Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine zufällige Mutantenbibliothek für eine gegebene Ziel-DNA-Sequenz zu erstellen und Mutanten durch semiquantitative funktionelle Selektion schnell zu identifizieren und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid mit einem Coli, wobei ein Replikationsursprung, der die Zielsequenz enthält, in den Mutatorstamm transformiert wird. Nach dem Plattieren und Inkubieren der Zellen über Nacht werden sie geerntet und das Zielplasmid isoliert, um die Mutantenbibliothek zu erhalten, die Mutantenbibliothek wird dann in einen Auslesestamm umgewandelt, um die Mutationen im zweiten Teil des Protokolls zu charakterisieren. Eine Gradientenwachstumsplatte wird konstruiert und Bakterienkulturen des ausgelesenen Stammes werden in eine separate Petrischale mit weichem Fett geladen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Bakterienkulturen mit einem Stempel auf den Gradienten zu übertragen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen im Phänotypprofil einer gegebenen Zielsequenz durch Unterschiede im Wachstum auf einem Wirkstoffgradienten zeigen. Dieses Video stellt eine Methode zur gerichteten Evolution von Proteinen in E-coli vor.

Dieser Prozess ahmt die natürliche Evolution bei der Generierung zufälliger Nährstoffbibliotheken nach, gefolgt von einer Selektion, die diese Vielfalt einschränkt. Auf diese Weise verbessert es unsere Fähigkeit, neue biochemische Aktivitäten für industrielle oder biomedizinische Zwecke zu generieren. Dieses Verfahren besteht aus zwei Komponenten, der Generierung einer zufälligen Mutantenbibliothek und der funktionellen Selektion zur Erzielung von Gain-of-Function-Mutationen. Dieses Verfahren wird von Jennifer Allen, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert.

Vor dem Start dieses Protokolls dachten elektrokompetente JS 200-Zellen, die eine Low-Fidelity-Variante der DNA-Polymerase eins oder einen Low-Fidelity-Pol exprimieren, der zuvor wie im schriftlichen Protokoll beschrieben präpariert worden war, diese Zellen enthalten ein temperaturempfindliches Allel des ersten Pols, so dass die Aktivität des Pols 1 mit niedriger Genauigkeit bei 37 Grad Celsius vorherrscht. bauen. Ein Zielplasmid, das ein Coli enthält, wobei die Zielsequenz neben dem Replikationsursprung kloniert ist, ein Pol mit geringer Genauigkeit, der Coli initiiert, ein Plasmid-Replikation. Dadurch werden Mutationen eingeführt, um die Mutagenese einzuleiten.

Kombinieren Sie 40 Mikroliter elektrokompetenter Zellen und zwischen 30 und 250 Nanogramm Zielplasma-DNA in einem Abstand von zwei Millimetern. Elektroporation vet pulse, das Gemisch im Elektro bei 1800 Volt. Überprüfen Sie die Zeitkonstante oder TC, um einheitliche Bedingungen für jede Probe zu gewährleisten.

Im Idealfall beträgt TC fünf bis sechs Millisekunden. Lassen Sie das Zell-DNA-Gemisch in einem Milliliter LB-Brühe 40 Minuten lang bei 37 bis Celsius und Schütteln bei 250 U/min zurückweichen. Man besorge sich eine 100 Millimeter LV große Agro-Petrischale, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt sei und geeignete Antibiotika enthalte, um für beide Plasmide auszuwählen. Plattiere die gewonnenen Zellen in einer geeigneten Verdünnung, um eine rasennahe Konzentration zu erhalten, die als eine ausgeprägte, aber unzählbare Anzahl von Kolonien definiert ist, wie in diesem Beispiel gezeigt.

Nach der Inkubation über Nacht die Bakterienkolonien der Petrischalen mit LB-Brühe ernten. Isolieren Sie das Plasmid, die DNA aus den geernteten Zellen, das resultierende Plasmid. Die DNA bildet die zufällige Mutantenbibliothek.

Führen Sie einen Restriktionsverdau durch, indem Sie die Plasmidbibliothek mit einem Restriktionsenzym schneiden, das sowohl das Zielplasmid als auch den Pol linearisiert. Ein Plasmid führt ein analytisches Aro-Gel auf die isolierte Plasmid-DNA aus, um Qualität und Quantität zu bestätigen. Sobald die Plasmide verifiziert sind, verdauen Sie ein Mikrogramm der Bibliothek mit einem Restriktionsenzym, das das Pol-Eins-Plasmid linearisiert, aber das Zielplasmid nicht schneidet.

Nachdem der Restriktionsverdau abgeschlossen ist, bereinigen Sie die Bibliothek mit einem DNA-Aufreinigungskit. Transformieren Sie schließlich die saubere Bibliothek in einen auslesbaren Stamm, um die Mutationen zu charakterisieren. Um mit der Vorbereitung des Farbverlaufs zu beginnen, markieren Sie 10 Bahnen, die gleichmäßig über eine Kante des Bodens der quadratischen Petrischale verteilt sind.

Stellen Sie die Schüssel so schräg, dass der untere markierte Rand sieben Millimeter erhöht ist. Gießen Sie 25 Milliliter warmes lb-Agar, gut gemischt mit einer geeigneten Konzentration des Auswahlmittels, in die Schrägschale. Dies ist die unterste Ebene des Verlaufs.

