Name: Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Immunpräzipitationsmethode zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in HEK-293-Zellen. Dieses Protokoll minimiert Proteinabbau und validiert Interaktionen zwischen DYKDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 effizient.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) und MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Protokoll.
1. Herstellung von Lösungen und Puffern
<ol><li>Proteinlysepuffer: Bereiten Sie den Proteinlysepuffer nach einem zuvor veröffentlichten Berichtvor 7 (Tabelle 1).</li>
	<li>Proteinlysepuffer + Proteaseinhibitor (PI): Geben Sie den Proteaseinhibitor (siehe Materialtabelle) zu dem oben vorbereiteten Puffer (Schritt 1.1). Bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Probenpuffer: Mischen Sie 900 μl 4x Laemmli Probenpuffer (siehe Materialtabelle) und 100 μl 2-Mercaptoethanol. Bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Polyoxyethylen (20)-sorbitanmonolaurat (PBS-P): Mischen Sie 1,998 l PBS und 2 mL Polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat (siehe Materialtabelle). Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>1x Tris/Glycin/SDS-Puffer: Mischen Sie 450 mL DDW und 50 mL 10x Tris/Glycin/SDS. Am Tag der Anwendung bei Raumtemperatur zubereiten.</li>
</ol>2. Transfektion von Plasmiden
<ol><li>Kultivieren Sie HEK-293-Zellen in einer 10 cm dicken, mit Kollagen beschichteten Schale zur Subkonfluenz (80 %-95 %) unter Verwendung des modifizierten Adlermediums von Dulbecco, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (10.000 Einheiten/ml Penicillin G und 10.000 μg/ml Streptomycin) enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Pro Schale werden 1-10 μg Plasmid7 für die Transfizierung vorbereitet und eine Transfektionsmischung hergestellt. 150 mM NaCl zu einem Endvolumen von 250 μl pro Schale hinzufügen. Die Mischung verwirbeln und herunterschleudern.</li>
	<li>60 μl 1 mg/ml Polyethylenimin (PEI, siehe Materialtabelle) pro Schale, gefolgt von 150 mM NaCl zu einem Endvolumen von 250 μl PEI-Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie die PEI-Lösung zur Transfektionsmischung hinzu, um eine gemischte Lösung herzustellen. Sofort wirbeln (bei Höchstgeschwindigkeit für 3-5 s, danach das Gleiche tun) und nach unten drehen.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 15-30 min inkubieren. Wechseln Sie während dieser Zeit das Medium der HEK-293-Zellen.</li>
	<li>500 μl/Schale mit gemischter Lösung über die Schale der HEK-293-Zellen streuen und über Nacht (13-14 h) inkubieren.</li>
	<li>Führen Sie am nächsten Tag einen Medienaustausch durch.</li>
</ol>3. Zelllyse und Probenvorbereitung
HINWEIS: Um einen Proteinabbau zu vermeiden, sollten die nachfolgenden Schritte so weit wie möglich ohne Konservierung oder Gefrier- und Auftauen der Probe durchgeführt werden.
<ol><li>Etwa 48 Stunden nach der Transfektion waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS, fügen Sie 500 μl/Schale Proteinlysepuffer + PI hinzu und sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und einer Pipette in einem Röhrchen mit geringer Proteinadsorption auf Eis.</li>
	<li>Alle 5 Minuten einen Vortex durchführen und die Proben 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 16.400 x g für 10 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und überführen Sie ihn in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinadsorption. Die Proben können bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Proben mit einem Proteinkonzentrationsmesskit gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Trennen Sie 200-1000 μg der gleichen Proteinmenge in jeder Probe und fügen Sie dann Proteinlysepuffer + PI hinzu, um das Gesamtvolumen auf 500-1000 μl einzustellen. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Gülle
