Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Methode ist es, die Rolle von Multikopie-Plasmiden bei der Evolution von Antibiotikaresistenzen zu testen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z.B. die Rolle von Multikopie-Plasmiden bei der Evolution bakterieller Innovationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nur grundlegende molekularbiologische Methoden und ein einfaches Versuchsdesign erfordert.

Es ist wirklich cool. Zuerst wird der E-Coli-Stamm MG1655 konstruiert, der das Antikörperresistenzgen im Chromosom des Lambda-Phagen in der Gleichungsseite ATTB trägt. Zu diesem Zweck werden die 500 Basen-Paralong-Regionen auf beiden Seiten des ATTB-Geländes PCR-amplifiziert.

Anschließend wird das Antibiotikaresistenz-Gen durch PCR amplifiziert. Verwenden Sie dann eine isotherme Assemblierung bei 50 Grad Celsius für 30 Minuten, um die Homologieregionen mit dem PCR-Produkt zu fusionieren. Nach dem isothermen Zusammenbau wird ein Mikroliter des Produkts auf 40 Mikroliter elektrokompetente MG1655-Zellen in eine zwei Millimeter große Küvette überführt.

Dann elektropopolieren Sie die Zellen bei 4 Grad Celsius und 2,5 Kilovolt. Nach der Elektroporation überführen Sie die Zellen in einen Milliliter LB-Bouillon mit 0,2%Arabinose. Pipettieren Sie dann die LB-Brühe mit den Zellen in ein Mikrofuge-Röhrchen.

Schütteln Sie die Tube zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius intensiv. Nach zwei Stunden 100 Mikroliter der Kultur auf die LB-Agarplatte auffüllen, ergänzt mit Antibiotika. Drehen Sie dann die restlichen Zellen nach unten.

Und suspendieren Sie das Pellet wieder in 100 Mikrolitern frischer LB-Brühe. Plattieren Sie diese Zellen wieder auf eine andere LB-Agarplatte. Anschließend werden die Platten über Nacht bei 42 Grad Celsius inkubiert.

Am nächsten Tag werden die Klone durch PCR amplifiziert, um das Konstrukt mit den externen Primern ybhC extern und ybhB extern zu verifizieren. Bestätigen Sie dann die Amplikongröße durch die Agaroseschalenelektrophorese. Führen Sie parallel dazu eine DNA-Sequenzierung durch, um die Sequenz des eingefügten Gens zu überprüfen.

Um den Stamm so zu konstruieren, dass er das Antikörperresistenzgen im Multikopie-Plasmid trägt, wird zunächst das Antibiotikaresistenzgen blaTEM-1 durch PCR amplifiziert. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, phosphorylieren Sie das amplifizierte Produkt mit T4-Polynukleotidkinase. Als nächstes verwenden Sie die High-Fidelity-Polymerase und die Oligonukleotide PBAD FINV und PBAD RINV, um das PBAD-Plasmidrückgrat zu PCR-amplifizieren.

Ligatieren Sie dann die beiden PCR-Fragmente mit T4-Ligase. Als nächstes elektroporieren Sie 40 Mikroliter DH5-alpha-Zellen mit 1 Mikroliter des Ligaturprodukts. Wählen Sie dann das geeignete Antibiotikum für das Antibiotikaresistenzgen und das Plasmidrückgrat auf Agarplatten aus.

Führen Sie dann die Plasmidextraktion mit einem DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Führen Sie dann eine Sanger-Sequenzierung des interessierenden Resistenzgens durch, um vor den Evolutionsexperimenten zu bestätigen, dass keine möglichen Mutationen vorhanden sind. Nach der Verifizierung der Sequenz wird das Plasmid im E-coli-Stamm MG1655 elektroporiert, um schließlich das Plasmid zu erhalten, das den MG1655-Stamm trägt.

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Konstruktion der Modellsystemstämme und die Rekonstruktion der Mutationen, die während der experimentellen Evolution beobachtet wurden. Streichen Sie zunächst die interessierenden MG1655-Stämme auf die LB-Agarplatten. Geben Sie dann 200 Mikroliter LB-Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Als nächstes inokulieren Sie 48 isolierte Kolonien jedes Stammes in einzelnen Vertiefungen der Platte. Nach der Inokulation wird die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Auch hier werden zwei Mikroliter der Kultur aus jeder Vertiefung mit der Gründerpopulation auf eine neue 96-Well-Platte mit 198 Mikrolitern LB-Medium in einzelnen Vertiefungen geimpft.

