Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protrusionskräfte mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die beschichteten Gitter der Formel vorbereitet und die Dicke dieser Folie gemessen wird. Der dritte Schritt dieses Prozesses besteht darin, Zellen auf die Gitter zu setzen und sie haften zu lassen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Forma-Film unter den Zellen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie abzubilden. Beim Anhaften an das Substrat bilden Mikrophagen submikrometrische Adhäsionsstrukturen, die Podosomen genannt werden. Letztendlich wird die Verformung der Folie, die von Podosomen verwendet wird, quantifiziert und mit Hilfe eines selbstgebauten mechanischen Modells in Kräfte umgewandelt.

Setzen Sie eine Ethanol-saubere Glaslampe in die Trichterfilmgießvorrichtung ein und decken Sie die Oberseite des Trichters ab. Schwenken Sie die Fomvar-Lösung nach oben in den Trichter, bis der Füllstand zwei Drittel des Objektträgers erreicht. Lassen Sie es eine Minute einwirken und lassen Sie dann die Formvar-Lösung in einem gleichmäßigen Strahl abtropfen.

Es ist zu beachten, dass die Dicke des Films sowohl von der Strahlgeschwindigkeit als auch von der Konzentration der Formvar-Lösung abhängt. Tupfen Sie dieses Licht dunkel trocken und schneiden Sie mit einer scharfen Rasierklinge Rechtecke aus. Tauchen Sie den Objektträger in Ihren mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas, so dass der Fomvar-Film auf der Wasseroberfläche schwimmt.

Legen Sie vorsichtig acetonsaubere Gitter mit der glänzenden Vorderseite nach oben auf die Folien und legen Sie auf einige von ihnen einen Deckschirm mit einem Durchmesser von 12 Millimetern. Sie werden für das Experiment zur Dickenbewertung verwendet. Tauchen Sie schließlich ein mit Aufklebern bedecktes Dia ein, um den gesamten Film und die Gitter wiederherzustellen.

Umrande den mit Glas bedeckten Slip mit einer Pinzette, um den Formvar zu schneiden und ihn von der Folie zu lösen. Montieren Sie die Position des Gitters unter dem abgedeckten Zettel und umreißen Sie das Gitter mit einer Pinzette, um es abzuziehen. Das so erzeugte Loch in der Fomvar-Folie wird abgebildet, um seine Dicke zu messen.

Montieren Sie eine Siliziumnitrat-Conserve-Abgabe im AFM-Glasblock und stellen Sie sicher, dass sich der goldene Streifen nicht unter der Spitze der Feder befindet. Montieren Sie den Glasblock auf das AFM-Modul und platzieren Sie dieses auf dem Mikroskoptisch. Legen Sie den mit Fomvar beschichteten Deckglas mit PBS darauf auf die Beobachtungskammer.

Scannen Sie die Grenze zwischen Fomvar und Glas im Kontaktmodus und mit einem 0,5-Nano-Newton-Punkt. Verwenden Sie in der Datenverarbeitungssoftware die Glasoberfläche als Höhenreferenz und messen Sie die Fomvar-Dicke am Querschnitt. Nehmen Sie unter einer sterilen Haube einen 12 Millimeter dicken Abdeckzettel und kleben Sie einen Streifen des Lochklebebandes darauf.

Umreißen Sie das mit Fomavr beschichtete Gitter mit einer Pinzette und platzieren Sie es glänzend mit der Vorderseite nach oben, so dass es nur mit den Seiten am Kleber haftet. Dadurch soll verhindert werden, dass Fomvar beim Entfernen des Gitters vom Band zerreißt. Legen Sie den Abdeckstreifen in eine sterile Platte mit sechs Vertiefungen und gießen Sie einen 10-Millimeter-Tropfen serumfreies Kulturmedium ein.

Es sollte etwa 10 Tausend Zellen enthalten, und in diesem Fall handelt es sich um Mikrophagen, die von menschlichen Monozyten unterschieden werden. Achten Sie darauf, das Gitter dabei nicht mit der Piperkelle zu berühren, um die Fomvar-Beschichtung nicht zu beschädigen. Inkubieren Sie eine halbe Stunde lang, damit die Zellen anhaften können, füllen Sie dann die Vertiefung mit serumhaltigem Medium und inkubieren Sie erneut zwei Stunden lang, bevor Sie die AFM-Beobachtung durchführen.

Lege zwei parallele Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Petrischale mit Glasboden und achte darauf, dass die Breite zwischen ihnen im Vergleich zu deinem Gitterdurchmesser etwas kleiner ist. Trennen Sie dann das zuvor mit Zellen bestückte Gitter und legen Sie es mit den Zellen nach unten auf die beiden Klebebandstreifen. Fixiere das Gitter, indem du zwei weitere Streifen auf die vorherigen legst.

Füllen Sie die Schale mit vorgewärmtem Nährmedium und verstärkt mit Hepe's. Stellen Sie das Gericht in den zuvor auf 37 Grad Celsius eingestellten Geschirrherd. Installieren Sie das Gerät auf dem AFM-Tisch.

Wenn die Systemtemperatur stabil bei 37 Grad Celsius liegt, fahren Sie mit dem Scan der Fomvar-Oberfläche fort, der im Kontaktmodus mit einem Sollwert von 0,95 Nanonewton durchgeführt werden sollte, und visualisieren Sie die mit Protozoen verbundenen Verformungen auf dem Ansichtsfenster der Ablenkdaten. Hier sind die repräsentativen Ergebnisse und Verarbeitungsschritte zur Gewinnung von Formationen mit AFM zu den grafischen Messungen. Wie Sie auf diesem Bild sehen können, werden Wölbungen auf der Fomvar-Oberfläche erkannt.

Um diese fotografischen Informationen in Kraftwerte umrechnen zu können, ist es zunächst notwendig, Zugang zur lokalen hohen Differenz zu haben. Dazu sollte eine polynomiale Anpassung dritten Grades unabhängig von ihrer Abtastzeile subtrahiert werden. Dann ermöglicht die Verwendung eines hausgemachten dedizierten Bildalgorithmus die Auswertung der Protrusionskraftwerte aus der AFM-Höhenkarte und dem mechanischen Modell der Protozoen-vermittelten Protrusion.

Dank dieses Verfahrens können wir die Mechanismen untersuchen, die an der Erzeugung von Protrusionskräften an Protozoen beteiligt sind. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück für Ihre Experimente.