HINWEIS: Bereiten Sie am Tag vor oder am Tag der Immunpräzipitation eine 1:1-Aufschlämmung aus Protein-G-Gel und Epitop-Tag-Affinitätsgel vor.
<ol><li>Vorbereitung eines Protein-G-Gels<ol><li>Mit einer Spitze, deren Ende abgeschnitten ist, gut mischen und dann das Protein-G-Gel (siehe Materialtabelle) so trennen, dass 20 μl Kügelchen pro Probe hergestellt werden.</li>
		<li>Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren und die Kügelchen 1 min auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>1 ml Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.1.2 hergestellten Protein-G-Gel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und den Überstand entsorgen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.1.3 dreimal.</li>
		<li>Fügen Sie dem Protein-G-Gel ein gleiches Volumen Proteinlysepuffer hinzu, um eine 1:1-Protein-G-Gel-Aufschlämmung herzustellen. Die Protein-G-Gel-Aufschlämmung kann bei 4 °C für ca. 1 Tag gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung eines Epitop-Tag-Affinitätsgels<ol><li>Mit einer Spitze, bei der das Ende abgeschnitten ist, gut rühren und dann das Epitop-Tag-Affinitätsgel (siehe Materialtabelle) so trennen, dass 10-15 μl Kügelchen pro Probe hergestellt werden.</li>
		<li>Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren und 1 min auf Eis warten, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>1 ml Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.2.2 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit die Kügelchen sich einpendeln können, und den Überstand mit einer Pipette entsorgen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2.3 zweimal.</li>
		<li>500 μl 0,1 M Glycin (pH 3,5) zu dem in Schritt 4.2.4 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Dieser Schritt wird durchgeführt, um freie Epitop-Tag-Antikörper zu entfernen. Innerhalb von 20 Minuten nach der Zugabe von Glycin bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren, die Kügelchen 1 min lang auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>500 μl Proteinlysepuffer + PI zu dem in Schritt 4.2.5 hergestellten Epitop-Tag-Affinitätsgel geben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C, legen Sie die Kügelchen 1 Minute lang auf Eis, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2.6 dreimal.</li>
		<li>Geben Sie ein gleiches Volumen Proteinlysepuffer in das Epitop-Tag-Affinitätsgel, um eine 1:1-Epitop-Tag-Affinitätsgel-Aufschlämmung herzustellen. Die Epitop-Tag-Affinitätsgel-Aufschlämmung kann bei 4 °C für ca. 1 Tag gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Preclearing mit dem Protein G-Gel und Einfangen von Proteinkomplexen mit dem Epitop-Tag-Affinitätsgel
<ol><li>Mischen Sie die in Schritt 4 hergestellte 1:1-Protein-G-Aufschlämmung mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze und geben Sie jeweils 40 μl in die Probe.</li>
	<li>Die Probe wird 1 h lang auf einem Rotator (siehe Materialtabelle) in einer Kühlkammer (4 °C) in ca. 30 s pro Zyklus gedreht.</li>
	<li>Bei 12.000 x g für 20 s bei 4 °C zentrifugieren und die Kügelchen 1 min auf Eis legen, damit sich die Kügelchen einpendeln können.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand und überführen Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinadsorption.</li>
	<li>Trennen Sie die Probe für die Eingabe von der Probe in Schritt 5.4 und überführen Sie sie in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Geben Sie 20-30 μl 1:1-Epitop-Tag-Gel-Slurry in die Probe.</li>
	<li>Auf einem Rotator ca. 30 s pro Zyklus in einer Kühlkammer (4 °C) für 2 h drehen.</li>
