standard-Proteinquantifizierungsassay oder einem Coomassie-gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gel mit BSA als Standard. Danach fügen Sie 100 % Acetonitril hinzu, so dass die Endkonzentration 10 % beträgt und die Lys-C-Protease ein Enzym-Substrat-Verhältnis von eins zu 100 aufweist. Zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren, damit die Proteinverdauung stattfinden kann.

Dann DTT so zugeben, dass die Endkonzentration ein Millimolar beträgt. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes fügen Sie 50 millimolare HEPES hinzu, bis die Harnstoffkonzentration in den Proben auf zwei molare verdünnt ist.

Fügen Sie jeder Probe Trypsin in einem Verhältnis von Trypsin zu Protein von eins zu 50 hinzu. Mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wird DTT zugegeben, bis die Konzentration wieder einen Millimolar beträgt, und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Fügen Sie Jodacetamid so hinzu, dass seine Endkonzentration 10 Millimolar beträgt. 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Danach wird das nicht umgesetzte Jodacetamid durch Zugabe von DTT so abgeschreckt, dass seine Endkonzentration 30 Millimolar beträgt.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Überprüfen Sie die Effizienz des Trypsinverdaus, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie anschließend jeder Probe TFA hinzu, so dass die Endkonzentration 1 % beträgtMessen Sie mit einem pH-Streifen den pH-Wert jeder Probe, um sicherzustellen, dass er zwischen zwei und drei liegt.

Fügen Sie bei Bedarf tropfenweise zusätzliches TFA hinzu, um einen inakzeptablen pH-Wert zu erreichen. Die Proben werden 10 Minuten lang bei 20.000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und laden Sie die Proben auf vorbereitete Spin-Säulen.

Zentrifugieren Sie bei 100 mal g für drei Minuten oder bis die Probe vollständig die Säule durchlaufen hat, um die Proben zu binden. Fügen Sie als Nächstes 0,5 Milliliter 0,1 % TFA zu jeder Säule hinzu. 30 Sekunden lang bei 500 mal g zentrifugieren.

Geben Sie danach 125 Mikroliter einer Lösung mit 60 % Acetonitril und 0,1 TFA in jede Säule. Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 100 mal g, um die Peptide von der Säule zu eluieren. Rekonstituieren Sie jede entsalzte Peptidprobe in 50 Mikrolitern 50 millimolaren HEPES.

Überprüfen Sie mit einem pH-Streifen, ob der pH-Wert jeder Probe zwischen sieben und acht liegt. Als nächstes lösen Sie die TMT-Reagenzien in wasserfreiem Acetonitril, fügen Sie sie den Proben hinzu und inkubieren Sie sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie danach 10 Mikroliter-Pipettenspitzen, die in Chromatographiemedien eingebettet sind, um ein Mikrogramm jeder Probe zu entsalzen und die Markierungseffizienz zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Untersuchen Sie sechs bis 10 separate Peptide, um sicherzustellen, dass unmarkierte Peptide in den markierten Proben nicht nachgewiesen werden. Mischen Sie dann etwa zwei Mikroliter jeder Probe miteinander. Verwenden Sie 10 Mikroliter-Pipettenspitzen, die in Chromatographiemedien eingebettet sind, um diese Mischung zu entsalzen.

Analysieren Sie die Proben mit LC-MS/MS, wie im Textprotokoll beschrieben. Lösen Sie zunächst die entsalzte, gepoolte, TMT-markierte Peptidprobe in 65 Mikrolitern Puffer A auf. Verwenden Sie einen pH-Streifen, um zu überprüfen, ob der pH-Wert etwa 8,0 beträgt. Wenn die Probe noch sauer ist, verwenden Sie Ammoniumhydroxid, um den pH-Wert nach Bedarf anzupassen.

Als nächstes fraktionieren Sie die Probe wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie den Fraktionssammler so ein, dass alle zwei Minuten Brüche einschließlich der Ladezeit erfasst werden. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 0,4 Milliliter pro Minute ein.

