Name: Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Erfahren Sie Mikromanipulationstechniken zur Analyse der Dynamik von Zytoskelettregulatoren in wandernden Zellen mittels FRAP und Photoaktivierung. Diese Methoden ermöglichen die Echtzeitbeobachtung subzellulärer Proteindynamik.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier diskutieren wir wichtige Schritte in die Techniken beschrieben in diesem Artikel, und wie sie für den Einsatz in verschiedenen experimentellen Bedingungen optimiert werden können.
Mikroinjektion ist eine Methode, die angewendet werden kann, um in den Zellen die sofortige Effekte von der Einführung exogene Proteine, Inhibitoren oder Drogen zu überwachen. Es ist besonders vorteilhaft für die Bestimmung der Funktionen der Proteine in schwierig zu transfizieren Zelltypen oder in Situationen, in denen langfristige Ausdruck nicht erwünscht ist. Anzumerken ist, dass die extrazelluläre Matrix Überleben von bestimmten Zelltypen abhängig, die sie auf ausgesät werden. Die Endothelzellen, epithelialen oder Fibroblasten-Like Zelltypen, wie auch kleinen Fisch keratozyten (siehe Dang Et al. 21 und Anderson und Cross22) können erfolgreich injiziert werden. Es gibt jedoch Ausnahmen, wie z. B. B16-F1 Zellen ausgesät auf Laminin, die bilden ein hervorragendes Modellsystem von Zellwanderung, aber sind nicht kompatibel mit Einspritzung auf diese Art von Substrat aus unbekannten Gründen. Für NIH3T3 Fibroblasten-Zellen führen wir regelmäßig Injektionen auf Fibronektin Substrat und zusätzliche Photomanipulation Techniken wie z. B. FRAP (sogar mit photoaktivierungen; für B16-F1 Zellen hier gezeigten) gleich gut in diese Fibroblasten (siehe durchgeführt werden können z. B. Köstler Et al. 3). es muss berücksichtigt werden, dass verschiedene Proteine nach ihrer funktionellen Eigenschaften und das Experiment Ziele unterschiedlich viel Zeit, Veränderungen, variierend von Sekunden bis Stunden dauern können. Ein Vorteil des Verfahrens ist, dass die Dosis/Konzentration von exogenen Agent genauer auf einzelne Zelle als z.B.gesteuert werden kann, wenn Plasmid Transfektion verwenden. Darüber hinaus ist die fluoreszierende Markierung eines Proteins keine Notwendigkeit, um seine Präsenz in der Zelle, garantieren die Flexibilität erhöhen können, wenn eine gleichzeitige Multi-Channel-Visualisierung von anderen Proteinen fluoreszent markiert erforderlich ist. Mikroinjektion ist besonders hilfreich für die Analyse von sofortiger Auswirkungen von bestimmten Proteinen oder Protein-Mischungen auf dynamische Veränderungen der Zellmorphologie oder das Zellskelett (z. B. Dang Et Al. 21 : ein Beispiel für sofortige Auswirkungen auf Migration von der Arp2/3 komplexe Inhibitor Arpin). Ein Nachteil der Technik ist die Invasivität, die Zellschäden verursachen oder Zellmorphologie beeinflussen kann. Daher ist ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung von Mikroinjektionen die Zellviabilität Überwachung. Die hier vorgestellte Methode stützt sich auf manuelle Manipulation. Unter Bedingungen getestet, um kompatibel mit erfolgreichen Injektionen, wie z. B. Fibroblasten auf Fibronektin Substrat wachsen ermöglicht hier beschriebene manuellen Injektion-Protokoll eine in der Nähe von 100 % Erfolgsquote; Dies ist unerlässlich, wenn dieser Ansatz kombiniert mit anspruchsvoll und zeitaufwändig Follow-up-Experimente, einschließlich video-Mikroskopie oder FRAP, wie zuvor3veröffentlicht. Dies schließt nicht aus, dass gelegentlich, einzelne Zellen könnte leiden unter einer Mikroinjektion-Veranstaltung, die durch abrupte Kontrast zwischen dem Kern und Zytoplasma, gefolgt von Zelle Rand einfahren sicher erkannt werden kann. Solche seltenen experimentellen Fällen sind ausgeschlossen und somit nicht für weitere Analysen berücksichtigt.
Jedoch ein halbautomatische Ansatz ist auch allgemein verwendet, zum Beispiel mit rapid (< 300 ms) Computer-gesteuerte Nadel absenken deckungsgleich mit Einspritzung Druckanstieg, so dass die Nadel nur über jede Zelle vor der jeweiligen positioniert werden Injektion. Die Erfolgsquote der halbautomatische Injektionen ist definitionsgemäß geringer als das manuelle Methode, die oben beschrieben, einfach weil es für Geschwindigkeit optimiert ist, gefolgt von Analyse mehrerer Zellen, die erfolgreich diese Behandlung überlebt; damit verlassen es nicht auf erfolgreiche Injektion einer einzelnen Zelle. Daher sind im Gegensatz zu einzelnen Zellanalyse, halbautomatische Injektionen besser geeignet für die Analyse der Injektion Effekte aus mehreren hundert Zellen, z. B. durch Videomikroskopie bei kleiner Vergrößerung oder Zelle Fixierung und Färbung. Unabhängig von der detaillierten Ansatz beschäftigt Mikroinjektion stellt keinen Endpunkt-Assay dar, sondern ist kombinierbar mit einer Vielzahl von Techniken, einschließlich FRAP oder photoaktivierungen3.
