Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Differenzierung von Stromazellen in die adipogene Linie unter Verwendung eines linienspezifischen Proteinmarkers, des Fettsäurebindungsproteins vier, zu visualisieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Stromazellen isoliert und expandiert werden. Die Stromazellen werden dann geerntet und in Standard-In-vitro-Kulturplatten plattiert.

Nach einer mehrtägigen Inkubation werden die Zellen mit einem adipogenen Differenzierungsmedium behandelt. Die Zellen werden 14 Tage lang inkubiert, wobei das Medium regelmäßig ausgetauscht wird. Nach der Differenzierung werden die Zellen fixiert und mit Antikörpern gegen das Fettsäurebindungsprotein vier gefärbt.

Ein automatisiertes High-Content-Screening-Immunfluoreszenzmikroskop wird verwendet, um Bilder der markierten Zellen in den Mikrotiterplatten aufzunehmen. Die Differenzierung wird dann mit Hilfe einer speziellen Bildanalysesoftware quantifiziert. Im Gegensatz zu den traditionellen Methoden zur Messung der adipogenen Differenzierung unter Verwendung von Farbstoffen wie Oil Red O verwendet der in diesem Video beschriebene Assay einen Antikörper gegen das linienspezifische Protein, das Fettsäurebindungsprotein vier, um die adipogene Differenzierung zu bestätigen.

Dabei quantifiziert diese Methode Veränderungen in der Genexpression, die einer adipogenen Differenzierung entsprechen. Dieser Assay ist in der Lage, eine Fülle von Informationen zu liefern, einschließlich des Prozentsatzes differenzierter Zellen, der Intensität des Fluoreszenzsignals pro Zelle und Veränderungen in der Zellmorphologie. Die Fähigkeit, mehrere Merkmale zu analysieren, ermöglicht die Identifizierung potenzieller subtiler Veränderungen in der Differenzierung als Reaktion auf verschiedene Behandlungen.

Dieser Assay verfügt außerdem über eine hohe Durchzugsfähigkeit, was ihn ideal für Anwendungen mit hohem Durchzug macht. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem ASC-Medium, d. h. DMEM/F-12-Basalmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, GlutaMAX und Antibiotika. Pipettieren Sie in eine 96-Well-Kulturplatte mit 5000 Zellen pro Well.

Für jeden Spender werden acht Brunnen benötigt. Vier Vertiefungen erhalten ein Kontrollmedium, während der Rest ein Differenzierungsmedium erhält. Jede vierte Vertiefung jeder Behandlung dient einer Knotenprimärkontrolle.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad und befeuchten Sie sie vier Tage lang mit einer atmosphärischen Bedingung von 5 % Kohlendioxid. Dies dient dazu, dass die Zellen in jeder Vertiefung zusammenwachsen können. Nehmen Sie am vierten Tag die Platten aus dem Inkubator.

Entfernen Sie die Hälfte des Mediums aus jeder Vertiefung. Fügen Sie das gleiche Volumen des vollständigen ASC-Mediums oder des adipogenen Differenzierungsmediums hinzu, das mit Insulin, Isobutylmethylxanthin, Dexamethason und Indomethason ergänzt wird. Inkubationsplatte bei 37 Grad, befeuchtet mit einer atmosphärischen Bedingung von 5 % Kohlendioxid.

Der Zeitraum, der für eine ausreichende Differenzierung erforderlich ist, beträgt 14 Tage. Füllen Sie während dieser Zeit das Medium auf, indem Sie alle zwei bis drei Tage einen Medienwechsel durchführen. Nehmen Sie nach der Differenzierung die Platten aus dem Inkubator.

Pipettieren Sie vorsichtig alle Medien aus jeder Vertiefung. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von eiskaltem Methanol. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie das Methanol und waschen Sie es mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Blockieren Sie durch Zugabe von 0,25 % Kaseinblocker. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie das Kasein und waschen Sie es mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung. Bereiten Sie eine primäre Antikörpermischung vor, indem Sie den Anti-FABP4-Antikörper 200-fach in Antikörperverdünnungspuffer verdünnen. Fügen Sie allen Vertiefungen eine Mischung hinzu, mit Ausnahme derjenigen, die als primäre Knotensteuerung reserviert sind.