Damit beginnt das evolutionäre Rettungsexperiment. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 200 Umdrehungen pro Minute für 20 Stunden. Verdoppeln Sie jeden Tag die Konzentration des Antibiotikums gegenüber der des Vortages.

Am nächsten Tag 2 Mikroliter der jeweiligen Kultur auf eine frische 96-Well-Platte umfüllen und täglich weitermachen. Zeichnen Sie den Messwert der optischen Dichte in einem Abstand von 600 Nanometern von den einzelnen Vertiefungen auf einem Plattenlesegerät auf. Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die experimentelle Evolution und deren zunehmende Konzentrationen von Antibiotika.

Die Änderungsrate der Antibiotikakonzentrationen ist einer der Parameter, die modifiziert werden können, um die Entwicklung der Antibiotikaresistenz zu fördern. Auch hier wird die Platte auf einem Shaker bei 200 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für 20 Stunden inkubiert. Messen Sie dann jeden Tag die optische Dichte bei 600 Nanometern für jede überlebende Population auf dem Plattenlesegerät.

Frieren Sie die Populationen regelmäßig alle drei bis fünf Tage ein. Extrahieren Sie die gesamte DNA aus den entwickelten Populationen und den Klonen aus verschiedenen Stämmen und Behandlungen. Messen Sie anschließend die Absorptionsverhältnisse bei 260:280 und 260:230 Nanometern auf dem Spektralphotometer, um die Qualität der DNA zu bestimmen.

Verwenden Sie dann einen fluoreszierenden DNA-Bindungsfarbstoff und bestätigen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie die Fluoreszenz auf dem Plattenleser messen. Unterziehen Sie die DNA zusätzlich einer Agarose-Gelelektrophorese, um zu bestätigen, dass kein DNA-Abbau oder keine RNA-Kontamination vorliegt. Führen Sie dann eine tiefe DNA-Sequenzierung mit Proben durch, die aus ganzen Populationen und einzelnen Klonen stammen, um die genetischen Grundlagen der Antibiotikaresistenz zu untersuchen.

Diese Studie ist ein Beispiel für die möglichen Ergebnisse des Versuchssystems mit drei E-Coli-Stämmen. Bei diesen Stämmen handelt es sich um E-coli MG1655, MG1655, die das Resistenzgen im Chromosom MG1655 resA tragen, und MG1655, die das Resistenzgen im Multikopie-Plasmid MG1655 pRESA tragen. Bei den verwendeten Antibiotika handelt es sich um Ceftazidim und Meropenem.

Dieses linke Bild zeigt die Überlebenskurven unter steigenden Konzentrationen von Ceftazidim. Aus der Grafik geht hervor, dass die Untergruppe der Population des Stammes MG1655 pRESA in der Lage ist, über 14 Tage hinaus zu wachsen, selbst wenn sich die Ceftazidim-Konzentration jeden Tag verdoppelt. Im Gegenteil, die anderen Stämme überleben nicht länger als 8 Tage, wenn sie ähnlichen Konzentrationen von Ceftazidim ausgesetzt sind.

Dieselben Stämme zeigen jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Überlebenszeit, wenn sie einer ähnlichen Konzentration eines anderen Antibiotikums, Meropenem, ausgesetzt sind. Alle drei Stämme überleben nur zwischen 6 und 8 Tagen, wenn sie Meropenem ausgesetzt sind. Dies deutet darauf hin, dass das Vorhandensein des Gens resA im Multikopie-Plasmid die Evolution der Resistenz gegen Ceftazidim potenziert, nicht aber gegen Meropenem.

Sobald es gemeistert ist, kann das komplette Versuchsprotokoll in wenigen Wochen durchgeführt werden, wenn es richtig gemacht wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Rolle von Multikopie-Plasmiden bei der Evolution von Innovationen bei Bakterien untersuchen können.