Bei der Festlegung die Protein-Fluktuationsrate von FRAP, die Intensität des Lasers muss optimiert werden, je nach Mikroskop-Setup und Bildgebung (Vergrößerung, Ziele, etc., sowie der Zelltyp, Struktur und fluoreszierende Protein für Immunofluoreszenz). Beachten Sie, dass bei optimalen Laserleistung, effiziente bleichen mit der geringst möglichen lichtbedingten kombiniert wird zur Vermeidung von Schrumpfung oder komplette Retraktion der Struktur unter Analyse (z. B. Lamellipodia oder Filopodien) oder gar Schäden auf zellulärer Ebene. Im Idealfall sollte mindestens 70 – 80 % der Bleiche Effizienz erreicht werden, obwohl komplett bleichen durch extrem schnelle Umsatz des Proteins, behindert werden kann in dem Fall, etwas mehr als 50 % auch akzeptabel sein könnte. Optimale bleichen macht für eine vorgegebene Struktur und Fluoreszenzfarbstoff experimentell getestet werden sollte, ausgehend von einer geringen Laserleistung seine allmähliche Zunahme gefolgt. Natürlich, jeder Fluoreszenzfarbstoff kann per definitionem gebleicht werden mit Laserlicht in der Nähe von ihren Höhepunkt der Erregung (488 nm für häufig verwendete grüne Farbstoffe wie FITC oder EGFP). Jedoch mit kürzeren Wellenlängen, wie z. B. in der Nähe von UV-Laser, Laser liefern höhere Mächte und können daher auch für effiziente Bleichen von häufig verwendeten Farbstoffe eingesetzt werden. Wir beschäftigen regelmäßig 405 nm Diodenlaser (120 mW) zum Bleichen von EGFP und rot fluoreszierende Farbstoffe (z. B. mCherry), wenn auch mit etwas geringerer Effizienz bei der letzteren (Daten nicht gezeigt). Da die 405 nm-Diode auch für photoaktivierungen der PA-GLP (siehe unten) verwendet werden kann, verleiht es dieses System mit maximaler Flexibilität.
Die B16-F1 Zellstrukturen und fluoreszierende Proteine Photobleached hier wurden 405 nm-Laserleistungen zwischen 65 – 100 mW beantragt. Bei der Analyse einer Photobleached Region ist es wichtig zu prüfen, ob die vorgegebene Struktur in seine ursprüngliche Form über die Analyse Zeitraum erhalten bleibt. Zum Beispiel bei der Analyse der Umsatz von Proteinen an Lamellipodia Spitzen darauf achten ob die Krümmung der Lamellipodia im Laufe der Zeit erheblich verändert wird als Veränderungen in der Krümmung zu ungenauen Ergebnissen führen können, wenn die Region/Kontur analysiert nicht umfassen Sie vollständig die Gesamtheit der Struktur in den einzelnen gemessenen Frames. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass Pakete in Lamellipodia, wie Microspikes, eingebettet in Fluoreszenzintensität Abweichungen verursachen könnten. Wie in Abbildung 2b (weißer Pfeil in 9 s Zeitrahmen) dargestellt, eine Microspike-artige Struktur befindet sich neben der gemessenen Photobleached Region, sondern bleibt während der gesamten Dauer der Messung außerhalb und somit führt nicht zu einer Ungenauigkeit. Für die Analyse von Protein-Umsatz sind wichtige Überlegungen bei der Auswahl der Position und Größe der Regionen analysiert ihre Fluoreszenz im Laufe der Zeit nicht erheblich durch Veränderungen der Zellmorphologie oder Faktoren anders als hart beeinflusst werden sollte, zu vermeiden Erwerb Immunofluoreszenz. Zum Beispiel sollten Strukturen erhebliche quantitative Beitrag der analysierten Struktur nicht aus der gemessenen Region während der Analyse bewegen; Darüber hinaus sollten unabhängige, fluoreszierende Entitäten wie vesikuläre Strukturen, die das Protein anziehen nicht das Feld von Interesse während der Analyse eingeben. Für die Festsetzung des Lamellipodial-Aktin-Polymerisation, sollte darauf geachtet werden, dass keine einziehbaren oder arruffano (d. h. nach oben klappbar) Lamellipodia analysiert werden, da dies die Genauigkeit der Ergebnisse stark beeinflusst. Darüber hinaus Retraktion der Lamellipodial Regionen vorkommen als schnelle rückwärtige Translokation, möglicherweise führend zu Überschätzung der Sätze der Lamellipodial-Aktin-Polymerisation. Eine weitere Überlegung ist die Entfernung der intrazellulären Normalisierung Regionen (genommen als Referenzpunkte für die Korrektur der Erwerb Immunofluoreszenz) von der tatsächlichen Position des Immunofluoreszenz, groß genug, um direkt zu vermeiden sollten beeinflussen Sie, indem Sie den Photobleached-Bereich.
Beim Einrichten der optimaler Bedingungen für photoaktivierungen PA-GFP-Tags Konstrukte sollte darauf geachtet werden, um zu vermeiden, sofort bleichen während der photoaktivierungen. In unserer Arbeit, die besten Ergebnisse wurden mit Laserleistungen 5 - 10 mal niedriger als normal beschäftigte zum Bleichen von EGFP. Für die Bildaufnahme von photoaktiviert Molekülen sollten Belichtungszeit und Zeitintervall zwischen den Frames unter Berücksichtigung der Größe der Regionen und Strukturen photoaktiviert werden optimiert und analysiert, sowie die mögliche Mobilität von photoaktiviert Proteinen subzellulärer Standorte. Für alle Arten von Fluoreszenz-Bildgebung ist Wartung der Zellviabilität entscheidend für den Erhalt der physiologisch relevante Ergebnisse.
Im Prinzip, grün-rot Ladungszustand der fluoreszierende Proteine wie mEos oder Dronpa Varianten12 stellt eine ebenso leistungsfähige Methode der folgenden Dynamik und Umsatz der subzellulären Strukturen wie die Lamellipodium (siehe z.B. Burnette Et al. 23). der Vorteil der letzteren Methode im Gegensatz zu PA-GFP wäre die Möglichkeit, Proteindynamik vor und nach der Konvertierung mit zwei unterschiedlichen Farben, ohne die Notwendigkeit, einen zusätzlichen roten fluoreszierenden Proteins Co auszudrücken zu folgen. Jedoch war in unseren Vorversuchen das Ausmaß der Veränderung von Kontrast und Intensität der Fluoreszenzsignal erreicht bei der photoaktivierungen der PA-GLP größer im Vergleich zu Photoconverted Sonden, vielleicht wegen der überlegenen spektralen Eigenschaften von Grün und rot fluoreszierende Sonden (Daten nicht gezeigt). Auf jeden Fall sind detaillierte Studien über Actin Filament Umsatz in Zellenrand Vorsprünge wie Lamellipodia oder Vaccinia Virus-induzierte Aktin Zahl bisher nur erschienen mit PA-GFP Derivate5,6,24.