Geben Sie stattdessen Antikörperverdünnungspuffer in diese Vertiefungen. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung waschen.

Herausnehmen, frische Tris-gepufferte Kochsalzlösung hinzufügen und fünf Minuten auf der Wippe inkubieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal. Bereiten Sie den zweiten Reantikörpermix vor, indem Sie den zweiten Antikörper Anti-Rabbit Alexa 488 200-fach in Antikörperverdünnungspuffer verdünnen.

DAPI, das Zellkerne markiert, wird in einer abschließenden Verdünnung von eins bis 2000 zugegeben. Gib die Mischung in alle Vertiefungen und umwickle die Platte mit Folie, um ein Photobleichen zu verhindern. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation die Zellen mit TBS waschen und zwei weitere 15-minütige Wäschen auf der Wippe. Entfernen Sie den gesamten Puffer aus den Vertiefungen und fügen Sie Lagerpuffer hinzu, der mit 0,4 Milligramm Thiomersal pro Milliliter ergänzt wird, um das Bakterienwachstum zu verhindern. Für die Abbildung dieses Bioassays wird eine High-Content-Screening-Maschine verwendet, die mit einem automatisierten Tisch, Fokussierungsobjektiven und Filtern ausgestattet ist.

Überprüfen Sie, ob die richtigen Filter vorhanden sind. Reinigen Sie den Boden der Platte, um die beste Qualität zu erzielen. Legen Sie die Platte mit A1 in der oberen linken Ecke in die Bühne ein.

Notieren Sie mit dem Plattenerfassungsassistenten wichtige Informationen über das Experiment, z. B. Plattennummer, Vergrößerung, Datum, Versuchsbedingungen und Beschriftungsdetails. Wählen Sie den Typ der verwendeten Mikrotiterplatte aus. Die Nutzer können die Bohrlöcher und die Anzahl der zu erwerbenden Standorte auswählen.

Wählen Sie alle Wells aus, die abgebildet werden sollen, indem Sie das Raster markieren. Verschieben Sie die Bühne in die hellste Vertiefung. Durch die Auswahl des hellsten Wells wird sichergestellt, dass alle Bilder mit Pixelgrauwerten aufgenommen werden, die in einem linearen Bereich liegen und daher direkt proportional zur Färbeintensität sind.

Wenn dieser Schritt nicht ausgeführt wird, können Bilder, die in helleren Vertiefungen aufgenommen wurden, übersättigt sein. Wählen Sie die entsprechenden Kanalkombinationen, die Belichtungszeit und die Z-Offset-Parameter für das Experiment aus. Die Filter, die für die Bildgebung von FABP4 und DAPI verwendet werden, entsprechen den spezifischen Markierungen, die zur Visualisierung der Färbung verwendet werden.

Zur Visualisierung von FABP4 wurde Alexa 488 verwendet, die bei 480 Nanometern anregt und bei 560 Nanometern emittiert. Und der DAPI-Farbstoff, der bei 360 Nanometern anregt und bei 460 Nanometern emittiert, wurde zur Visualisierung von Zellkernen verwendet. Bei Platten, die mit Oil Red O beschriftet waren, wurden Fetttröpfchen mit hellem, vom Kraftstoff durchgelassenem Licht sichtbar gemacht.

Und auch die Ölrot-O-Markierung wurde mit Fluoreszenz sichtbar gemacht, da sie bei 575 Nanometern anregt und bei 630 Nanometern emittiert. Wenn die gesamte Einrichtung abgeschlossen ist, kann der biologische Assay erworben werden. Das Bild wird automatisch auf dem Online-Server gespeichert, um einen einfachen Fernzugriff auf die Bilder zu ermöglichen.

Auf den gesamten Satz von Bildern, die auf dem Online-Server gespeichert sind, kann mit dem Remote-Desktop-Programm zugegriffen werden. Die Bilder können dann mit der MetaXpress-Software analysiert werden. Die Anwendung zur Zellbewertung ermöglicht es dem Benutzer, eine Wellenlänge für die Detektion aller Kerne in einem Feld auszuwählen, wie in diesem Fall DAPI.