	<li>Dem in Schritt 5.5 vorbereiteten Input Probenpuffer zugeben, ihn auf 4x zu verdünnen, und 10 min bei 98 °C erhitzen. Der Eingang kann bei -80 °C gelagert werden. HINWEIS: Aufgrund der Möglichkeit eines Proteinabbaus durch Einfrieren und Auftauen sollten nachfolgende Schritte durchgeführt werden, ohne das Protein so weit wie möglich zu erhalten.</li>
</ol>6. Waschen und Eluieren der gefällten Proteine
<ol><li>Stellen Sie die Temperatur des Heizblocks auf 98 °C ein.</li>
	<li>Bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren und 1 min auf Eis warten, damit sich die Kügelchen einpendeln können. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
	<li>1 ml Proteinlysepuffer + PI zugeben und durch Klopfen und Invertieren mischen. Auf einem Rotator ca. 30 s pro Zyklus in einer Kühlkammer (4 °C) für 5 min drehen. Zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 30 s bei 4 °C, warten Sie 1 Minute auf Eis, damit sich die Kügelchen einpendeln können, und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 6.3 5-10 Mal.</li>
	<li>10 μl Probenpuffer werden zu der in Schritt 6.4 vorbereiteten Probe gegeben. Bei 98 °C 10 Min. kochen lassen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 5.000 x g bei 4 °C für 30 s.</li>
	<li>Setzen Sie eine Säule in ein neues Röhrchen mit geringer Proteinadsorption ein und übertragen Sie das Gel mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze auf die Säule. Eine Säule wird verwendet, um eine Kontamination des Gels zu vermeiden.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 9.730 x g für 1 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Durchfluss. Die Probe kann bei -80 °C gelagert werden. HINWEIS: Wenn der Probenabbau ein Problem darstellt, sollte die folgende Immunoblotting ohne Einfrieren durchgeführt werden.</li>
</ol>7. Immunoblottierung
HINWEIS: Immunoblotting-Verfahren basieren auf früheren Berichten 7,8.
<ol><li>Laden Sie ganze Proben auf ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE, siehe Materialtabelle). HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf Big-Well-Gele, damit die gesamte Probe übertragen werden kann. Hier kamen Gele mit 50 μL Wells zum Einsatz.</li>
	<li>Setzen Sie die Gele in die Elektrophoresekammer und fügen Sie 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer (siehe Materialtabelle) bis zum entsprechenden Volumen um die Gele herum hinzu.</li>
	<li>Elektrophorese-Gele bei 100 V und 400 mA.</li>
	<li>Auf Membranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF, siehe Materialtabelle) übertragen.</li>
	<li>Blockieren Sie die PVDF-Membranblots mit 5 % Magermilch in PBS-P für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal mit PBS-P auf einem Shaker bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten. Führen Sie danach beim Waschen den gleichen Vorgang durch.</li>
	<li>Über Nacht auf einem Shaker mit dem Primärantikörper (siehe Materialtabelle) bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal mit PBS-P.</li>
	<li>1 h lang mit dem Sekundärantikörper auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. HINWEIS: Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins nahe an der IgG-Schwerkette liegt, die ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa hat, kann ein leichter kettenspezifischer Sekundärantikörper verwendet werden, um eine Überlappung der Zielbande mit der IgG-Schwerkette zu vermeiden. In dieser Studie wurden leichtkettenspezifische Antikörper7 oder Veriblot als IP-Nachweisreagenz verwendet (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Identifizieren Sie Proteinbanden mit Peroxidase-lumineszierenden Substraten. Die Membran kann nach zweimaligem Waschen mit PBS-P in PBS gespeichert werden.</li>
	<li>10 min lang mit einer Abbeizlösung abstreifen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Dreimal waschen und mit 5 % Magermilch in PBS-P verschließen. Das Protokoll danach ist das gleiche wie in Schritt 7.6 und höher.</li>
</ol>

