Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Das übergeordnete Ziel einer Kombination aus Mikromanipulations- und Lichtmikroskopietechniken wie FRAP und Photoaktivierung besteht darin, die räumliche Dynamik von Proteinen zu überwachen, die an der Regulation und Migration des Zytoskeletts unter bestimmten Bedingungen oder auf eine vom Signalweg abhängige Weise beteiligt sind. Die hier diskutierten Mikromanipulationsmethoden sind sowohl für die direkte Abgabe beliebiger Arten von Molekülen in Zellen als auch für eine lichtinduzierte Manipulation der Proteinaktivität innerhalb definierter subzellulärer Stellen nützlich. Der Hauptvorteil der hier vorgestellten Techniken besteht also darin, dass sie es ermöglichen, die unmittelbaren Wirkungen, die Proteine auf die Zellen ausüben, zu bestimmen und ihre Mobilität in der gesamten Zelle zu verfolgen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wurden zuvor gezüchtete B16-F1-Zellen im Verhältnis von eins zu fünf in eine drei Zentimeter große Kunststoffschale gegeben. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie Trypsin EDTA hinzu, um die Zellen zu lösen.

Geben Sie Zellkulturmedium zu den trypsinisierten Zellen. Die Zellen wieder suspendieren und in Falcon-Röhrchen überführen, danach drei bis fünf Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugieren. Nachdem Sie die B16-F1-Zellen in eine drei Zentimeter große Schale gelegt und sie mindestens sechs Stunden lang ausgebreitet haben, transfizieren Sie die B16-F1-Zellen, indem Sie eine Mischung aus 500 Nanogramm DNA-Konstrukt und einem Mikroliter Transfektionsreagenz in eine Lösung geben, die 150 Millimolare Natriumchlorid enthält.

Für die B16-F1-Zellen werden 15 Millimeter Deckgläser mit 150 Mikrolitern Lamininlösung beschichten und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Für die NIH 3T3-Zellen beschichten Sie die Deckgläser mit Fibronektinlösung und inkubieren eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die mit Laminin und Fibronektin inkubierten Deckgläser mit PBS und aspirieren Sie dann das PBS.

Säen Sie zwei Milliliter der NIH 3T3-Fibroblasten im Verhältnis eins zu 20 aus einer konfluenten Schale auf die mit Fibronektin beschichteten Deckgläser. Pipettieren Sie zwei Milliliter der transfizierten B16-F1-Zellen im Verhältnis eins zu 30 aus einer konfluenten Schale auf die mit Laminin beschichteten Deckscheiben. Anschließend können sich die Zellen vor der Mikroskopie über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius auf mit Laminin und Fibronektin beschichteten Deckgläsern ausbreiten.

Legen Sie das Deckglas mit der Zellenseite nach oben auf eine wärmeleitende RC-26-Aluminium-Bildgebungskammer. Legen Sie dann eine Kunststoffversiegelung auf das Deckglas, um eine sichere Abdichtung zwischen dem Deckglas und der Kammer zu gewährleisten, und befestigen Sie sie, indem Sie die Kunststoffversiegelung mit den Schiebeklammern der Kammer verschrauben, um ein Auslaufen des Mediums zu verhindern. Pipettieren Sie nun 37 Grad Celsius vorgewärmtes Mikroskopiemedium in den zentralen Bereich.

Setzen Sie den Wärmemelder in den dafür vorgesehenen Schlitz der Kammer ein und verbinden Sie die Elektroden der Kammer mit einem automatischen Temperaturregler TC-324B, der eine konstante Temperatur von 37 Grad Celsius aufrechterhält. Zentrifugieren Sie eine zuvor aufgetaute Proteinlösung bei 10.000 g für mindestens 30 Minuten, um Proteinaggregate zu entfernen, die zu einer Verstopfung der Nadel führen können, wenn sie in der Mikroinjektionskapillare vorhanden sind. Laden Sie mit einer flexiblen Pipettenspitze eine Mikroinjektionsnadel mit einem Mikroliter Proteinlösung von der Rückseite.

Wenn Luftblasen in der Nadelspitze vorhanden sind, klopfen Sie vorsichtig auf den Nadelboden, um sie zu entfernen. Stellen Sie dann den Nadelhalter vorsichtig an der Mikromanipulationsvorrichtung ein. Nachdem Sie die Mikroinjektionsnadel in den Nadelhalter eingeschraubt haben, üben Sie mit einem Mikroinjektionsdruckgerät Druck auf die Nadel aus, bevor Sie die Nadelspitze in das Zellkulturmedium verschieben.