Nachfolgende Wellenlängen können verwendet werden, um einen positiven Marker entweder im Zellkern, im Zytoplasma oder an beiden Zellstellen zu detektieren. Das Fettsäurebindungsprotein vier oder FABP4 ist ein Marker für die adipogene Abstammung. Die Expression von FABP4 ist im Zellkern und im Zytoplasma differenzierter Adipozyten lokalisiert.

In diesem biologischen Assay analysieren wir die FABP4-Expression mit Hilfe des Zell-Scoring-Moduls. Zuerst werden Zellkerne über den DAPI-Kanal detektiert, mit benutzerdefinierten Parametern für Größe und Signalintensität über dem Hintergrund. Erkennen Sie das FABP4-Signal über den Fuß-C-Kanal und benutzerdefinierte Parameter für Größe und Signalintensität über dem Hintergrund.

In diesem biologischen Assay wurden mit Öl-Red-O-markierte Fetttröpfchen, die im 560-Nanometer-Bereich fluoreszieren, mit einem MetaXpress-Dosenmodul, Transflour, analysiert. Dieser Analysealgorithmus erkennt Gesamtzellen mit DAPI-markierten Zellkernen, die die vom Benutzer festgelegten Kriterien für Zellgröße und Färbeintensität erfüllen. Der Anwender gibt auch die Größe und Intensität der Vertiefungen an, die in diesem Fall Fetttröpfchen in unmittelbarer Nähe der Zellkerne erkennen.

Informationen über die Größe der Fetttröpfchen, die Färbeintensität und die Anzahl pro Zelle werden vom Transflour-Assay protokolliert. Es ist wichtig zu beachten, dass das Oil Red O-Etikett aus einigen Zellen austrat oder sich auflöste, was möglicherweise das wahre Ausmaß der stattfindenden Differenzierung einschränkt und verwirrt. Repräsentative Bilder von frühen und späten Passage-, Kontroll- und differenzierten Zellen, die mit DAPI, einer Kernfärbung und FABP4 markiert sind, werden neben Merge- und Segmentierungsbildern gezeigt.

Die Segmentierungsbilder zeigen differenzierte Zellen mit einer grünen Überlagerung und undifferenzierte Zellen mit einer roten Überlagerung. Der Prozentsatz der Zellen, die FABP4 exprimieren, wurde als Maß für das adipogene Differenzierungspotenzial verwendet. Ein signifikanter Anstieg der FABP4-exprimierenden Zellen wurde bei adipogener Differenzierung in Zellen der frühen und späten Passage beobachtet.

Zellen der frühen Passage zeigten eine signifikant stärkere Steigerung der Differenzierung als Zellen der späten Passage. Die repräsentativen Bilder von DAPI und Oil Red O werden neben Merge- und Segmentierungsbildern angezeigt. Die Segmentierungsbilder zeigen alle Zellkerne mit grüner Überlagerung und Öl-Rot-O-gefärbte Lipidtröpfchen mit einer roten Überlagerung.

Die Fläche der Öl-Rot-O-Färbung pro Zelle wurde als Maß für das adipogene Differenzierungspotenzial verwendet. Eine signifikante Zunahme der Ölrot-O-Färbefläche wurde bei adipogener Differenzierung beobachtet. Zellen der frühen Passage zeigten eine größere Fläche mit Ölrot-O-Färbung pro Zelle im Vergleich zu Zellen der späten Passage.

Ein Western Blot wurde durchgeführt, um das FABP4-Proteinexpressionsniveau von differenzierten ASCs in der frühen und späten Passage zu analysieren. Die semiquantitative Analyse der optischen Dichte der FABP4-Banden als Verhältnis zur Kontrolle der Gesamtproteinbeladung zeigte, dass die FABP4-Immunmarkierung in der frühen Passage und in geringerem Maße in differenzierten Zellen in der späten Passage signifikant erhöht war. Wenn Sie sich dieses Video ansehen, sollten Sie ein Verständnis dafür gewonnen haben, wie man Stammzellen in adipogene Abstammungslinien unterscheidet, wie man Immunfluoreszenzfärbung mit dem adipogenen Gen-spezifischen Marker, dem Fettsäurebindungsprotein vier, durchführt und schließlich, wie man alle relevanten morphologischen Merkmale von Zellen abbildet und analysiert, die immunpositiv für das Fettsäurebindungsprotein vier sind.

Ich hoffe, Sie finden dieses Video nützlich für Ihre Recherche.