Wenn man bedenkt welche Zelle Region um nach photoaktivierungen zu analysieren, mehrere Faktoren sollten berücksichtigt werden, die werden diskutiert, über das konkrete Beispiel gezeigte (Einbau von Actin-Monomere am Rande Zelle nach der Aktivierung in der Zellflüssigkeit), aber kann sicherlich zu den verschiedenen Analog wissenschaftlichen Problemen extrapoliert werden. Erstens bei der Messung der Rate der Lamellipodial Aufnahme von cytosolically photoaktiviert Proteine, zum Beispiel in verschiedenen experimentellen Bedingungen (wie in Dimchev Et Al. gezeigt ( 6), Größen der cytosolischen Regionen und ihre Abstände, Lamellipodial Kanten sollten zwischen experimentellen Gruppen vergleichbar. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass wenn Lichtaktivierung cytosolischen Regionen, die Zelle Dicke größer in Positionen näher in den Zellkern. Aktivierung dickere zelluläre Regionen kann in höheren Mengen von aktivierten Proteine führen, angesichts der Tatsache, dass die Verteilung des Proteins aktiviert werden homogen in das Zytosol verteilt wird. Zu guter Letzt können Ausdruck Niveaus des Proteins aktiviert werden in einzelnen Zellen durchaus sehr variabel sein. Aufgrund all dieser Überlegungen der Variabilität unbedingt die Einbeziehung cytosolically aktivierte Proteine an anderer Stelle in der Zelle im Verhältnis zu der gesamten Fluoreszenz erhalten nach der Aktivierung in den einzelnen Regionen vergleichen.
Wir haben beschrieben, wie Mikroinjektion kann als ein Werkzeug für die Untersuchung der Auswirkungen von Proteinen auf Zellmorphologie verwendet werden und haben dies durch den Nachweis der potenten Induktions von Lamellipodial Strukturen in NIH3T3 fibroblastenzellen mikroinjiziert mit veranschaulicht die kleine GTPase Rac1. Bisher haben wir diese Technik, um mit Arp2/3 Funktion in den Zellen mit der WCA C-terminale Domäne der Narbe/WAVE3mikroinjiziert stören eingesetzt. Verschiedene Parameter in mikroinjiziert Zellen können durch andere Tests, wie z. B. FRAP oder photoaktivierungen analysiert werden. Wir haben beschrieben, wie FRAP und photoaktivierungen für die Untersuchung der subzellulären Dynamik und Mobilität von Actin-Monomere eingesetzt werden können. FRAP betätigt wurde von unserer Gruppe vorher5 zu untersuchen, den Umsatz von Proteinen, Lamellipodia, wie z. B. VASP, Abi, Cortactin, Cofilin, Lokalisierung und capping Protein oder für die Aufklärung des Umsatzes der Komponenten in fokalen Adhäsionen in der Gegenwart und Abwesenheit von Rac4-Signalisierung. Darüber hinaus Messraten Aktin-Polymerisation kann durch Immunofluoreszenz EGFP getaggt β-Aktin5erreicht werden, aber alternative Methoden existieren. Tracking fluoreszierende Inhomogenitäten wie live Cell Imaging-kompatiblen Sonden zellulären actinfilamente, z.B. Lifeact25, Kennzeichnung kann auch Erwerbstätige6,26. Der Vorteil hierbei ist, dass die Überexpression des β-Aktin vermieden werden kann, die ist in der Lage Zelle Rand Vorsprung und Migration zu erhöhen und somit potenziell mischt sich mit den spezifischen Assay oder experimentelle Frage (siehe z. B. Kage Et Al. 26; Peckham Et al. ( 27). allerdings ein deutlichen Nachteil der Lifeact Sonde stellt seine rasche ein-/ausschalten Kinetik der Bindung an actinfilamente, so dass Bleichen von Actin Filament Strukturen gekennzeichnet durch Lifeact in Zellen nur über die Sonde Umsatz informiert aber nicht der Umsatz die actinfilamente, es an die25 bindet. Die Verfolgung von Fluoreszenz Inhomogenitäten beschäftigt bereits6,26 bietet einen praktischen Kompromiss, ähnlich zu der weit verbreiteten Verfolgung von Fluoreszenz Flecken integriert filamentösen Zellskelett Strukturen (siehe z. B. Lachs und Waterman28), aber möglicherweise nicht so geradlinig zu verwenden und so präzise wie FRAP EGFP-markierten F-Aktin-Strukturen. Photoaktivierungen wurde von uns für die Schätzung der Preise von Monomeren Aktin Einbindung in hervorstehenden Lamellipodia, sowie seine Mobilität in das Zytosol, im Zusammenhang mit experimentell dran cytosolischen F-Aktin Ebenen6angewendet. Die Technik ist nützlich, wenn Prüfung Mobilität und Verteilung von Proteinen aus relativ großen Flächen, wie cytosolischen Regionen abgeleitet. Allerdings prüft die Verteilung von Proteinen abgeleitet relativ kleine photoaktiviert Strukturen; z. B. Wachstum Zapfen können aufgrund der geringen Anzahl von fluoreszierende Moleküle aktiviert, schwache Signale und damit auch Mangel an Sensibilität schwierig sein. Mögliche alternative Techniken zur photoaktivierungen oder Ladungszustand der Fluoreszenz (siehe oben) können Inverse FRAP, gehören, die auf Immunofluoreszenz die gesamte Zelle außer den ROI setzt, gefolgt durch die Verfolgung der Mobilität von fluoreszierenden Molekülen Weg von dieser Region. Die Technik erfordert keine überexprimierenden Photoactivatable Versionen von Proteinen, aber wird immer Belastung durch eine ungewöhnlich hohe Dosis der Laserleistung, was möglicherweise zu unerwünschten Nebenwirkungen wie lichtbedingten beinhalten.