Positionieren Sie dann die Nadel mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Sichtfeld, suchen Sie dann eine interessante Zelle und senken Sie die Nadel allmählich über die Zelle. Berühren Sie für die Mikroinjektion vorsichtig die Plasmamembran der Zelle, die ausreichen kann, um in die Zelle einzudringen oder einen vorübergehenden Membranbruch durch ein sehr sanftes Klopfen auf das Mikroskop zu unterstützen. Stoppen Sie den Injektionsvorgang, sobald der Durchfluss in die Zelle sichtbar ist, indem Sie die Nadelspitze nach oben in das Medium bewegen.

Wechseln Sie vor dem Auslösen des Lasers auf den GFP-Kanal und starten Sie die Bildzeitrafferaufnahme. Zeichnen Sie anschließend manuell den zu photogebleichten Bereich auf dem GFP-Kanal, während Sie die Anzeige betrachten. Starten Sie das Photobleaching durch einen manuellen Auslöser des 405-Nanometer-Lasers mindestens drei bis vier Bilder nach Beginn der Bildaufnahme.

Stellen Sie die GFP 488-Nanometer-Bilderfassung in der Software auf eine Belichtungszeit von 500 Millisekunden und ein Zeitintervall von 1500 Millisekunden ein. Passen Sie als Nächstes die Softwareeinstellungen für die Aufnahme von Zweikanal- oder Dreikanal-Zeitrafferfilmen an, indem Sie das Quadrat der Wellenlängenreihe markieren und die gewünschte Anzahl von Kanälen im Menü "Wellenlänge erfassen" auswählen. Starten Sie vor dem Auslösen des Lasers die Bildzeitrafferaufnahme und zeichnen Sie den zu photoaktivierenden Bereich manuell auf dem Phasenkontrastkanal, während Sie das Display betrachten.

Anschließend wird die Photoaktivierung durch einen manuellen Auslöser des 405-Nanometer-Lasers mindestens drei bis vier Bilder nach Beginn der Bildaufnahme eingeleitet. Um die FRAP-Ergebnisse zu analysieren, öffnen Sie die von VisiView abgeleiteten Zeitrafferfilme in der MetaMorph-Software. Leiten Sie Intensitätswerte der photogebleichten Bereiche für jeden Zeitpunkt der Fluoreszenzwiederherstellung ab, indem Sie die jeweiligen Regionen manuell mit MetaMorph zeichnen.

Zeichnen Sie eine Form an der Spitze des Lamellipodiums, die den gesamten oder einen Teil des photogebleichten Bereichs abdeckt, und passen Sie die Position bei Bedarf manuell in den nachfolgenden Bildern an, um die Veränderungen der lamellipodalen Intensitäten der jeweiligen Region im Laufe der Zeit während der Verschiebung der vorrückenden Spitze zu verfolgen. Zur Korrektur des Hintergrunds und zur Photobleaching-Erfassung werden Regionen außerhalb bzw. innerhalb der Zellen analysiert. Sobald ein Bereich von Interesse ausgewählt ist, extrahieren Sie seine Intensitätswerte auf MetaMorph, indem Sie das Menü "Bereichsmessungen messen" verwenden.

Stellen Sie sicher, dass die Optionen für die verstrichene Zeit und die durchschnittliche Intensität im Konfigurationsmenü ausgewählt sind. Klicken Sie auf Protokoll öffnen und wählen Sie Dynamischer Datenaustausch. Klicken Sie dann auf OK, um eine Excel-Tabelle zu öffnen, und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Protokoll öffnen, um die MetaMorph-Werte in Excel einzufügen.

Verwenden Sie die von MetaMorph abgeleiteten Intensitätswerte, um FRAP-Fluoreszenzwiederherstellungskurven zu berechnen, indem Sie die Intensitätswerte in eine Excel-Tabelle mit den entsprechenden Formeln einfügen. Die Fluoreszenzerholung des photogebleichten Bereichs wird auf den Hintergrund und die Innenbereiche normalisiert. Um die Halbwertszeit der Fluoreszenzwiederherstellung zu berechnen, fügen Sie die Werte der Fluoreszenzwiederherstellungskurven mit den entsprechenden Zeiten in SigmaPlot ein und führen Sie dann eine Kurvenanpassung mit dem Werkzeug Exponentieller Anstieg auf Maximum des dynamischen Anpassungsassistenten durch und wählen Sie je nach bester Kurvenanpassung die mono- oder biexponentielle Funktion aus.