Protein-Interaktionsanalyse in HEK-293-Zellen mittels Co-Immunpräzipitation

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+from+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li>
<li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics%3B+current+achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li>
<li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLAG+peptide%2C+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemical+and+biophysical+methods%22%5BJournal%5D)">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li>
<li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+PPAR%CE%B1+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143(2023).</li>
<li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16%2FCtBP+transcriptional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li>
<li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li>
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<li>Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT1+controls+brown+adipose+cell+fate+and+thermogenesis+through+the+PRDM16+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex.</a> Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).</li>
<li>Bian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+establishing+a+protein-protein+interaction+network+using+tandem+affinity+purification+followed+by+mass+spectrometry+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).</li>
<li>Cristea, I. M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243(2009).</li>
<li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+%28IP%29+coupled+with+LC-MS%2FMS+identification+of+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li>
<li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).</li>
</ol>

Wir erklären, dass keiner der Autoren Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie hat.

Dieses Protokoll ist fast wie die zuvor berichteten Protokolle 5,7,14,15. Der wichtige Punkt dieses Protokolls ist, dass wir das Experiment nie vom Schritt der Zelllyse bis zum Schritt der Immunpräzipitation stoppen. Der Proteinabbau behindert den PPI-Nachweis. Ein verlängerter Zeitverlauf und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen bauen Proteine ab. Die Elektrophorese in SDS-PAGE sollte ebenfalls am selben Tag der Immunpräzipitation durchgeführt werden, um nicht nur den Proteinabbau zu minimieren, sondern auch den PPI-Nachweis zu maximieren.
In thermogenen Adipozyten wurde die Wechselwirkung zwischen EHMT1 und PRDM16 in einer früheren Studie berichtet13. Der EHMT1 - PRDM16-Komplex reguliert das Schicksal der braunen Adipozytenzellen und die Thermogenese13. EHMT1 stabilisiert PRDM16, indem es die Interaktion von PRDM16 - Amyloid-Protein-bindendem Protein (APPBP) 216 unterbricht. Diese PRDM16-Stabilisierung wird durch Cullin (CUL) 2-APPBP2 und EHMT116 reguliert.
In dieser Studie wurden HEK-293-Zellen verwendet, da HEK-293-Zellen bei der Produktion von rekombinanten Proteinen weit verbreitet sind17. Andere Zelllinien, die sich leicht mit Plasmiden transfizieren lassen, können verwendet werden, wie z. B. Cos-7-Zellen und Hela-Zellen. PEI wurde für die Transfektion verwendet, da PEI im Vergleich zur herkömmlichen Lipofektion wirtschaftlicher und einfacher ist.
Das Preclearing, die Rotation in einem Epitop-Tag-Affinitätsgel und das Waschen sind besonders wichtige Schritte bei dieser Methode. Durch das Preclearing können die Proteine entfernt werden, die unspezifisch an das Gel binden. Darüber hinaus ist die Zeit für die Rotation mit dem Epitop-Tag-Affinitätsgel wichtig, da eine übermäßige Zeit zu einem unspezifischen Proteinnachweis führen kann und unzureichende Zeit den Nachweis der Zielproteine behindern kann.