Sammle insgesamt 80 Fraktionen. Verwenden Sie dann einen Vakuumkonzentrator, um jede zweite Probe vollständig zu trocknen. Analysieren Sie mit LC-MS/MS alle 80 Fraktionen, um eine ultratiefe Proteomabdeckung zu erreichen.

Zuerst wird 1,9 Mikrometer C18-Harz in leere Säulen mit einem Innendurchmesser von 75 Mikrometern verpackt, um ein Bettvolumen von etwa 1,3 Mikrolitern zu erreichen. Wickeln Sie die Säule zwei- bis dreimal in eine Schmetterlingsportfolioheizung, um sicherzustellen, dass die gesamte Länge erwärmt wird. Kleben Sie die Säule an die Innenseite der Heizung und achten Sie darauf, dass Sie den Temperatursensor der Heizung nicht überkleben.

Dann erhitzen Sie die Säule auf 65 Grad Celsius. Lassen Sie 100 Nanogramm Peptide des Rattengehirns durch das LC-MS/MS-System laufen, um die Qualität des Systems zu beurteilen. Wiederholen Sie diese Bewertung noch ein weiteres Mal.

Laden Sie danach ca. 0,2 Mikrogramm rekonstituierter Peptide auf die Säule, während Sie 5%Puffer A fließen lassen.Eluieren Sie die Peptide von der Säule und analysieren Sie sie mit dem Massenspektrometer, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Arbeit wird eine Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex-isobaren Markierungsstrategie beschrieben. Die Effizienz der TMT-Markierung wird mit LC-MS/MS untersucht, um TMT-markierte Proben und entsprechende unmarkierte Proben zu analysieren.

Wie zu sehen ist, befindet sich der unmarkierte Peptid-Peak nur in der unmarkierten Probe, während der TMT-markierte Peptid-Peak nur in der markierten Probe zu finden ist. Als Nächstes wird die Auswirkung des MS2-Isolationsfensters auf Interferenzen ausgewertet. Alle MS2-Scans werden entweder als sauberer oder als verrauschter Scan bezeichnet.

Während die sauberen Scans y1-Ionen nur aus Lysin zeigen, zeigen die verrauschten Scans sie sowohl in Lysin als auch in Arginin. Hier wird eine repräsentative Interferenzentfernung mit E.coli-Peptiden gezeigt, die einzeln mit drei verschiedenen TMT-Reagenzien markiert wurden. Die summierten relativen Intensitäten zeigen, dass die y1-Ionen-basierte Korrektur für die TMT-basierte Quantifizierung genauer ist.

Sobald dieses Protokoll gemeistert ist, kann es in vier bis fünf Wochen abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, sicherzustellen, dass alle Schritte der Qualitätskontrolle vollständig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass der endgültige Datensatz so genau wie möglich ist. Die Anpassung dieses Verfahrens an posttranslationale Modifikationen kann andere Fragen beantworten, z. B. wie sich die Ubiquitinierung, Phosphorylierung oder Acetylierung als Reaktion auf das Fortschreiten der Krankheit oder die medikamentöse Behandlung verändert.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die Technologie den Weg für Forscher im Produktbereich, um die Proteinveränderungen in Zellen und Geweben zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man über 10.000 Proteine aus einer Säugetierzelle oder einem Säugetiergewebe identifiziert und genau quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hochdruck-UPLC und wenigen Siliziumdioxidsäulen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille getroffen werden sollten.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir begannen, das bekannte Problem der Verhältniskompression anzugehen, das bei der isobaren Markierung auftritt. Wir haben erkannt, dass eine umfangreiche Fraktionierung eine großartige Möglichkeit ist, nicht nur dieses Problem zu lindern, sondern auch die Identifizierung von Proteinen und Peptiden zu verbessern, die eine Proteomanalyse weiter verbessern und anpassen können.