Name: Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Vorsprung-Kräften durch Podosomen mittels Rasterkraftmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Adhäsionsmechanismen und mechanischer Eigenschaften.

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Die Autoren sind dankbar, Anna Labernadie, Guillaume Charrière und Patrick Delobelle für ihren ersten Beitrag zu dieser Arbeit und Matthieu Sanchez und Françoise Viala für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt. Diese Arbeit wurde von l ' Agence Nationale De La Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation Pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planen Krebs, Fondation Toulouse Krebs und Human Frontier Science Program (RGP0035/2016) unterstützt.

1. Vorbereitung des Formvar-beschichtete Netze
<ol><li>Reinigen Sie Raster-Elektronen-Mikroskopie mit Aceton und trocknen Sie sie auf Filterpapier. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger mit reinem Ethanol, mit einem Objektiv-Papier wischen Sie ab und entfernen Sie den Staub mit einem Gebläse.</li>
	<li>Stellen Sie eine Folie mit Ethanol gereinigt Glas senkrecht in den Trichter eines Film-Casting-Gerätes mit einer Lösung von Formvar im unteren Teil. Decken Sie die Spitze des Trichters.</li>
	<li>Pumpen Sie Formvar Lösung (0,5 % Ethylen Paraquatdichlorid) 100 mL mit Zerstäuber Birne, bis die zwei Drittel der Folie erreicht.</li>
	<li>Halten Sie die Folie in die Lösung für 1 min.</li>
	<li>Öffnen Sie das Ventil des Geräts, um die Formvar-Lösung in einem stetigen Strom abtropfen lassen. Ein Volumenstrom von 10 bis 15 mL/s wird einen Formvar Film von 30-80 nm ergeben. Die Dicke der Folie richtet sich nach der Konzentration der Lösung Formvar und die Entwässerung. Hinweis: Die Entwässerung-Rate kann durch entlüften der Druck über das Ventil Luft-Out durch langsames Öffnen des Ventils gesteuert werden. Je schneller die Entwässerung, je dicker die Folie. In der Praxis weil es schwierig ist, vorherzusagen, die Schichtdicke von Formvar Strömungsgeschwindigkeit, wir bereiten mehrere Chargen Formvar Filme und steuern ihre Stärke von AFM (siehe Schritt2).</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie aus der Kammer und trocknen Sie es vorsichtig auf Filterpapier, flüssigen Formvar zu entfernen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Rechteck 20 x 50 mm aus dem Formvar Film mit einer Rasierklinge.</li>
	<li>Ein Becherglas mit destilliertem Wasser füllen und langsam Tauchen die Folie senkrecht ins Wasser schweben aus dem Film: der Film sollte auf der Wasseroberfläche schweben.</li>
	<li>Ort trocken Aceton gereinigt Raster auf dem Film, glänzende stellen.</li>
	<li>Legen Sie eine Runde Glas-Deckglas (Ø 12 mm) auf ein paar der Netze. Das Deckglas wird dazu dienen, die Schichtdicke zu messen (siehe Schritt2).</li>
	<li>Decken Sie einen Objektträger mit einem weißen Aufkleber geändert, um es zu passen. Tauchen Sie die Folie vertikal an der Grenze des schwimmenden Formvar Films, bis der ganze Film auf die Folie haftet. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Folie mit Filterpapier und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
</ol>2. Messung der Schichtdicke
<ol><li>Schneiden Sie Formvar um das Deckglas mit Pinzette, um es von der Folie lösen.</li>
	<li>Markieren Sie die Position des Rasters unter dem Deckglas mit einem Stift.</li>
	<li>Schneiden Sie die Formvar rund um den markierten Gitter um es von dem Deckglas zu lösen. Daher werden ein Loch in die verbleibenden Formvar Blatt, die es erlauben Ihnen, um die Schichtdicke zu messen. Decken Sie das Deckglas mit PBS zu und legen Sie es auf einen Glasobjektträger am Mikroskop.</li>
	<li>Montieren Sie ein Silizium-Nitrid-Freischwinger auf dem AFM Glasblock, sicherstellen, dass die goldenen Streifen, die Spitze der Feder nicht gedeckt ist. Hinweis: Die Empfindlichkeit und die Federkonstante des nadelträgers sollte vorher mit PBS-Puffer kalibriert haben.</li>