Folgende Punkte sind zu beachten. HEK-293-Zellen lösen sich leicht ab; Daher sollte bei der Vorbereitung der Proben kollagenbeschichtetes Geschirr verwendet werden. PEI-Lösung ist zytotoxisch; Daher sollte das Medium nach der Transfektion ausgetauscht werden, ohne die Zellen über einen längeren Zeitraum zu verlassen. Werden keine PPI beobachtet, kann die Menge der transfizierten Plasmide unzureichend sein und/oder die Menge des in das UZ eingebrachten Proteins gering sein. Wenn die Anzahl der Wäschen zu groß ist, können die Wechselwirkungen übersehen werden. Um diese Probleme anzugehen, kann Folgendes in Betracht gezogen werden: Erhöhung der Menge an Plasmid, die in HEK-293-Zellen eingebracht wird, Erhöhung der für IP verwendeten Proteinmenge und Verringerung der Anzahl der Waschgänge. Wenn in der letzten Wäsche zu viel Überstand übrig bleibt, läuft er außerdem aus den Vertiefungen des Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gels über. Wenn unspezifische Banden beobachtet werden, kann die Menge des Plasmids/Proteins, die für IP verwendet wird, zu hoch sein, oder die Anzahl oder Intensität der Waschungen kann unzureichend sein. Diese können durch die Reduzierung der für IP verwendeten Plasmid-/Proteinmenge, die Erhöhung der Anzahl der Waschgänge oder die Erhöhung der Waschleistung durch Erhöhung der Salzkonzentration im Waschpuffer behoben werden.
Häufig verwendete Detergenzien wie Polyoxyethylen (10)-octylphenylether können funktionell signifikante PPI stören18. Mildere Detergenzien können die Rückgewinnung funktionell wichtiger Komplexe erhöhen, während sie aufgrund einer unvollständigen Solubilisierung zu einem inakzeptablen Maß an unspezifischen Wechselwirkungen führen können. Der in der aktuellen Studie verwendete Proteinlysepuffer enthält 1 % Polyoxyethylen (10)-octylphenylether. Dieser Puffer lysiert zytoplasmatische Proteine mit hohen Mengen an Proteinen, die von den transfizierten Plasmiden überexprimiert werden. Wenn die Immunpräzipitation an Proben durchgeführt wird, die durch Trennung von Zellkernen und Zytoplasma hergestellt wurden, ist der Hintergrund im Vergleich zu Proben, die durch Ganzzelllyse hergestellt wurden, verringert, und es können klare Zielbanden identifiziert werden17. Wenn die Immunpräzipitation mit Proteinen im Zellkern durchgeführt wird, können Kernproteine unter Verwendung eines kommerziellen Kernextraktionskits oder durch Zerstörung und Entfernung von Zytoplasma mit einem salzarmen Puffer, der Detergens enthält, und anschließende Extraktion von Kernproteinen mit hohem Salzpuffer19 extrahiert werden. Die Entwicklungszeit beim Immunblotting sollte nicht nur angepasst werden, um Hintergrundeffekte zu vermeiden, sondern auch, um bestimmte Banden zu erkennen.
Diese Methode hatte mehrere Einschränkungen. Zuerst haben wir einen PPI verwendet, von dem erwartet wird, dass er erkannt wird. Zweitens, da die Expression jedes Gens von der Kombination der Plasmide abhängt, kann unzureichendes Protein erhalten werden, und die Wechselwirkung kann daher nicht nachgewiesen werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass PPIs mit dieser Methode kostengünstig und im Vergleich zur Massenspektrometrie einfach bestätigt werden können. Der PPI zwischen den verschiedenen mit Epitop-Tags fusionierten Proteinen kann auch durch die Verwendung von Affinitätsantikörpern gegen jeden Tag anstelle des Epitop-Tag-Affinitätsgels bestätigt werden. Ähnliche Immunpräzipitationsmethoden können bei anderen Zelltypen durchgeführt werden, indem ein Plasmid eingeführt wird, das ein beliebiges Protein exprimiert, das mit dem DYKDDDDK-Tag fusioniert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von endogenen Antikörpern anstelle eines Epitop-Tag-Affinitätsgels den Nachweis endogener PPIs in verschiedenen Zelltypen.