Klar, kann nicht photoaktivierungen und FRAP unterscheiden, ob Proteine als Monomeren, dimeren oder auch kleine Oligomere in Bewegung sind und ob sie in Kombination mit weiteren Bindungspartner bewegen. Informationen dieser Art erhalten Sie stattdessen von Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie Techniken29 oder, alternativ, FLIM-FRET-30. Dennoch bilden FRAP und photoaktivierungen einfache Ansätze, um lokale und globale Proteindynamik in Zellen, unabhängig davon, das Protein des Interesses, subzelluläre Lage oder Zelltyp studierte direkt zu beurteilen.

Überwachung der räumlich-zeitliche Dynamik von Proteinen und anderen Molekülen in lebenden Zellen ist ein wesentliches Instrument in vielen Bereichen der Zell- und Molekularbiologie geworden. Erweiterte Fluoreszenz mikroskopiertechniken einschließlich Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) und Bund-Fluoreszenz Lifetime imaging (Bund-FLIM) oder FRAP, Verlust der Fluoreszenz in Immunofluoreszenz (FLIP) und photoaktivierungen sowie viele andere zulassen für die zeitliche und räumliche Verfolgung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Konformationsänderungen, sowie die Bestimmung der Kinetik der Diffusion und Lokalisierung von verschiedenen Proteinen in der Zelle1,2. FRAP und photoaktivierungen Techniken sind vor allem für die Prüfung der Regulierungsbehörden der Aktin-Zytoskelett und Zelle Migration allgemein anwendbar. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit zusätzlichen Mikromanipulation Techniken wie Mikroinjektion3angewendet werden und beinhalten die Expression von Proteinen eindringmittel beschriftet. Sie ermöglichen die Abschätzung der Kinetik der Verband Protein Aktin-reiche Strukturen Zellwanderung, z. B. Filopodien oder Lamellipodia, der Umsatz der Proteine in fokalen Adhäsionen4beteiligt oder verzweigte Aktin Netzwerke5. Sie ermöglichen auch die Bestimmung der Lamellipodial-Aktin-Polymerisation-Preise, die Bewertung der Dispersion von Monomeren Aktin im Zytosol, die Rate der subzellulären Actin Monomeren Translokation, dadurch actinfilamente im vorstehenden Lamellipodia6und andere Parameter.
FRAP ist eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mobilität von Proteinen innerhalb einer lebenden Zelle, ursprünglich in den 1970er Jahren von Axelrod7entwickelt. Eine Region of Interest (ROI) innerhalb einer Zelle, bevölkert mit fluoreszent-markierten Proteinen ist ein Laser von hoher Intensität, zu bleichen der Fluorophor Moleküle vorhanden in dieser Region einen bestimmten kurzen Zeitraum hinweg führen vorübergehend ausgesetzt. Ungebleicht, eindringmittel beschriftet Proteine befindet sich außerhalb der ROI beim Bleichen, diffuse und die gebleichte Region abhängig von ihrer raumzeitlichen Dynamik, verursacht die Verschiebung der Photobleached Moleküle im Laufe der Zeit zu infiltrieren. Die Rate der Fluoreszenz Wiederaufnahme in gebleichtem Regionen ist abhängig von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich die Größe und die Rate der Verbreitung eines bestimmten Moleküls und natürlich die Fluktuationsrate innerhalb der vermeintlichen gebleichten Struktur verbunden. So lösliche Proteine wird die Erholung der Fluoreszenz in der gebleichten ROI schnell durch Diffusion, während Proteine fest zugeordnete Strukturen wie fokale Adhäsionen zu vermitteln, haben längere Umschlagzeiten, wie deren Fluoreszenz-Erholung wird richten Sie sich sowohl auf die Diffusion der löslichen Fraktion der Protein- und Dissoziation-Verband Kinetik des Bruches Struktur verbunden. Fluoreszenz-Recovery ist in der Regel erworben und quantifiziert, bis das ursprüngliche Niveau der Pre-Bleichmittel Intensität der Fluoreszenz erreicht ist. Allerdings tritt dies nicht auf, wenn ein Teil der ursprünglichen Fluoreszenzintensität gehört zu den sogenannten unbeweglich Fraktion, die nicht durch Diffusion wieder aufgefüllt werden kann oder ist sehr langsam Preisen im Vergleich zu den Großteil der Moleküle bestehend aus mobilen Auffüllen Bruchteil. Zur Bestimmung des Protein-Umsatz, FRAP Kurven erzeugt werden, das Ausmaß der Fluoreszenz-Erholung im Laufe der Zeit darstellt. Aus diesen Kurven Erholung können durchschnittliche zweieinhalbmal Proteingewinnung berechnet werden. Kurve passt der Durchschnittsdaten FRAP, und damit mathematischen Analysen erstellen, ist es auch möglich, abzuleiten, die durchschnittliche Fluktuationsrate der mobilen Fraktion aus einer homogenen Bevölkerung von Molekülen zusammengesetzt ist, ob es besteht mindestens zwei Subpopulationen von Molekülen mit Differential Rate umdrehen. Neben der Schätzung Protein Umsatzraten durch quantitative Ansätze, können verfolgen die Erholung der Photobleached Regionen in Lamellipodia für genaue Quantifizierung von Lamellipodial Motilität Parameter wie retrograde Flow, Vorsprung auch, und Aktin-Polymerisation-Preise. FRAP stellt, ein vielseitiges Werkzeug für die Beurteilung verschiedener Parameter innerhalb der Strukturen lebender Zellen angewendet werden.