	<li>Montieren Sie den Glasblock auf das AFM-Modul, und platzieren Sie das Modul auf das Mikroskop.</li>
	<li>Die Beobachtung Kammer legen Sie Formvar beschichteten deckgläschen auf und bedecken Sie es mit 500 µL PBS.</li>
	<li>Scannen Sie die Grenze des Lochs in der Formvar Blatt mit AFM in Kontakt-Modus und einem 0,5 nN Kraft-Sollwert.</li>
	<li>Verwenden Sie die Glasoberfläche Deckglas als Referenz für Höhenmessungen und bewerten die Formvar Dicke wie die Höhe des Querschnitts (mindestens 10 Messungen pro Formvar Charge).</li>
</ol>3. Aussaat Zellen auf Gittern
<ol><li>Unter einer sterilen Haube legte einen Streifen (12 x 3 mm) doppelseitiges Klebeband auf einem deckgläschen.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Raster Formvar beschichtet mit einer Pinzette und legte es kopfüber auf den Klebestreifen (nur der Rand des Rasters muss das Band befestigt werden). Der Formvar Film muss das Deckglas konfrontiert.</li>
	<li>Setzen Sie dieses Gerät in einer Kultur gut.</li>
	<li>Platzieren Sie ein 10 µL Tröpfchen von RPMI ohne FCS mit 104 Makrophagen differenziert aus menschlichen Monozyten16. Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, berühren Sie das Gitter mit der Pipettenspitze beschädigen die Formvar Beschichtung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 30 min (37 ° C, 5 % CO2) Zellen haften zu lassen.</li>
	<li>Füllen Sie den Brunnen mit 2 mL RPMI mit 10 % FCS.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gerät für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 Zellen vor AFM Beobachtung halten zu lassen.</li>
</ol>(4) Topographie Messungen der Podosome-induzierten Verformungen
<ol><li>Ein Glasboden Petrischale zwei Streifen verdoppelt doppelseitigen Klebeband aufkleben. Hinweis: Der Abstand zwischen den beiden Streifen sollte kleiner als der Durchmesser des Rasters.</li>
	<li>Trennen Sie sorgfältig das Raster mit Makrophagen vom Klebeband überzogen.</li>
	<li>Umdrehen Sie die Gitter um die Zellen mit Blick auf das Glas und kleben Sie das Netz zwischen den zwei Klebestreifen.</li>
	<li>Fix das Raster mit zwei neu verdoppelt doppelseitigen Klebstoff Streifen: Raster wird somit zwischen zwei Klebestreifen, verlassen den zentralen Bereich des Rasters für die AFM-Spitze eingeklemmt werden. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Gitter gut befestigt und nicht verdreht; ansonsten der AFM Cantilever nähern sich die Formvar Oberfläche möglicherweise nicht.</li>
	<li>Füllen Sie die Petrischale mit 2 mL Kulturmedium vorgewärmten 37 ° C (RPMI mit 10 % FCS) mit 10 mM HEPES (pH 7,4) ergänzt.</li>
	<li>Ort der Kulturschale auf 37 ° C Schale Heizung.</li>
	<li>Der Teller wärmer wird auf der AFM-Bühne.</li>
	<li>Lassen Sie das System stabilisieren bei 37 ° C.</li>
	<li>Im Kontakt-Modus mit einer 0,5 nN Kraft einen ersten globalen Bild, Podosomes zu finden, und dann Scannen Formvar Topographie bei 3 Hz mit einer ca. 20 nm große Pixel. Hinweis: Vermeiden Sie Scannen am Rand des Rasters.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
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<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
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</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Materialeigenschaften
Die Wahl des Materials für die verformbare Membran, in unserem Fall Formvar, muss einige Voraussetzungen erfüllen. Das Material muss für sichtbares Licht transparent sein und weisen begrenzt Auto-Fluoreszenz um Beobachtungen im Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben. Die Rauheit des dünnen Films muss deutlich unter 10 nm eine topographische Beeinträchtigung Zelladhäsion zu vermeiden und klare Betrachtung der Zelle-induzierte Vorsprünge von AFM Bild...