Proteine spielen eine wichtige Rolle bei allen zellulären Funktionen, einschließlich der Informationsverarbeitung, des Stoffwechsels, des Transports, der Entscheidungsfindung und der strukturellen Organisation. Proteine vermitteln ihre Funktionen, indem sie physikalisch mit anderen Molekülen interagieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind wichtig für die Vermittlung zellulärer Funktionen, wie z. B. die Vermittlung der Signaltransduktion, die Wahrnehmung der Umgebung, die Umwandlung von Energie in körperliche Bewegung, die Regulierung der Aktivität von Stoffwechsel- und Signalenzymen und die Aufrechterhaltung der zellulären Organisation1. So können PPIs verwendet werden, um unbekannte Funktionen aufzuklären2. Die Methoden zum Nachweis von PPI können in drei Typen eingeteilt werden: in vitro, in vivo und in silico. Für den In-vitro-PPI-Nachweis wurden Co-Immunpräzipitation (co-IP), Affinitätschromatographie, Tandem-Affinitätsreinigung, Proteinarrays, Phagen-Display, Proteinfragment-Komplementierung, Röntgenkristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie eingesetzt3. Unter diesen Methoden ist Co-IP aufgrund seiner Einfachheit weit verbreitet.
Der Fusionstag FLAG besteht aus acht Aminosäuren (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), einschließlich einer Enterokinase-Spaltstelle, und wurde speziell für die Immunaffinitätschromatographieentwickelt 4. DYKDDDDDK-markierte Proteine werden mit einem Anti-DYKDDDDK-Antikörper erkannt und eingefangen. Daher werden sie unter Verwendung von DYCDDDDK-bindenden Agarosekügelchen5 effizient abgebaut, um ihre Bindung an spezifische Proteine auf einfache Weise zu bestätigen. Die Immunpräzipitation kann in einer Vielzahl von Zellen durchgeführt werden, und eine breite Palette von PPIs kann mit Antikörpern gegen das interessierende Protein bestätigt werden. Immunpräzipitation und Peptidelution mit Anti-DYKDDDDK Agarosekügelchen wurden bereits berichtet5.
Hier stellen wir eine einfache Immunpräzipitationsmethode vor, bei der ein Plasmid, das für ein DYKDDDDDK-markiertes Protein kodiert, transient in HEK-293-Zellen eingeführt wird, um die Assoziation zweier Proteine von Interesse zu bestätigen. Bestimmte DYKDDDDK Antikörper können sowohl an den N-Terminus als auch an den C-Terminus der Fusionsproteine binden, andere jedoch nicht6. Um Verwechslungen zu vermeiden, sollte daher der Antikörper gewählt werden, der den Tag erkennt, der sowohl mit dem N- als auch mit dem C-Terminus fusioniert ist. Beim Einfügen eines Epitop-Tags kann es möglich sein, Konformationsänderungen im Protein zu vermeiden, indem 3 bis 12 Basenpaare zwischen dem Epitop-Tag und dem Zielprotein eingefügt werden. Die eingefügte Sequenz sollte jedoch ein Basenpaar in Vielfachen von 3 sein, um Frameshift zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH8,0)</td><td>Nippon-Gen</td><td>311-90075</td><td></td></tr><tr><td>10 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10 Well, 50 & Mikro; L</td><td>Biorad</td><td>4561034</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG, HRP-linked Whole Ab Sheep</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper M</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-93170</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I Mantel Schale 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>077-00735</td><td></td></tr><tr><td>HA-Tag (C29F4) Kaninchen mAb #3724</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatographie-Säulen</td><td>Biorad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell für Mini Precast Gele</td><td>Biorad</td><td>1658004JA</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler ANTI-FLAG M2-Antikörper, hergestellt in der Maus</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td><td>Dieses Papier</td><td>N/A</td> pcDNA3.1-HA-EHMT1 Dieses Papier N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Vektor</td><td>Dieses Papier</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethyleniminhydrochlorid</td><td>PSI</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen(10)-Octylphenylether</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen(20) Sorbitanmonolaurat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs</td><td>Cytiva</td><td>17061801</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes</td><td>eppendorf</td><td>30108442</td><td></td></tr><tr><td>ROTATOR RT-5</td><td>TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>Morinaga</td><td>0652842&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stripping Solution</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>193-16375</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td><td>Biorad</td><td>1704156B03</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo System</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Veriblot</td><td>Abcam</td><td>ab131366</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin (13E5) Kaninchen mAb&nbsp;#4970</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4970S</td><td></td></tr></tbody></table>