Photoaktivierungen ist eine Methode verwendet, um die Verbreitung und die Mobilität der Proteine oder Moleküle, die aus einem bestimmten zellulären Ort verfolgen. Die Technik beschäftigt, zum Beispiel eine Variante des Wildtyp grün fluoreszierendes Protein (GFP), ursprünglich entwickelt von Patterson und Lippincott-Schwartz8, die in einer Art und Weise mutiert ist, mit dem seine Fluoreszenz hoch nach Exposition gegenüber erhöht werden können Ultraviolettes (UV) Licht (rund 400 nm; hier, 405 nm). Wie beschrieben von Patterson Et Al., Wildtyp GFP Chromophore existieren als eine gemischte Bevölkerung von neutralen Phenole und anionischen Phenolates, erzeugen eine große Absorption Peak bei ca. 397 nm und eine kleinere noch 475 nm, beziehungsweise. Bei der Bestrahlung des Proteins mit UV-Licht erfährt die Bevölkerung Ladungszustand, Verschiebung in Richtung der anionischen Form. Wenn begeistert von 488 nm, das Photoconverted/photoaktiviert-Protein stellt eine Erhöhung der 3-fold in Fluoreszenz, nicht ausreichend in der Praxis für die Unterscheidung zwischen aktiviert und nicht GFP aufgrund der hohen intrinsischen Hintergrundfluoreszenz aktivierte. Jedoch wurde eine Abnahme der hintergrundintensität erreicht, durch die Einführung einer einzigen Aminosäure Mutation in der GFP-Sequenz (Histidin Substitution an Position 203). Das daraus resultierende T203H mutierte, auch bekannt als Photoactivatable-GLP (PA-GFP) zeichnet sich durch einen erheblichen Rückgang der Extinktion der kleine Spitze, die bei Bestrahlung mit UV-Licht fast 100fach erhöht wird, wenn anschließend mit 488 nm Licht angeregt. Überexpression von PA-GFP-markierten Proteinen ist eine weit verbreitete Ansatz, der die Bestimmung der Diffusion und Beweglichkeit der Moleküle in den Zellen ermöglicht. Wir haben zuvor PA-GFP-Tags Aktin um festzustellen, die Rate der Dispersion von Actin-Monomere vom cytosolischen Regionen angewendet ermöglicht nicht nur die Erforschung ihrer Mobilität innerhalb der Zytosol, sondern auch ihre Aufnahme Rate in die hervorstehenden Lamellipodial Aktin Netzwerk6. Neuere Literatur beschreibt auch neuartige, Foto-Cabrio Proteine, die im Prinzip in einer analogen Weise verwendet werden können, sondern beherbergen den möglichen Vorteil bereits vor der Foto-Konvertierung sichtbar. Beispiele für diese Gruppe von fluoreszierenden Proteinen sind Dendra2 und mEos29,10,11,12.
In diesem Artikel erklären wir die Methodik der microinjecting Zellen mit Proteinen. Wir erklären weiter, wie diese Technik mit FRAP, durch Immunofluoreszenz Proteine Aktin-Zytoskelett-Verordnung und Motilität, beteiligt kombiniert werden kann und wie FRAP Kurven und Halbzeit der Verwertung von mobilen Fraktionen abgeleitet werden können. Darüber hinaus bieten wir ein Beispiel der Verwendung von der FRAP-Technik Aktin Polymerisation der Lamellipodial Netzwerke bestimmen. Wir bieten auch Anleitungen und Tipps für photoaktivierungen Experimente durchzuführen, die zur cytosolischen Mobilität von Monomeren Aktin und Raten von Aktin Einbindung in Lamellipodia herangezogen werden können. Diese Techniken sind natürlich nicht nur um tracking-Aktin-Zytoskelett-Komponenten, sondern auf potenziell erforderlich moderate Anpassung bzw. Optimierung begrenzt, kann weit angewendet werden um andere Zelltypen oder verschiedene Proteinen, Strukturen, zu untersuchen und Parameter.

<table><tbody><tr><td>B16-F1 Melanomzellen in der Haut von Mäusen&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>NIH-3T3 Zellen</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L Glukose&nbsp;</td><td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Deutschland</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F-12 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum&nbsp; (FCS)</td><td>PAA Laboratories, Linz, Österreich</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>F7524</td><td>Los054M3396</td></tr><tr><td>MEM Nicht essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Deutschland</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glumatin 200 mM (100x)</td><td>Lebenstechnologien</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 5000 U/mL</td><td>Lebenstechnologien</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Deutschland</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Beschichtungs-Puffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Selbstgemacht: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td></tr><tr><td>Fibronektin aus menschlichem Plasma&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus Transfektion, Illkirch, Frankreich</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei Puffer</td><td>Polyplus Transfektion, Illkirch, Frankreich</td><td>702-50</td><td>150mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-Aktin-Plasmid DNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>beschrieben in Koestler et al.2008</td></tr><tr><td>pEGFP-Aktin-Plasmid DNA</td><td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rac1-Protein für die Mikroinjektion</td><td></td><td></td><td>Aufgereinigt als GST-markierte Version und vor der Injektion von GST abgespalten</td></tr><tr><td>Mikroinjektionspuffer</td><td></td><td></td><td>Selbst hergestellt: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl ph7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT</td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70.000 MW, Lysin Fixierbare</td><td>molekulare Sonden, Thermno Fisher Scientific, Deutschland</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kreisförmige Deckgläser 15mm, Nr.1&nbsp;</td><td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Deutschland</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Spitzen</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip Mikroinjektion Kapillarspitzen</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Silikonfett&nbsp;</td><td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungskammer mit offenem Diamantbad aus Aluminium</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop: Axio Observer&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Jena, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap-HQ2 Kamera&nbsp;</td><td>Photometrie, Tucson, AZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG4 Lichtquelle&nbsp;</td><td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserquelle&nbsp;</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet Mikroinjektor&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td></td><td>Mit eingebautem Kompressor für die Druckversorgung</td></tr><tr><td>Nikon Narishige Mikromanipulatorsystem</td><td>Nikon Instruments, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview Software v2.1.4</td><td>Visitron Systems, Puchheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software v7.8.10</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot v.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikromanipulation techniken analyse der morphogenetischen dynamik und umsatz des zytoskeletts regulatoren

