Effiziente Isolierung von fett-abgeleiteten Stammzellen und Adipozyten aus schweine-fetthaltigem Gewebe
26. Mai 2026
Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch >90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.
Ziel dieser Forschung ist es, Zellen effizient und schnell aus Fettgewebe zu isolieren. Die traditionelle Verdauung ist zeitaufwendig und kann überverdauen. Unser Enzym- und mechanisches Wellenmaß bietet eine sanfte Dispersion und verkürzt die Isolationszeit.
Zu Beginn geben Sie ein Stück rückwärts subkutanes Fettgewebe eines eingeschläferten Schweins in eine Kulturschale. Schneiden Sie entlang der natürlichen Ebene zwischen Fettgewebe und Dermis, um eine vollständige zwei bis drei Millimeter dicke ULB-Schicht zu erhalten. Spüle das ULB einmal in eiskalter, steriler Kochsalzlösung.
Nachdem Sie eine sterile Kulturschale zerrissen haben, wiegen Sie das Gewebe in der sterilen Schale auf einer vorsterilisierten Bilanz. Für je 1,8 Gramm Gewebe gib 10 Milliliter eiskalten D-Hank-Puffer hinzu und halte das Gewebe vollständig untergetaucht. Verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um alle sichtbaren Blutgefäße aus dem Gewebe zu erkennen und zu entfernen.
Entfernen Sie jegliches Bindegewebe und fibrotische Bestandteile. Entsorgen Sie die entfernten Materialien in ausgewiesene Biogefährdenbehälter. Spülen Sie das Gewebe in D-Hanks Puffer ab, um Rückstände von Blut und Ablagerungen zu entfernen.
Wiegen Sie das Gewebe in der sterilen Kulturschale nach dem Zerreißen auf einer vorsterilisierten Bilanz. Übertragen Sie 1,8 Gramm der Spülgewebefragmente in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 800 Mikroliter A-Typ Gewebe-Dissoziationspuffer in den Tubus ein.
Verwenden Sie eine sterile Augenschere, um das Gewebe im Röhrchen in Stücke von etwa ein bis zwei Kubikmillimetern zu zerkleinern. Übertragen Sie das Hackfleischgewebe zusammen mit dem umgebenden Puffer in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Gib 200 Mikroliter A-Typ Gewebedissoziationsmittel in den Schlauch.
Drehen und schütteln Sie das Rohr vorsichtig dreimal von Hand, um den Inhalt zu vermischen. Stellen Sie sicher, dass die Fettfragmente vollständig in die Dissoziationslösung eingebettet sind. Überprüfe, ob der Schlauchdeckel fest geschlossen ist.
Setzen Sie das Rohr in ein Metallbad bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie es fünf bis zehn Minuten. Übertragen Sie das teilweise verdaute Fettgewebe im Puffer in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das für das mechanische Dissoziationssystem vorgesehen ist. Führe das voreingestellte Programm für Fettgewebe aus, um mechanische Dissoziation mit einer 200-Hertz-Sinuswelle durchzuführen.
Sammeln Sie die Zellsuspension auf und leiten Sie sie durch ein 200-Mikrometer-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Gib fünf Milliliter vorgekühlte D-Hank-Lösung bei vier Grad Celsius zum Sieb hinzu. Spülen Sie das Sieb zweimal mit der D-Hank-Lösung ab.
Zentrifugiere die gefilterte Zellsuspension bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipettette, um die überlagernde Lipidschicht abzusaugen und zu entsorgen, während ein Milliliter Puffer zum Schutz der Adipozytenschicht übrig bleibt. Sammeln Sie die zweite Schicht mit den Adipozyten, ohne die dritte und vierte Schicht zu stören.
Aspirieren und die dritte Schicht entsorgen. Fügen Sie einen Milliliter D.Hanks Puffer zum unteren Pellet hinzu, das den stromalen Gefäßbruch (SVF) enthält. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig im Puffer wieder aufhängen, um eine Zellkonzentration von zwei bis fünf mal zehn mit einer Potenz von sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Bereiten Sie die SVF-Zellsuspension in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr vor. Lassen Sie die Suspension bis zur Nutzung auf Eis. Fügen Sie 10 Mikroliter SVF-Zellsuspension und 10 Mikroliter 0,4 % Trypanblau-Lösung in ein steriles 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzu.
Pipette vorsichtig dreimal hoch und runter. Übertragen Sie 10 Mikroliter der gefärbten Zellmischung auf einen Zählobjektträger, der für den automatischen Zellzähler geeignet ist. Überprüfen Sie, dass die Probe die Kammer vollständig ausfüllt, ohne überzulaufen.