Stellen Sie sicher, dass der LB-Agar die Petrischale so bedeckt, dass das erhöhte markierte Ende der Schale etwa einen Millimeter LB-Agar enthält und der abgesenkte Teil etwa acht Millimeter enthält. Decken Sie die Platte zur Belüftung mit dem Deckel KU ab und lassen Sie den Agri 10 bis 15 Minuten fest werden. Nachdem die untere Schicht des LB-Agars ausgehärtet ist, stellen Sie die Schale auf eine ebene Fläche.

Gießen Sie anschließend 25 Milliliter warmes lb-Agar ohne das Auswahlmittel, um die erste Agri-Oberfläche zu überlagern, und achten Sie darauf, dass die gesamte untere Schicht bedeckt ist. Decken Sie die Platte zur Belüftung mit dem Deckel KU ab und lassen Sie den Agri 10 bis 15 Minuten lang aushärten, um die Stempelübertragung der Bakterien durchzuführen. Zuerst werden Bakterienkulturen des ausgelesenen Stammes entnommen und so verdünnt, dass sie identische Zelldichten mit einer optischen Dichte bei 600 Nanometern von weniger als 1,0 aufweisen.

Als nächstes geben Sie zwei Milliliter flüssigen Weichagar, der auf 42 Grad Celsius ausgeglichen ist, auf den Boden einer 100 Millimeter großen runden Petrischale, pipettieren Sie 40 Mikroliter der Bakterienkultur in die weiche und mischen Sie sie dann, indem Sie die Platte schütteln. Beschichten Sie die lange Kante des Objektträgers mit der weicheren Mischung. Richten Sie dann den beschichteten Rand des Objektträgers an der unteren Markierung auf der Gradientenschale aus.

Berühren Sie den Objektträger mit der Oberfläche des Agars. Eine sanfte Berührung reicht aus, um ein Band des weichen Agars auf die Gradientenoberfläche zu übertragen. Die Rutsche wird dann zur Reinigung und Wiederverwendung beiseite gelegt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang. Die verbleibenden Proben, experimentelle Kontrollen, sollten auf jeder Gradientenschale enthalten sein. Wenn mehrere Gradienten durchgeführt werden, inkubieren Sie die Gradientenschale über Nacht bei 37 Grad Celsius, und die Inkubationstemperaturen können für verschiedene Bakterienstämme unterschiedlich sein, aber über Nacht bei 37 Grad Celsius ist in der Regel ausreichend für sichtbares Wachstum.

Abschließend wird das Zellwachstum abgebildet und analysiert, wie es im schriftlichen Protokoll beschrieben ist. Gezeigt. Hier sind Bilder eines ausgelesenen Stammes, der entweder mit unstummgeschaltetem P-G-F-U-V oder einer PG FPUV-Mutantenbibliothek transformiert wurde. Vier Runden von Mutagenese-, dunklen oder dunklen Kolonien deuten auf Plasmide hin, die GFP-inaktivierende Mutationen enthalten.

Diese Zahl stellt die Häufigkeit von Mutationen in der neutralen Sequenz des Zielplasmids in Intervallen von 100 Basenpaaren dar. Beachten Sie, dass die Mutationen über die gesamte Plasmidsequenz auftreten, jedoch mit der höchsten Häufigkeit, die dem Ursprung der Replikation am nächsten liegt. Hier wird das Wachstum der Mutanten gegen einen Wirkstoffgradienten gezeigt.

Der Abstand, der zum oberen Rand des Gradienten hin gewachsen ist, deutet auf ein differentielles Arzneimittelresistenzprofil zwischen den Mutanten hin. In diesem Beispiel wurden Plasmidbibliotheken der humanen oxidativen Demethylase ABH zwei unter Verwendung von Wirkstoffauswahlgradienten auf Mutanten mit erhöhter Resistenz gegen Methylmethansulfonat untersucht. Zwei. Solche Bibliotheken, die zwei und vier Iterationen des Mutageneseprotokolls repräsentieren, werden im Vergleich zum elterlichen Wildtyp und dem leeren Vektor gezeigt.

Die weiße Linie markiert die Schwelle, ab der einzelne mutierte Kolonien isoliert wurden. Für eine weitere phänotypische Analyse werden Beta-Lactamase-Mutanten, R 1 64 H und E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, die zuvor mit Hilfe von Low Fidelity P one Mutagenese und Astri und m Selektion identifiziert wurden, auf einem 0,4 Mikrogramm pro Milliliter und einem vier Mikrogramm pro Milliliter gezeigt. Der Cefotaxim-Gradientenschutz gegen Cefotaxim ist ein Hinweis auf eine Beta-Lactamase-Aktivität mit erweitertem Spektrum.

Beachten Sie, dass das Wildtyp-Beta-Lactamase-Enzym keinen Schutz gegenüber Zellen bietet, die einen leeren Vektor exprimieren. Daher stellen diese Mutanten die Anpassung oder die Evolution einer neuen biochemischen Aktivität dar. Hier haben wir eine leistungsstarke Kombination aus Mutagenese und funktioneller Selektion für diese Generation neuer biochemischer Aktivitäten vorgestellt.

Eine funktionelle Selektion kann entweder durch Arzneimittelauswahl oder durch genetische Komplementierung erreicht werden und macht sich unsere Fähigkeit zunutze, eine große genetische Vielfalt zu erzeugen. Die Pathogenese muss möglicherweise auf eine bestimmte Sequenz beschränkt werden, um bereits vorhandene Proteinaktivitäten zu optimieren oder um eine ortsgerichtete Pathogenese zu ermöglichen. Dies kann leicht durch Klonen erfolgen.

Darüber hinaus kann die Mutagenese von einer funktionellen Selektion entkoppelt werden, um Signaturangriffe oder Mutations-Footprints zu erhalten.