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Prüfung der räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine kann ihre funktionale Bedeutung in verschiedenen Kontexten zeigen. In diesem Artikel ist es diskutiert wie fluoreszierende Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) und photoaktivierungen-Techniken verwendet werden, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine an subzellulären Orten zu studieren. Wir zeigen auch, wie diese Techniken einfach Bestimmung verschiedener Parameter verbunden mit Aktin-Zytoskeletts Regulierung und Zelle Motilität zu ermöglichen. Darüber hinaus die Mikroinjektion von Zellen zusätzlich eine alternative Behandlung (möglicherweise vor oder ergänzend zu die vorgenannten Photomanipulation Techniken) Trigger sofortige Wirkungen der translozierten Proteine auf Zelle bezeichnet man als Morphologie und Funktion. Mikromanipulation wie Protein Einspritzung oder lokale Anwendung von Plasmamembran durchlässig Drogen oder Zellskelett Hemmer dienen als mächtiges Werkzeug, um die unmittelbaren Auswirkungen einer bestimmten Behandlung auf Zelle Verhalten auf die einzelne Zelle und subzellulärer erfassen Ebene. Dies ist hier durch sofortige Induktion der Lamellipodial Zelle Rand Vorsprung durch die Injektion von rekombinanten Rac1 Protein veranschaulicht, wie vor einem Viertel Jahrhundert gegründet. Darüber hinaus bieten wir ein Protokoll für die Bestimmung des Umsatzes der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (EGFP)-VASP, ein Aktin-Filament-Polymerase prominent an Lamellipodial Spitzen der B16-F1 Zellen ansammeln beschäftigt FRAP und einschließlich der zugehörigen Daten Analyse und Kurvenanpassung. Wir präsentieren auch Richtlinien für die Schätzung der Preise der Lamellipodial Aktin Netzwerk Polymerisation, beispielhaft durch Zellen, die mit dem Ausdruck EGFP getaggt β-Aktin. Zu guter Letzt sind Anweisungen für wie zu untersuchen, die Preise der Aktin-Monomer-Mobilität innerhalb der Zelle Zytoplasma, gefolgt von Aktin Einbau an Standorten von rapid Filament Assembly, wie die Spitzen der hervorstehenden Lamellipodia, mit photoaktivierungen Ansätze. Keines dieser Protokolle ist auf Komponenten oder Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts beschränkt, sondern kann problemlos erweitert werden, um in Analog Mode die raumzeitliche Dynamik und Funktion von Proteinen in verschiedenen verschiedenen subzellulären Strukturen oder funktionelle erkunden Kontexten.

Abbildung 1 g h zeigen Phase kontrastreiche Bilder einer NIH3T3 Fibroblasten-Zelle vor und 10 min nach Mikroinjektion von Rac1, die ein kleines Rho-Familie GTPase induzieren Lamellipodia Bildung durch seine Interaktion mit der Welle Komplex fähig ist. Die Zelle wird zuerst vor der Mikroinjektion (Abbildung 1g), visualisiert, um seine Lebensfähigkeit und Morphologie, z. B. Mangel an Lamellipodia zu bestätigen. In 10 min nach Mikroinjektion hat die Zelle deutlich seine Morphologie verändert, dürfte von dieser Behandlung, und zeigt eine erfolgreiche Injektion (Abbildung 1h).
Für Einfachheit und Klarheit bieten wir als nächstes Exemplarische Ergebnisse für FRAP und photoaktivierungen Analyse in Zellen, die nicht zusätzlich mikroinjiziert worden.
Analyse des Umsatzes der VASP EGFP markiert, an der Spitze Lamellipodium zeigt Abbildung 2a-f. Beachten Sie, dass VASP richtet sich darüber hinaus, im Entstehen begriffenen und fokale Adhäsionen, klein und länglich Punkte in die Zelle innen18,19. Die Fluoreszenzintensität einer Lamellipodial Region mit einer klaren VASP Ansammlung an der Spitze war gebleicht und für jeden Zeitrahmen durch Anschluss an die Kontur des ROI vor, während und nach dem Bleichen wie die Lamellipodium nach vorne ragt gemessen. Als gebleichte EGFP-VASP Proteine durch nicht gebleicht Moleküle an diesen Standorten recycelt werden, wird allmähliche Erholung der Fluoreszenz (Abbildung 2b) beobachtet. Die FRAP Erholung Kurve erhalten auf diese Weise und normiert auf die Pre-Bleichmittel Intensität (ausgedrückt als 1) ist in Abbildung 2cersichtlich. Immunofluoreszenz Effizienz kann variieren und etwa 20 % des Wertes vor dem Bleichen in diesem Beispiel, wie aus der Value-at-t0 ermittelt wurde (das erste Bild nach Immunofluoreszenz). Die Zunahme der Fluoreszenz erreicht ein Plateau im Beispiel bei ca. 80 % der Fluoreszenz vor dem Bleichen. In einer statischen Struktur während der zeitliche Verlauf des Experiments, wie z. B. eine fokale Adhäsion nach Wiederherstellung der immobile Bruch (IF, roter Pfeil in Abbildung 2 definiert ist der Unterschied zwischen Pre-Bleichmittel Intensität und die Plateau-Fluoreszenz erreicht c, e), während die Anzahl der Fluoreszenz zwischen dem Zeitpunkt der Bleichen und vollständige Genesung wiederhergestellt wird als mobile Bruch (grünen Doppelpfeil in Abbildung 2C, e) definiert. Beachten Sie, dass in einer dynamisch verändernden Struktur wie die Lamellipodium Tipp hier analysiert, das Ausmaß der IF könnte nicht nur unbeweglich Moleküle, sondern auch eine Reduzierung des Vorsprungs Geschwindigkeit ableiten bekanntlich EGFP-VASP Intensität abhängig Parameter-18. Um die halbe Zeit der Erholung zu berechnen, entstand eine Fit Kurve auf Sigma Plot (Abbildung 2d). In diesem Fall der Wert des Parameters "b" extrahiert von der Lösung der Gleichung 2 ist gleich auf 0.0754, angewendet, bei der logarithmischen Funktion (Gleichung 4) Ergebnisse in einem geschätzten Hälfte-Zeit der Erholung der 9.19 s (Abbildung 2d , ganz rechts Panel), die relativ schnell in dieser bestimmten Zelle im Vergleich zum Durchschnitt ist vorher5veröffentlicht. Beachten ist, dass die Hälfte Wiederherstellungszeiten von Zelle zu Zelle innerhalb der gleichen Bevölkerung manchmal erheblich variieren können. Für repräsentative Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir daher, Bestimmung dieses Parameters als Mittelwert aus mindestens 15-20 Zellen. Zur Veranschaulichung der Grad der Abweichung, arithmetische Mittel der EGFP-VASP Erholung im Durchschnitt aus 15 Zellen für jeden Zeitpunkt waren erzeugt (Abb. 2e) und durchschnittliche Kurve passt erstellt und angezeigt auf analoge Weise (Abbildung 2 ( f).