Stecken Sie den Zählträger in den automatischen Zellzähler. Wählen Sie den Trypan-Blau-Assay-Typ und passen Sie bei Bedarf den Zellkonzentrationsbereich an. Drücken Sie die Zählung, um die automatische Zellzählung zu starten.
Überwachen Sie die Bilder der Zählkammer und beobachten Sie die automatische Unterscheidung von lebenden und toten Zellen. Notieren Sie den Zellviabilitätsprozentsatz und die Gesamtzahl der auf dem Instrumentenbildschirm angezeigten lebensfähigen Zellen. Führen Sie für jede Probe drei unabhängige Messungen durch.
Berechnen Sie die mittlere Lebensfähigkeit und die Zellausbeute pro Gramm Fettgewebe. Bereiten Sie eine Färbelösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Huksed und einem mikromolaren BODIPY in D.Hank's vor. Inkubieren Sie die isolierten Adipozyten in der Färbelösung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie ein selbstgebautes, adipozytenfreundliches Glassystem für Objektträger, das für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet ist. Das selbstgemachte, adipozytenfreundliche Montagesystem ermöglichte eine gleichmäßige Verteilung intakter Adipozyten für klare Bildgebung. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, die übge, mehrschichtige Anordnungen erzeugten, zeigten die extrahierten Adipozyten eine intakte Struktur und normale Morphologie.
Die Überlebensrate der mit der mechanischen Dissoziation gewonnenen Adipozyten war im Vergleich zur traditionellen enzymatischen Hydrolysemethode signifikant höher. Die gereinigten und kultivierten, fett-abgeleiteten Stammzellen wiesen eine einheitliche fibroblastähnliche Morphologie auf, mit verlängerten, spindelförmigen Zellen, die geordnet angeordnet waren. Die meisten Zellen blieben unverfärbt, was auf Lebensfähigkeit hindeutet, während nur ein kleiner Teil blau gefärbt war, was tote Zellen darstellt.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die isolierten Zellmerkmale im Fettdepot zu vergleichen. Die isolierten SVFs aus dem Protokoll können für den Aufbau von Organoiden und die Reinigung von Fettstammzellen verwendet werden. Zukünftige Studien könnten die Isolationsmethode weiter optimieren, wobei die Fettgewebe-Variationen in der extrazellulären Matrix über das Depot hinweg berücksichtigt werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein schnelles und effizientes Protokoll zur Isolierung von aus Fettgewebe stammenden Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe mithilfe einer Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischer, wellenbasiierter Dissoziation vor. Die Methode, veranschaulicht durch das SoniConvert-System, verkürzt die Verarbeitungszeit erheblich, verbessert die Zellviabilität und liefert hochwertige Einzelzell-Suspensionen, die für nachgeschaltete Anwendungen in der regenerativen Medizin und Forschung geeignet sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerative Medizin
- Zellbiologie
- Isolierung von Stammzellen
Hintergrund
- ADSCs sind aufgrund ihrer Multipotenz und immunmodulierenden Eigenschaften wertvoll für die Gewebereparatur, die Krankheitsmodellierung und die Zelltherapie.
- Herkömmliche Isolationsmethoden sind zeitaufwändig (1–3 Stunden), erzielen eine geringe Zellviabilität (<70 %) und weisen Batch-Variabilität auf.
- Eine effiziente und reproduzierbare Isolierung von ADSCs mit hoher Viabilität ist entscheidend für Forschung und klinische Anwendung.
- Die durch mechanische Wellen basierende Dissoziation bietet eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Demonstration eines schnellen, schonenden und reproduzierbaren Protokolls zur Isolierung von ADSCs aus Fettgewebe.
- Vergleich der Effizienz und Zellviabilität der neuen Methode mit herkömmlichen enzymatischen Verdauungsprotokollen.
- Bereitstellung einer Plattform, die mit verschiedenen nachgeschalteten Anwendungen kompatibel ist, einschließlich der Organoide-Zusammensetzung und Zellkultur.
Verwendete Methoden
- Gewinnung und Aufbereitung von subkutanem Fettgewebe aus euthanasierten Schweinen.
- Enzymatische Verdauung unter Verwendung eines gewebespezifischen Dissoziationspuffers und -agens.
- Mechanische Dissoziation über ein voreingestelltes Programm unter Anwendung einer sinusförmigen Welle mit 200 Hz (SoniConvert-System).
- Filtration, Zentrifugation und Trennung der stromavaskulären Fraktion (SVF) und der Adipozyten.
- Bestimmung der Zellviabilität mittels Trypanblaufärbung und automatischer Zellzählung.
- Fluoreszenzfärbung und Mikroskopie zur Beurteilung der Adipozyten-Morphologie und -Integrität.
