Effiziente Isolierung von fett-abgeleiteten Stammzellen und Adipozyten aus schweine-fetthaltigem Gewebe
May 26th, 2026
Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch >90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.
Ziel dieser Forschung ist es, Zellen effizient und schnell aus Fettgewebe zu isolieren. Die traditionelle Verdauung ist zeitaufwendig und kann überverdauen. Unser Enzym- und mechanisches Wellenmaß bietet eine sanfte Dispersion und verkürzt die Isolationszeit.
Zu Beginn geben Sie ein Stück rückwärts subkutanes Fettgewebe eines eingeschläferten Schweins in eine Kulturschale. Schneiden Sie entlang der natürlichen Ebene zwischen Fettgewebe und Dermis, um eine vollständige zwei bis drei Millimeter dicke ULB-Schicht zu erhalten. Spüle das ULB einmal in eiskalter, steriler Kochsalzlösung.
Nachdem Sie eine sterile Kulturschale zerrissen haben, wiegen Sie das Gewebe in der sterilen Schale auf einer vorsterilisierten Bilanz. Für je 1,8 Gramm Gewebe gib 10 Milliliter eiskalten D-Hank-Puffer hinzu und halte das Gewebe vollständig untergetaucht. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um alle sichtbaren Blutgefäße aus dem Gewebe zu erkennen und zu entfernen.
Entfernen Sie jegliches Bindegewebe und fibrotische Bestandteile. Entsorgen Sie die entfernten Materialien in ausgewiesene Biogefährdenbehälter. Spülen Sie das Gewebe in D-Hanks Puffer ab, um Rückstände von Blut und Ablagerungen zu entfernen.
Wiegen Sie das Gewebe in der sterilen Kulturschale nach dem Zerreißen auf einer vorsterilisierten Bilanz. Übertragen Sie 1,8 Gramm der Spülgewebefragmente in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 800 Mikroliter A-Typ Gewebe-Dissoziationspuffer in den Tubus ein.
Verwenden Sie eine sterile Augenschere, um das Gewebe im Röhrchen in Stücke von etwa ein bis zwei Kubikmillimetern zu zerkleinern. Übertragen Sie das Hackfleischgewebe zusammen mit dem umgebenden Puffer in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Gib 200 Mikroliter A-Typ Gewebedissoziationsmittel in den Schlauch.
Drehen und schütteln Sie das Rohr vorsichtig dreimal von Hand, um den Inhalt zu vermischen. Stellen Sie sicher, dass die Fettfragmente vollständig in die Dissoziationslösung eingebettet sind. Überprüfe, ob der Schlauchdeckel fest geschlossen ist.
Setzen Sie das Rohr in ein Metallbad bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie es fünf bis zehn Minuten. Übertragen Sie das teilweise verdaute Fettgewebe im Puffer in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das für das mechanische Dissoziationssystem vorgesehen ist. Führe das voreingestellte Programm für Fettgewebe aus, um mechanische Dissoziation mit einer 200-Hertz-Sinuswelle durchzuführen.
Sammeln Sie die Zellsuspension auf und leiten Sie sie durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Gib fünf Milliliter vorgekühlte D-Hank-Lösung bei vier Grad Celsius zum Sieb hinzu. Spülen Sie das Sieb zweimal mit der D-Hank-Lösung ab.
Zentrifugiere die gefilterte Zellsuspension bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipettette, um die überlagernde Lipidschicht abzusaugen und zu entsorgen, während ein Milliliter Puffer zum Schutz der Adipozytenschicht übrig bleibt. Sammeln Sie die zweite Schicht mit den Adipozyten, ohne die dritte und vierte Schicht zu stören.
Aspirieren und die dritte Schicht entsorgen. Fügen Sie einen Milliliter D.Hanks Puffer zum unteren Pellet hinzu, das den stromalen Gefäßbruch (SVF) enthält. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig im Puffer wieder aufhängen, um eine Zellkonzentration von zwei bis fünf mal zehn mit einer Potenz von sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Bereiten Sie die SVF-Zellsuspension in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr vor. Lassen Sie die Suspension bis zur Nutzung auf Eis. Fügen Sie 10 Mikroliter SVF-Zellsuspension und 10 Mikroliter 0,4 % Trypanblau-Lösung in ein steriles 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu.
Pipette vorsichtig dreimal hoch und runter. Übertragen Sie 10 Mikroliter der gefärbten Zellmischung auf einen Zählobjektträger, der für den automatischen Zellzähler geeignet ist. Überprüfen Sie, dass die Probe die Kammer vollständig ausfüllt, ohne überzulaufen.
Stecken Sie den Zählträger in den automatischen Zellzähler. Wählen Sie den Trypan-Blau-Assay-Typ und passen Sie bei Bedarf den Zellkonzentrationsbereich an. Drücken Sie die Zählung, um die automatische Zellzählung zu starten.
