Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Speichel von Mäusen nach der Pilocarpin-Stimulation genau und reproduzierbar zu sammeln und zu messen. Die Messung der Speichelproduktion bei Nagetieren ist ein anspruchsvolles Verfahren und anfällig für eine hohe Variabilität. Diese Methode ist einfach und kann am selben Tier zu mehreren Zeitpunkten der gesamten Studie wiederholt werden.

Diese Methode kann nicht nur das Volumen des produzierten Speichels messen, sondern auch verwendet werden, um den Speichel für die weitere Analyse bioaktiver Moleküle zu sammeln, die im Speichel ausgeschieden werden können. Letztendlich wird dies bei der Untersuchung des Sjögren-Syndroms, der Speicheldrüsenfibrose oder der Speicheldrüsenregeneration in Nagetiermodellsystemen von großem Nutzen sein. Lassen Sie für dieses Verfahren Pilocarpinhydrochlorid-Aliquots vorbereiten und einfrieren, die nicht älter als drei Monate sind.

Auftaute Aliquots dürfen nicht wieder eingefroren werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von 0,6-ml-Mikrofugenröhrchen. Stanzen Sie vorsichtig mit einer erhitzten 18-Gauge-Nadel ein kleines Loch in den Boden der Rohre.

Stelle eine Röhre pro Maus her. Setzen Sie diese Röhrchen dann in 2-ml-Röhrchen ein. Sterilität ist kein Problem.

Schneiden Sie anschließend mit aseptischen Methoden zylindrische Absorptiontupfer in zwei Zentimeter Länge. Schneiden Sie dann jedes zwei Zentimeter große Stück diagonal ab, um zwei konisch geformte Tupfer zu erhalten. Legen Sie je einen konischen Tupfer in die vorbereiteten Mikrofugenröhrchen.

Wiegen Sie dann jedes 0,6-ml-Röhrchen mit dem Trockentupfer. Setzen Sie nun die Mäuse für die Studie in einen neuen, sauberen Käfig um. Sie können zusammen untergebracht werden.

Geben Sie ihnen in den nächsten zwei Stunden Eiswasser, aber kein Futter. Kurz vor Ablauf der zweistündigen Frist bereiten Sie die funktionierende Pilocarpin-Lösung vor, indem Sie ein Aliquot von 100x Stamm in steriler Kochsalzlösung auf 1x verdünnen. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und halten Sie die Lösung auf Eis.

Wiegen Sie zunächst jede Maus, um die Dosis zu berechnen. Dann betäuben Sie die Mäuse mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin plus Xylazin. Wenn eine Maus nach vier Minuten nicht betäubt ist, passen Sie die Dosierung an.

Tragen Sie nun eine thalmologische Salbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Geben Sie als Nächstes die berechnete Dosis von Pilocarpin intraperitoneal an die Maus ab und stellen Sie den Timer auf zwei Minuten ein. Führen Sie die Maus während dieses zweiminütigen Intervalls in ein 50-ml-Rückhalteröhrchen ein, sodass nur der Kopf und die Ohren herausragen.

Positionieren Sie den Schlauch in einem Winkel von 45 Grad, mit dem Kopf der Maus nach unten und der Bauchfläche nach oben. Sichern Sie dann den Schlauch mit Klebeband. Gleich nach den zwei Minuten heben Sie den Unterkiefer an, um den Mund zu öffnen, und führen Sie eine geschlossene Präparierzange vorsichtig ein bis zwei Millimeter in den Mund ein.

Stellen Sie sicher, dass die Zunge auf dem oberen Arm der Pinzette aufliegt. Mit der anderen Hand halten Sie den vorgewogenen Trockentupfer mit einer feinen Pinzette nahe an seiner konischen Spitze. Schieben Sie dann die konische Spitze des Tupfers vorsichtig in den Mund und ziehen Sie die Pinzette zurück, während Sie die Spitze des Tupfers in der Mundhöhle belassen.

Fassen und drehen Sie nun den Tupfer, bis er den maximalen Kontakt mit dem Mund hat und nicht herausfällt. Das breite Ende des Tupfers muss außerhalb des Mundes bleiben. Halten Sie den Tupfer fünfzehn Minuten lang in dieser Position.

Drehen Sie den Tupfer nach einer Viertelstunde vorsichtig, um den nicht absorbierten Speichel aufzufangen. Übertragen Sie dann den speichelgetränkten Tupfer in das 0,6-ml-Mikrofuge-Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen und setzen Sie es in das 2-ml-Röhrchen ein, das auf Eis gestellt wird.

Bringen Sie nun die Maus zurück in einen Bergungskäfig. Geben Sie Diätgel oder angefeuchtete Futterpellets in den Käfig, damit er rehydriert werden kann. Eine subkutane Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung kann ebenfalls verabreicht werden, um die Genesung zu beschleunigen.

Nachdem Sie alle Speichelproben entnommen haben, wiegen Sie sie, um die Masse des gesammelten Speichels zu bestimmen. Schneiden Sie die Kappen von den 2-ml-Röhrchen mit dem kleineren Röhrchen mit der Speichelprobe ab, geben Sie sie in eine gekühlte Zentrifuge und schleudern Sie sie zwei Minuten lang bei 7.500 g und vier Grad Celsius herunter. Der Speichel sammelt sich in den beiden ml-Röhrchen.

Messen Sie dann das Volumen der Proben mit einer Mikropipette. Die Speichelproduktion wurde bei elf Wochen alten C57-schwarzen sechs weiblichen Mäusen mit der beschriebenen Methode gemessen. Bei einer Dosis von 1 Mikrogramm Pilocarpin pro Gramm Körpergewicht zeigten einige der Mäuse Anzeichen von Stress.

Es gab eine gute Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Pilocarpin und Speichelproduktion. Es gab auch eine signifikante Übereinstimmung zwischen Speichelgewicht und -volumen. Mit der beschriebenen Technik wurden Unterschiede im Speichel von Stamm zu Stamm gefunden.

Der 129 S6-Stamm von Mäusen produzierte die geringste Menge an Speichel. In einem Experiment zum Nachweis einer Unterfunktion der Speicheldrüsen wurden Lipopolysaccharide injiziert, um eine angeborene Immunantwort zu aktivieren. Während der Reaktion produzierten die Mäuse weniger Speichel.

Eine weitere Taktik, um eine Unterfunktion der Speicheldrüsen zu induzieren, bestand darin, den Mäusen ein adjuvans Alaun plus Anti-Ro52-Antikörper zu injizieren. Die Fahrzeugsteuerung wurde nur mit Alaun behandelt. Dies war auch mit der beschriebenen Technik nachweisbar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Speichelproduktion bei Mäusen genau und reproduzierbar messen können. Einmal gemeistert, können zehn Mäuse in etwa zweieinhalb Stunden beurteilt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, bei jedem Schritt äußerst konsequent zu sein, von den intraperitonealen Injektionen über das Platzieren des Tupfers bis hin zur Verwaltung der Zeitintervalle für jeden Schritt.

Vergessen Sie nicht, dass Pilocarpinhydrochlorid auf das Herz-Kreislauf-System wirkt und Bradykardie und Hypotonie verursacht. Daher sollte die Injektion von Pilocarpin in die Mäuse mit Vorsicht erfolgen.