immunpräzipitation mit einem anti-epitop-tag-affinitätsgel zur untersuchung von protein-protein-wechselwirkungen

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) spielen eine zentrale Rolle bei biologischen Phänomenen wie der zellulären Organisation, der intrazellulären Signaltransduktion und der Transkriptionsregulation. Daher ist das Verständnis von PPIs ein wichtiger Ausgangspunkt für die weitere Untersuchung der Funktion des Zielproteins. In dieser Studie schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Bindung von zwei Zielproteinen zu bestimmen, indem wir Säugetier-Expressionsvektoren mit der Polyethylenimin-Methode in HEK-293-Zellen einführen, die Zellen in hausgemachtem Proteinlysepuffer lysieren und die Zielproteine auf einem Epitop-Tag-Affinitätsgel herunterziehen. Darüber hinaus kann der PPI zwischen den verschiedenen mit Epitop-Tags fusionierten Proteinen bestätigt werden, indem Affinitätsantikörper gegen jeden Tag anstelle des Epitop-Tag-Affinitätsgels verwendet werden. Dieses Protokoll könnte auch verwendet werden, um verschiedene PPIs, einschließlich Kernextrakte, aus anderen Zelllinien zu verifizieren. Daher kann es als Basismethode in einer Vielzahl von PPI-Experimenten verwendet werden. Proteine werden durch einen verlängerten Zeitverlauf und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen abgebaut. Daher sollten Zelllyse, Immunpräzipitation und Immunblotting so nahtlos wie möglich durchgeführt werden.

Thermogene Adipozyten, auch bekannt als braune und beige Adipozyten, haben potenzielle Wirkungen gegen Fettleibigkeit und Glukoseintoleranz. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) domänenhaltiges 16 (PRDM16) ist ein Transkriptionscofaktor, der eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der thermogenen Adipozytenidentität spielt 9,10.
EHMT1 (euchromatische Histon-Lysin-N-Methyltransferase 1), auch bekannt als GLP, katalysiert primär die Mono- und Dimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9) unter Verwendung des Cofaktors S-Adenosylmethionin11. Ein früherer Bericht deutete darauf hin, dass EHMT1 eine essentielle Methyltransferase im PRDM16-Komplex ist, die das Schicksal der thermogenen Fettzellen durch Histonmethylierung steuert12,13. Darüber hinaus haben wir bereits berichtet, dass die Expressionsniveaus von PRDM16 und EHMT1 signifikant mit denen thermogener Gene im perirenalen braunen Fettgewebe (BAT) des Menschen korrelieren, was darauf hindeutet, dass sowohl PRDM16 als auch EHMT1 eine wichtige Rolle bei der BAT-Entwicklung beim Menschen spielen8.
Um die Effizienz dieses Protokolls als Methode zur Bestätigung von PPIs zu demonstrieren, transfizierten wir DYKDDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 in HEK-293-Zellen und immunpräzipitierten DYKDDDDK-PRDM16 unter Verwendung des oben genannten Protokolls. DYKDDDDDK-markiertes PRDM16 und HA-markiertes EHMT1 wurden in die Klonierungsstellen des Säugetier-Expressionsvektors pcDNA3.1 eingefügt (siehe Materialtabelle). Die Immunoblottierung bestätigte die Assoziation zwischen DYKDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 in Gruppen, die mit DYKDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 transfiziert wurden (Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Co-Immunpräzipitation. Das Schema des Protokolls ist hier dargestellt. Die rechte Seite zeigt den Workflow des Protokolls; Die linke Seite zeigt eine grafische Darstellung der Reaktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig02.jpg"> Abbildung 2: PRDM16 assoziiert mit EHMT1. HEK-293-Zellen wurden mit dem Vektor (Negativkontrolle), DYKDDDDDK-PRDM16 oder DYKDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 transfiziert. Anschließend wurde eine Co-Immunpräzipitation mit einem DYKDDDDK Tag Affinitätsgel durchgeführt, gefolgt von Immunblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Protein-Lysepuffer 250 mL (0,22 μm Filtration, bei 4 °C lagern)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ml</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr><tr><td>1 M Tris pH 8,0</td>
			<td>12.5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>5 M NaCl</td>
			<td>7.5</td>
			<td>ca. 150 mM</td>
		</tr><tr><td>0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>Glycerin</td>
			<td>25</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Polyoxyethylen(10)-octylphenylether</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>DDW</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gesamt</td>
			<td>250</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung des Proteinlysepuffers.