Tierische Zellen interagieren körperlich mit der Matrix und den anderen Zellen, die ihre Umwelt1darstellen. Dies ist erforderlich für sie zu migrieren, Körper zu verinnerlichen, externe Informationen zu erwerben oder zu unterscheiden. In solchen Prozessen muss die Zelle mechanische Kräfte erzeugen, und wie in den letzten Jahren zahlreiche Studien gezeigt haben, beeinflusst die Fähigkeit einer Zelle zu erzeugen Kräfte und seiner Umgebung Sonde sein biologische Verhalten, Regie zum Beispiel Verbreitung oder Differenzierung-2,-3. Die Messung von zellulären Kräften ist wiederum eine große Hilfe für die Regulierung der Truppenaufstellung zu studieren und verstehen seine Auswirkung in Zelle Verhalten und Gewebe Schicksal4,5.
Den letzten Jahren erlebt haben die Entwicklung von zahlreichen Techniken, um die Kräfte zu messen, die eine Zelle auf seine Umwelt6ausüben kann. Die meisten davon haben maßgeblich bei der Enthüllung, dass die Traktion erzwingt, dass Zellen ausüben, wie sie auf mobile Sonden oder einem verformbaren Untergrund ziehen. Jedoch die mechanischen Kräfte beteiligt Vorwölbung in die extrazellulären Umwelt leiden unter einem Mangel an Messtechniken und sind bis heute nicht gut charakterisiert.
Um diese Einschränkung zu umgehen, stellen wir Ihnen eine Methode zur Messung der Kräfte, die orthogonal zum Substrat. Es besteht in der Beschichtung von lebenden Zellen auf eine dünne elastische Folie, die in Richtung orthogonal, die es ermöglichen, Substrat Verformung von Zellen zu messen und daraus die beteiligten Kräfte verformen kann. Substrat Topographie mit nanoskaligen Auflösung mit Rasterkraftmikroskopie gemessen und die Bewertung der Kräfte von Verformung stützt sich auf das Wissen um die Geometrie der hervorstehende Zellstrukturen7,8, 9.
Hier beschreiben wir die Einrichtung und ihre Anwendung auf die erzeugte Podosomes, hervorstehende Adhäsion Strukturen gebildet durch Makrophagen für ihre mesenchymalen Migration in dreidimensionalen Umgebungen10,11Kräfte zu messen, 12,13,14,15,16,17. Wir glauben, dass diese Technik die Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung verstehen wird.

<table><tbody><tr><td>200 Mesh Nickelgitter</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Weiße Aufkleber 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Filmgießgerät mit Ventil im Auslass</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0,5% ige Lösung in Ethylendichlorid</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturgesteuerter Probenhalter&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumnitrid-Cantilever, mit einer nominalen Federkonstante von 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen mit Glasboden</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

vorsprung-kraft-mikroskopie: eine methode, um kräfte entwickelt von zelle vorsprünge zu quantifizieren