Die Polymerisation bei der Lamellipodial-Aktin-Netzwerk umfasst die Summe vorwärts Netzwerk Vorsprung und retrograde Strömung. FRAP kann zur Messung der Aktin-Polymerisation-Rate von transfecting Zellen (in diesem Fall B16-F1) mit EGFP getaggt β-Aktin und Immunofluoreszenz einer hervorstehenden Lamellipodial Region (Abbildung 2g) angewendet werden. Für die Analyse der Lamellipodial Aktin Netzwerk Polymerisation bemisst sich die Fluoreszenz-Erholung beim Bleichen von EGFP getaggt β-Aktin im Laufe der Zeit. Als die Polymerisation von Actin Monomeren fortschreitet an den Stacheldraht Enden der Lamellipodial actinfilamente (die alle in Richtung der vorderen20hinweisen), ist das Netzwerk ständig umgesiedelt nach hinten und nach vorn, voran die Preise von denen problemlos durch polarisierte Erholung der Fluoreszenz auf Immunofluoreszenz erhalten. Fluoreszenz-Erholung von der Lamellipodium ist abgeschlossen, sobald die gebleichte Zone erreicht hat, die Übergangszone zwischen der hintere Teil der Lamellipodium und der Lamelle, charakterisiert durch eine geringere Dichte mehr horizontal angeordnet Filament-Bundles sehr viel langsamer als die Beobachtungen in den Lamellipodium umdrehen. Wie in Abbildung 2gdargestellt, kann Fluoreszenz Erholung visualisiert werden, als eine Linie horizontal auf den Rand und fließt nach hinten in Richtung der Lamelle, die ermöglicht die Messung der Entfernungen von Vorsprung und retrograde Strömung (einzeln dargestellt im rechten Bereich von Abbildung 2g als orange und rote Doppelpfeile, beziehungsweise).
Wir haben auch photoaktivierungen in B16-F1 Zellen mit PA-GFP-Aktin, die Mobilität der Actin-Monomere innerhalb der Zellflüssigkeit und die bei ihrer Aufnahme innerhalb von hervorstehenden Lamellipodia verfolgen transfiziert angewandt. Wie in Abbildung 3a, bdargestellt, eine cytosolische Region war photoaktiviert durch die Einwirkung von 405 nm Laser, während Bilder auf die GFP erworben wurden Kanal jeder 1,5 s für die Verteilung der GFP-Tag, photoaktiviert Aktin zu visualisieren. Photoactivated GLP-Aktin ersichtlich aus der cytosolischen Region in Abbildung 3bdiffundieren. Die Rate der Fluoreszenz Intensität Rückgang der cytosolischen photoaktiviert-Region wird als prozentualer Anteil der Anfangsintensität T0 dargestellt (zuerst Rahmen nach photoaktivierungen; Abbildung 3 ( c). Photoaktiviert Aktin integriert auch an den Spitzen der Lamellipodia, wo neue Actin-Monomere, um den wachsenden Stacheldraht enden hinzugefügt werden der actinfilamente während Vorsprung verlängern. Um die Rate der Lamellipodial Einbindung abschätzen zu können, haben wir im Laufe der Zeit einer zweidimensionalen Kontur/Region von etwa 5 µm Breite und 1 µm in Höhe der Fluoreszenzintensität gemessen; die Region war ständig neu positioniert an der Spitze der Lamellipodium als es ragte. Aktin-Aufnahme wurde als Prozentsatz der Fluoreszenzintensität der cytosolischen Region T0 photoaktiviert vertreten (Abbildung 3-d). Mit fortschreitender Dehnung der actinfilamente flossen neue Actin-Monomere Lamellipodial vorne. Ein Bruchteil dieser Actin-Monomere wurde der cytosolischen Pool stochastisch abgeleitet wo Monomere photoaktiviert waren. Dadurch wird die rasche Zunahme der Fluoreszenz in Lamellipodia in den ersten 20 s nach photoaktivierungen. Als neue Monomere zu Lamellipodial vorne, zuvor eingebaute Actin Monomeren Strömung mit Fäden in Richtung der Lamelle durch retrograde Strömung hinzugefügt werden. Im Laufe der Zeit der ROI ist komplett gefüllt mit fluoreszierenden Monomeren und ein Plateau in Fluoreszenz ist erreicht (Abbildung 3-d). Ein allmählicher Rückgang der Fluoreszenz ist dann beobachtet, wenn Diffusion von photoaktiviert Monomere in der Zelle nach werden nicht photoaktiviert-Aktin-Monomere zunehmend Lamellipodial vorne neu hinzugefügt. Diese Abnahme der Fluoreszenz finden ein neues Plateau erreicht wird, sobald ein Gleichgewicht in der gesamten Zelle zwischen photoaktiviert und nicht photoaktiviert Monomere (Daten nicht gezeigt) erreicht ist.