Die Parameter, die durch das Lösen der ausgewählten Funktion erhalten werden, können in eine Excel-Tabelle eingefügt werden, die die entsprechende Formel enthält, die es ermöglicht, die jeweilige halbe Erholungszeit in Sekunden zu berechnen. Um die Diffusion von photoaktivierbarem Aktin nach der Aktivierung sowie seine Akkumulation in einer bestimmten Region, wie z.B. dem Lamellipodium, zu messen, verwenden Sie MetaMorph, um die Intensitäten im Laufe der Zeit in den jeweiligen Regionen sowie außerhalb der Zelle zu bestimmen, um die Hintergrundfluoreszenz für die Normalisierung zu bestimmen. Um die genaue Geschwindigkeit der Verschiebung von photoaktivierbarem Aktin weg von der Aktivierungsregion oder seine Einbaurate innerhalb des Lamellipodiums zu untersuchen, generieren Sie Fluoreszenzkurven aus Daten, die zuvor von MetaMorph abgeleitet wurden.

Fügen Sie die Intensitätswerte für den für die Normalisierung verwendeten Hintergrundbereich, den photoaktivierten zytosolischen Bereich oder den zu untersuchenden lamellipodalen Bereich in eine Excel-Tabelle mit entsprechenden Formeln ein. Hier sind Gesichtskontrastbilder einer NIH 3T3-Fibroblastenzelle vor und nach der Mikroinjektion der kleinen GTPase Rac1 zu sehen. Etwa 12 Minuten nach der Mikroinjektion hat die Zelle ihre Morphologie verändert, was auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.

Das Recycling von gebleichtem EGFP VASP durch ungebleichte Moleküle an der Lamellipodiumspitze ist hier zu sehen. In diesem speziellen Beispiel erreicht die Erholungsfluoreszenz ein Plateau bei etwa 80 % der Fluoreszenz vor dem Bleichen. Nach der Photoaktivierung diffundiert photoaktiviertes GFP-Aktin schnell aus der zytosolischen Region.

Ein Teil der photoaktivierten Aktinmonomere verlagert sich nach vorne, was zu einem schnellen Fluoreszenzausbruch bei Lamellipodien führt. Der Einbau von Fluoreszenz ist in Lamellipodien, die weit von der photoaktivierten Region entfernt sind, erfreulich geringer, da der Anteil der photoaktivierten Aktinmonomere auf ihrem Weg durch das Zytosol mit nicht aktivierten Monomeren verdünnt wird. Da photoaktiviertes GFP-Aktin im Laufe der Zeit von der photoaktivierten Region weg diffundiert, wird es kontinuierlich durch nicht-photoaktiviertes, nicht-fluoreszierendes Aktin ersetzt.

Als Folge davon ist eine allmähliche Abnahme der Fluoreszenzintensität dieser Region zu beobachten. Im Laufe der Zeit bauen Lamellipodien in der Nähe der zytosolischen Aktivierungsregion schnell fluoreszierendes Aktin ein. Der folgende Abfall der Fluoreszenz ist einfach auf die Aktin-Depolymerisation und die Monomerdiffusion weg vom Lamellipodium zurückzuführen.

Wenn also Experimente an einem einzigen Mikroskopiesystem durchgeführt werden, kann die Kombination aus Mikroinjektion und entweder FRAP- oder Photoaktivierungstechniken realistischerweise in wenigen Minuten durchgeführt werden, abhängig von der Art der untersuchten Proteine. Denken Sie immer daran, sich vor, während und nach der Mikromanipulation oder nach der Einwirkung von Laserlicht bei Laune zu halten. Für FRAP und Photoaktivierung ist es besonders wichtig, dass die ausgewählte Region ihre strukturelle Integrität während der gesamten Dauer des Films beibehält.

Das Mikroinjektionsverfahren kann durch die lokale Anwendung von Plasmamembran-permeablen Arzneimitteln oder Zytoskelett-Inhibitoren ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen bestimmter Behandlungen auf subzellulärer Ebene zu behandeln. Mikromanipulationstechniken haben den Weg geebnet, um die Diffusionseigenschaften und die subzelluläre Dynamik von Komponenten und Komplexen des Zytoskeletts zu erforschen und die Signalwege aus zweiter Hand zu verstehen, die die zelluläre Morphogenese regulieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die raumzeitliche Dynamik von zytosolischen Proteinen, von Proteinen, die in den Akt innerhalb des Zytoskeletts eingebaut sind oder sich in verschiedenen subzellulären Organellen befinden, verfolgen und überwachen können, um letztendlich die Kinetik der Zellregulation zu entschlüsseln.