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Aufklärung der Funktion von Zielproteinen, und die Co-Immunpräzipitation (co-IP) kann PPIs leicht bestätigen. Wir transfizierten transient ein Plasmid, das für ein Epitop-markiertes Protein kodiert, in HEK-293-Zellen und entwickelten eine Immunpräzipitationsmethode, um die Bindung von zwei Zielproteinen einfach zu bestätigen.

Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

Der Umfang unserer Forschung umfasst die Erforschung der molekularen Mechanismen, die die Entwicklung und Funktion von braunem und beigem Fett regulieren. Stämme, Reibungsfaktoren und Co-Faktoren wie der PRDM-16-Komplex, NFIA und der PPR-alpha-ELK-1-Komplex, die wir in jüngerer Zeit gefunden haben, steuern das Schicksal und die Funktion der braunen und beigen Fettzellen. Darüber hinaus wurde der Crosstalk von Immunzellen und Adipozyten als Schlüsselakteur identifiziert.Um die Forschung in Ihrem Fachgebiet voranzutreiben, setzen wir verschiedene Spitzentechnologien ein. Dazu gehören die quantitative PCR und die Chromatin-Immunpräzipitation zur Analyse von Veränderungen in der Genexpression sowie die sogenannte Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zur Untersuchung von Veränderungen der Protein-Protein-Interaktionen, PPIs, die mit der Differenzierung in beige Adipozyten verbunden sind. Trotz der Befolgung des Standardprotokolls für die Immunpräzipitation erweist sich der Nachweis von PPI oft als Herausforderung.Der Proteinabbau ist die Hauptursache für dieses Problem, das wir sorgfältig vermeiden müssen. Dieses Protokoll ist einfacher und kostengünstiger als andere Techniken zur Untersuchung von PPIs und beinhaltet kein Gefrierauftauen in diesem Prozess, wodurch der Proteinabbau so weit wie möglich reduziert wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Dieses Video zeigt co-immunpräzipitierte Proteinkomplexe auf einer PVDF-Membran für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse. Die reduzierten Proteine aus den Komplexen wurden mit Trypsin behandelt, um die einzelnen Proteine an den kleineren Peptiden zu spalten, dann wurden die restlichen Peptide aus der PVDF-Membran extrahiert. Das gezogene Peptid, das von beiden Proteinen in dem Komplex abgeleitet war, wurde dann getrocknet und in einer niedrigen Konzentration von Ameisensäure für die weitere...

Proteinverdau auf der Membran zur Vorbereitung von co-immunpräzipitierten Proteinen für Interaktionsstudien

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Durchführung der Co-Immunpräzipitation von GFP-markierten Wildtyp- und mutierten PD-1-Proteinen unter Verwendung von Kügelchen, die mit Anti-GFP-Antikörpern beschichtet sind. Die beadgebundenen PD-1-GFP-Proteine werden mit SHP2-Proteinen inkubiert, die mit PD-1 interagieren, was die Identifizierung spezifischer Strukturmotive in PD-1 ermöglicht, die eine entscheidende Rolle bei der SHP2-Interaktion spielen.

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Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die...

Tandem-Affinitätsreinigungsassay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.<br...

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Lernen Sie eine optimierte Immunpräzipitationsmethode zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in HEK-293-Zellen. Dieses Protokoll minimiert Proteinabbau und validiert Interaktionen zwischen DYKDDDDK-PRDM16 und HA-EHMT1 effizient.

Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

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