Hauptergebnisse
- Der Kernisolationsprozess wird in etwa 30 Minuten abgeschlossen und bedeutet eine >90 % kürzere Bearbeitungszeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Die Zellviabilität der isolierten ADSCs liegt bei 80–95 %, deutlich höher als bei traditionellen Protokollen.
- Die Methode liefert intakte, morphologisch normale Adipozyten sowie gleichmäßige, vitale ADSCs.
- Die Einzelzell-Suspensionen eignen sich für die Primärkultur, Durchflusszytometrie, Zytotoxizitätsassays und die Konstruktion von Organoiden.
Schlussfolgerungen
- Das kombinierte enzymatische und mechanische, wellenbasierte Protokoll ermöglicht eine schnelle Isolierung von ADSCs mit hoher Vitalität.
- Dieser Ansatz verringert die Variabilität und erhält die Zellintegrität, wodurch die Forschung an Fettgewebe sowie klinische Anwendungen erleichtert werden.
- Zukünftige Optimierungen könnten die Isolations-Effizienz in verschiedenen Fettdepots weiter verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die effiziente und reproduzierbare Isolierung von fettgewebsstämmigen Stammzellen (ADSCs) stellt einen entscheidenden Wendepunkt für die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und Zelltherapie-Prozesse dar. Die schnelle Einzelzellpräparation mit hoher Vitalität durch das SoniConvert-System behebt langjährige Engpässe bei der Zellbeschaffung, der Vitalität und der Batch-Variabilität und wirkt sich direkt auf die Zuverlässigkeit nachgeschalteter Assays sowie auf die Kontinuität translationsorientierter Forschung aus. Diese Fähigkeit ermöglicht eine präzisere frühe Entdeckung und unterstützt fundierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung von Portfoliovorhaben.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die schnelle Erzeugung von hochwertigen ADSCs zur hypothesengeleiteten Untersuchung von Signalwegen.
- Reduziert die biologische Variabilität und unterstützt die funktionelle Zielvalidierung sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für die Frühphasen-Portfoliotriage durch die Standardisierung der Zellqualität der Eingangspopulation.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert Einzelzell-Suspensionen, die mit Primärkulturen, Durchflusszytometrie und Zytotoxizitätsassays kompatibel sind.
- Unterstützt die Reproduzierbarkeit von Assays und quantitative Auswertung, indem Zellschäden und Batch-Effekte minimiert werden.
- Erleichtert die skalierbare Herstellung validierter biologischer Systeme für Verbindungsscreening-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Liefert Zellen mit hoher Vitalität, die für die Organoid-Konstruktion und die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse geeignet sind.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem das Zellphänotyp und die Zellfunktion erhalten bleiben.
- Verringert das Risiko eines biologischen Versagens in späteren Stadien, indem eine konsistente Zellqualität über verschiedene Studien hinweg sichergestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich an der Schnittstelle zwischen Gewebebeschaffung und früher Entdeckungsforschung und unterstützt Arbeitsabläufe von der Target-Validierung bis hin zur Assay-Entwicklung und translationellen Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die robuste Überprüfung der Nullhypothese und die Aufklärung von Signalwegen durch hochwertige ADSCs.
- Screening: Stellt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte, vitale Einzelzell-Suspensionen sicher.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen der Vitalität und Ausbeute für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht Anschlussfähigkeit an die Konstruktion von Organoiden und Krankheitsmodellen für eine kontinuierliche präklinische Entwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine reproduzierbare und skalierbare Plattform zur Zellisolierung für vielfältige Forschungs- und Entwicklungsprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in zellbasierten Studien.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Isolierung, verbessert die Reproduzierbarkeit und reduziert die Verarbeitungsdauer um über 90 %.
- Strategischer Wert: Ermöglicht bessere Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalwirtschaftlichkeit, indem Batch-Variabilität und Zellverlust minimiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung regenerativer und zelltherapeutischer Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Gewebe, enzymatischer Verdauung und mechanischen Dissoziationsprotokollen.
- Benötigt Zugang zum SoniConvert-System, automatisierten Zellzählern und der Infrastruktur für Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Gewebepräparation und der Beurteilung der Zellviabilität voraus.
- Kann Anpassungen erfordern, um depot-spezifische Unterschiede in der extrazellulären Matrix von Fettgewebe zu berücksichtigen.
- Hängt von konsistenter Reagenzqualität und instrumenteller Kalibrierung für reproduzierbare Ergebnisse ab.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
Porcine Adipose Tissue Harvesting and Preparation
1:36
Dissociation of Adipose Tissue for Cell Isolation
3:08
Isolation of Adipocyte and Stromal Vascular Fractions (SVF)
4:21
Analysis of SVF Cell Suspension and Adipocyte Samples
6:16
Results
7:23
Conclusion