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In zahlreichen biologischen zusammenhängen müssen tierische Zellen physisch mit ihrer Umgebung interagieren durch mechanische Kräfte zu entwickeln. Unter diesen Zugkräfte gut charakterisierten gewesen, aber es fehlt an Techniken ermöglichen die Messung der Kräfte, Vorsprung durch Zellen orthogonal zu ihrem Substrat. Wir entwarfen eine Versuchsanordnung, die Kräfte, Vorsprung durch adhärente Zellen auf ihrem Substrat zu messen. Zellen, die auf einem kompatiblen Formvar Blatt vergoldet verformen dieses Substrat und die daraus resultierende Topographie wird durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf der Nanometerskala zugeordnet. Kraftwerte werden dann von einer Analyse der Verformung Profil basierend auf der Geometrie der hervorstehende zellulären Strukturen extrahiert. Daher können die Kräfte, die von den einzelnen hervorstehenden Einheiten einer lebenden Zelle im Laufe der Zeit gemessen werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung. Hier beschreiben wir ihre Anwendung auf die hervorstehende Kräfte erzeugte Podosomes gebildet durch menschliche Makrophagen zu messen.

Das obige Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Versuchsaufbau, Vorwölbung Krafteinwirkung durch Makrophagen Podosomes auf einem Formvar Substrat zu quantifizieren. Dies erfolgt über AFM und in Abbildung 1dargestellt ist.
Bei der Analyse der topographischen Bild Ausbuchtungen unter Podosomes mit JPK Datenverarbeitungs-Software sollte ein dritten Grades Polynom passen jede Scanzeile unabhängig vo...

Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.

Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protrusionskräfte mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die beschichteten Gitter der Formel vorbereitet und die Dicke dieser Folie gemessen wird. Der dritte Schritt dieses Prozesses besteht darin, Zellen auf die Gitter zu setzen und sie haften zu lassen.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Forma-Film unter den Zellen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie abzubilden. Beim Anhaften an das Substrat bilden Mikrophagen submikrometrische Adhäsionsstrukturen, die Podosomen genannt werden. Letztendlich wird die Verformung der Folie, die von Podosomen verwendet wird, quantifiziert und mit Hilfe eines selbstgebauten mechanischen Modells in Kräfte umgewandelt.Setzen Sie eine Ethanol-saubere Glaslampe in die Trichterfilmgießvorrichtung ein und decken Sie die Oberseite des Trichters ab. Schwenken Sie die Fomvar-Lösung nach oben in den Trichter, bis der Füllstand zwei Drittel des Objektträgers erreicht. Lassen Sie es eine Minute einwirken und lassen Sie dann die Formvar-Lösung in einem gleichmäßigen Strahl abtropfen.Es ist zu beachten, dass die Dicke des Films sowohl von der Strahlgeschwindigkeit als auch von der Konzentration der Formvar-Lösung abhängt. Tupfen Sie dieses Licht dunkel trocken und schneiden Sie mit einer scharfen Rasierklinge Rechtecke aus. Tauchen Sie den Objektträger in Ihren mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas, so dass der Fomvar-Film auf der Wasseroberfläche schwimmt.Legen Sie vorsichtig acetonsaubere Gitter mit der glänzenden Vorderseite nach oben auf die Folien und legen Sie auf einige von ihnen einen Deckschirm mit einem Durchmesser von 12 Millimetern. Sie werden für das Experiment zur Dickenbewertung verwendet. Tauchen Sie schließlich ein mit Aufklebern bedecktes Dia ein, um den gesamten Film und die Gitter wiederherzustellen.Umrande den mit Glas bedeckten Slip mit einer Pinzette, um den Formvar zu schneiden und ihn von der Folie zu lösen. Montieren Sie die Position des Gitters unter dem abgedeckten Zettel und umreißen Sie das Gitter mit einer Pinzette, um es abzuziehen. Das so erzeugte Loch in der Fomvar-Folie wird abgebildet, um seine Dicke zu messen.Montieren Sie eine Siliziumnitrat-Conserve-Abgabe im AFM-Glasblock und stellen Sie sicher, dass sich der goldene Streifen nicht unter der Spitze der Feder befindet. Montieren Sie den Glasblock auf das AFM-Modul und platzieren Sie dieses auf dem Mikroskoptisch. Legen Sie den mit Fomvar beschichteten Deckglas mit PBS darauf auf die Beobachtungskammer.Scannen Sie die Grenze zwischen Fomvar und Glas im Kontaktmodus und mit einem 0,5-Nano-Newton-Punkt. Verwenden Sie in der Datenverarbeitungssoftware die Glasoberfläche als Höhenreferenz und messen Sie die Fomvar-Dicke am Querschnitt. Nehmen Sie unter einer sterilen Haube einen 12 Millimeter dicken Abdeckzettel und kleben Sie einen Streifen des Lochklebebandes darauf.Umreißen Sie das mit Fomavr beschichtete Gitter mit einer Pinzette und platzieren Sie es glänzend mit der Vorderseite nach oben, so dass es nur mit den Seiten am Kleber haftet. Dadurch soll verhindert werden, dass Fomvar beim Entfernen des Gitters vom Band zerreißt. Legen Sie den Abdeckstreifen in eine sterile Platte mit sechs Vertiefungen und gießen Sie einen 10-Millimeter-Tropfen serumfreies Kulturmedium ein.Es sollte etwa 10 Tausend Zellen enthalten, und in diesem Fall handelt es sich um Mikrophagen, die von menschlichen Monozyten unterschieden werden. Achten Sie darauf, das Gitter dabei nicht mit der Piperkelle zu berühren, um die Fomvar-Beschichtung nicht zu beschädigen. Inkubieren Sie eine halbe Stunde lang, damit die Zellen anhaften können, füllen Sie dann die Vertiefung mit serumhaltigem Medium und inkubieren Sie erneut zwei Stunden lang, bevor Sie die AFM-Beobachtung durchführen.Lege zwei parallele Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Petrischale mit Glasboden und achte darauf, dass die Breite zwischen ihnen im Vergleich zu deinem Gitterdurchmesser etwas kleiner ist. Trennen Sie dann das zuvor mit Zellen bestückte Gitter und legen Sie es mit den Zellen nach unten auf die beiden Klebebandstreifen. Fixiere das Gitter, indem du zwei weitere Streifen auf die vorherigen legst.Füllen Sie die Schale mit vorgewärmtem Nährmedium und verstärkt mit Hepe's. Stellen Sie das Gericht in den zuvor auf 37 Grad Celsius eingestellten Geschirrherd. Installieren Sie das Gerät auf dem AFM-Tisch.Wenn die Systemtemperatur stabil bei 37 Grad Celsius liegt, fahren Sie mit dem Scan der Fomvar-Oberfläche fort, der im Kontaktmodus mit einem Sollwert von 0,95 Nanonewton durchgeführt werden sollte, und visualisieren Sie die mit Protozoen verbundenen Verformungen auf dem Ansichtsfenster der Ablenkdaten. Hier sind die repräsentativen Ergebnisse und Verarbeitungsschritte zur Gewinnung von Formationen mit AFM zu den grafischen Messungen. Wie Sie auf diesem Bild sehen können, werden Wölbungen auf der Fomvar-Oberfläche erkannt.Um diese fotografischen Informationen in Kraftwerte umrechnen zu können, ist es zunächst notwendig, Zugang zur lokalen hohen Differenz zu haben. Dazu sollte eine polynomiale Anpassung dritten Grades unabhängig von ihrer Abtastzeile subtrahiert werden. Dann ermöglicht die Verwendung eines hausgemachten dedizierten Bildalgorithmus die Auswertung der Protrusionskraftwerte aus der AFM-Höhenkarte und dem mechanischen Modell der Protozoen-vermittelten Protrusion.Dank dieses Verfahrens können wir die Mechanismen untersuchen, die an der Erzeugung von Protrusionskräften an Protozoen beteiligt sind. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück für Ihre Experimente.

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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