Überwachen Sie die Bilder der Zählkammer und beobachten Sie die automatische Unterscheidung von lebenden und toten Zellen. Notieren Sie den Zellviabilitätsprozentsatz und die Gesamtzahl der auf dem Instrumentenbildschirm angezeigten lebensfähigen Zellen. Führen Sie für jede Probe drei unabhängige Messungen durch.
Berechnen Sie die mittlere Lebensfähigkeit und die Zellausbeute pro Gramm Fettgewebe. Bereiten Sie eine Färbelösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Huksed und einem mikromolaren BODIPY in D.Hank's vor. Inkubieren Sie die isolierten Adipozyten in der Färbelösung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie ein selbstgebautes, adipozytenfreundliches Glassystem für Objektträger, das für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet ist. Das selbstgemachte, adipozytenfreundliche Montagesystem ermöglichte eine gleichmäßige Verteilung intakter Adipozyten für klare Bildgebung. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, die übge, mehrschichtige Anordnungen erzeugten, zeigten die extrahierten Adipozyten eine intakte Struktur und normale Morphologie.
Die Überlebensrate der mit der mechanischen Dissoziation gewonnenen Adipozyten war im Vergleich zur traditionellen enzymatischen Hydrolysemethode signifikant höher. Die gereinigten und kultivierten, fett-abgeleiteten Stammzellen wiesen eine einheitliche fibroblastähnliche Morphologie auf, mit verlängerten, spindelförmigen Zellen, die geordnet angeordnet waren. Die meisten Zellen blieben unverfärbt, was auf Lebensfähigkeit hindeutet, während nur ein kleiner Teil blau gefärbt war, was tote Zellen darstellt.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die isolierten Zellmerkmale im Fettdepot zu vergleichen. Die isolierten SVFs aus dem Protokoll können für den Aufbau von Organoiden und die Reinigung von Fettstammzellen verwendet werden. Zukünftige Studien könnten die Isolationsmethode weiter optimieren, wobei die Fettgewebe-Variationen in der extrazellulären Matrix über das Depot hinweg berücksichtigt werden.
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Overview
This article presents a rapid and efficient protocol for isolating adipose-derived stem cells (ADSCs) from adipose tissue using a combination of enzymatic digestion and mechanical wave-based dissociation. The method, exemplified by the SoniConvert system, significantly reduces processing time, improves cell viability, and yields high-quality single-cell suspensions suitable for downstream applications in regenerative medicine and research.
Key Study Components
Area of Science
- Regenerative medicine
- Cell biology
- Stem cell isolation
Background
- ADSCs are valuable for tissue repair, disease modeling, and cell therapy due to their multipotency and immunomodulatory properties.
- Traditional isolation methods are time-consuming (1–3 hours), yield low cell viability (<70%), and suffer from batch variability.
- Efficient, reproducible isolation of high-viability ADSCs is critical for research and clinical translation.
- Mechanical wave-based dissociation offers a potential solution to these limitations.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a rapid, gentle, and reproducible protocol for isolating ADSCs from adipose tissue.
- To compare the new method's efficiency and cell viability with traditional enzymatic digestion protocols.
- To provide a platform compatible with various downstream applications, including organoid construction and cell culture.
Methods Used
- Harvesting and preparation of subcutaneous adipose tissue from euthanized pigs.
- Enzymatic digestion using a tissue-specific dissociation buffer and agent.
- Mechanical dissociation via a preset program using a 200 Hz sinusoidal wave (SoniConvert system).
- Filtration, centrifugation, and separation of stromal vascular fraction (SVF) and adipocytes.
- Cell viability assessment using trypan blue staining and automated cell counting.
- Fluorescence staining and microscopy to assess adipocyte morphology and integrity.
Main Results
- The core isolation process is completed in approximately 30 minutes, representing a >90% reduction in processing time compared to conventional methods.
- Cell viability of isolated ADSCs is 80–95%, significantly higher than traditional protocols.
- The method yields intact, morphologically normal adipocytes and uniform, viable ADSCs.
- Single-cell suspensions are suitable for primary culture, flow cytometry, cytotoxicity assays, and organoid construction.
Conclusions
- The combined enzymatic and mechanical wave-based protocol enables rapid, high-viability isolation of ADSCs.
- This approach reduces variability and preserves cell integrity, facilitating adipose tissue research and clinical applications.
- Future optimization may further improve isolation efficiency across different adipose depots.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Porcine Adipose Tissue Harvesting and Preparation
1:36
Dissociation of Adipose Tissue for Cell Isolation
3:08
Isolation of Adipocyte and Stromal Vascular Fractions (SVF)
4:21
Analysis of SVF Cell Suspension and Adipocyte Samples
6:16
Results
7:23
Conclusion