Die Mobilität der Actin-Monomere in der Zellflüssigkeit wurde durch die Messung der Fluoreszenz-Intensitäten in Regionen gleicher Größe positioniert nach distal aus der photoaktiviert Region (wie auf Abbildung 3eine farbcodierte Regionen mit der Bezeichnung abgeleitet R1-R5). Wie in Abbildung 3edargestellt, Fluoreszenzintensität in jeder dieser Regionen sinkt schrittweise Weg von der cytosolically photoaktiviert Region, als der Anteil der photoaktiviert-Aktin-Monomere wird zunehmend verdünnt mit nicht aktivierte (d. h. nicht-fluoreszierende) Monomeren. Darüber hinaus ist der Höhepunkt der Fluoreszenz später erreicht: je weiter entfernt die gemessenen Region liegt aus der photoaktiviert Region, je länger die Zeit, die erforderlich für Actin-Monomere in diesen Regionen verbreiten. Ein repräsentativer Wert für den Grad der Aktin-Monomer-Infiltration in jeder Region kann abgeleitet werden, durch Quantifizierung der Hälfte der Zeit die Fluoreszenz-Plateau zu erreichen. Je weiter entfernt der Region, desto länger dauert es für die photoaktiviert-Aktin hinein diffundieren und somit mehr Zeit wird benötigt für das fluoreszierende Plateau erreicht werden, letztlich zu einem höheren t1/2 Wert (Abbildung 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Abbildung 1 : Imaging-Kammer Montage- und Mikroinjektion Verfahren. (ein) Imaging-Kammer-Komponenten. (b) Silikon Fett ist sorgfältig um die Öffnung der Kunststoff Versiegelung verschmiert. (c) das Deckglas befindet sich mit der Zelle-Seite nach oben in die Mitte der bildgebenden Kammer öffnen. (d) eine sichere Abdichtung ist durch die Positionierung der Kunststoff Versiegelung auf dem Deckglas und durch Anziehen der Spannpratzen etabliert. (e) Mikroskopie Medium ist in den Schlitz der Kammer pipettiert. (f) der bildgebenden Kammer befindet sich auf dem Mikroskoptisch, Wärmemelder und Elektroden sind mit einer Heizeinheit auf 37 ° C voreingestellt verknüpft und Zellen dürfen für mindestens 30 min anzupassen, bevor Mikroskopie ausgelöst wird. In diesem Beispiel Mikroskoptisch ist ausgestattet mit einem Mikromanipulator für die Durchführung von Mikroinjektionen und die Mikroinjektion Nadel wird in das Medium der Zelle Deckschicht in der bildgebenden Kammer eingetaucht. (g) An NIH3T3 Fibroblasten-Zelle wird durch Phasenkontrast-Mikroskopie vor Mikroinjektion visualisiert. Das Rote Kreuz in das Fach perinukleäre gibt den Speicherort der die zukünftigen Mikroinjektion, das entspricht einer hohen zytoplasmatischen Region aufgrund der Nähe zu den sperrigen Kern. (h) 10 min nach Mikroinjektion mit Rac1, reagiert die Zelle durch prominente Bildung von Lamellipodia rund um die gesamte Zelle Peripherie (gekennzeichnet durch grüne Pfeile). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Abbildung 2: FRAP ermöglicht die Bestimmung von Protein-Umsatz oder Lamellipodial-Aktin-Polymerisation Tarife. (einem) Vertreter Beispiel B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck EGFP-VASP vor Immunofluoreszenz einer Lamellipodial Region, wie angegeben. Verschiedenfarbige Konturen/Formen sind beschriftet, um anzugeben, welche Regionen für Fluoreszenz-Intensität-Messungen im Laufe der Zeit galten. Hinweis Die rote Kontur mit einem Ausrufezeichen versehen, die eine cytosolische Region befindet sich in einer Gegend mit mehreren Vesikel und Zelle Oberfläche Rüschen Etiketten gekennzeichnet. Dynamische Bereiche wie diese sollte für die Auswahl von Regionen der Fluoreszenz Referenz vermieden werden, da sie von starken kurzfristigen Schwankungen der Fluoreszenz, was möglicherweise zu ungenauen Ergebnissen gekennzeichnet sind. (b) Lamellipodial Region der EGFP-VASP mit dem Ausdruck ihrer Zelle vor und nach Immunofluoreszenz. Die Erholung der Fluoreszenzsignal nach Immunofluoreszenz innerhalb der Region in lila markiert ist über einen Zeitraum visualisiert. Pfeil zeigt die Spitze des einen Microspike angereichert für VASP wahrscheinlich aufgrund der hohen Dichte der actinfilamente polymerisierenden dort19. (c) ein Beispiel für ein FRAP Erholung Kurve als abgeleitet Quantifizierung der fluoreszenten Intensität der Photobleached Lamellipodium (violette Kontur) in b rot und grüne Linien auf der rechten Seite zeigen bzw. unbeweglich und mobile Brüche. (d) A passt der FRAP Erholung Kurve in c (links) und ein Beispiel für die Berechnungsmethode verwendet, um die Hälfte Erholungszeit (Rechte Abbildung) abzuleiten. (e) ein Beispiel für eine Erholung der FRAP-Kurve abgeleitet von durchschnittlich die Fluoreszenz Erholung Kurven 15 Zellen mit SEM-Bars, den Grad der Variabilität innerhalb der Probe-Population. (f) eine Kurve Passform abgeleitet von durchschnittlich FRAP Erholung Kurve Fits 15 Zellen (links) und ein Beispiel für die Berechnungsmethode verwendet, um die Hälfte Erholungszeit (Rechte Abbildung) abzuleiten. (g) Zeitraffer Platten der überstehenden Lamellipodium einer B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck EGFP getaggt β-Aktin, vor und nach dem Bleichen von einer Lamellipodial Region wie angegeben, durch Fluoreszenz-Erholung in der Lamellipodium im Laufe der Zeit folgten. Auf dem rechten Panel Messwerte Protrusion und retrograde Strecken stehen zur Verfügung (in Orange und rot, beziehungsweise). Berechnungen unter der Bild-Tafeln zeigen, wie die Summe der Vorwölbung und retrograde Entfernungen werden verwendet, um die Polymerisation Rate von Lamellipodial Aktin Netzwerk ableiten. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Abbildung 3: Photoaktivierungen PA-GFP-Aktin für Monomer tracking in die Zelle. (ein) A repräsentatives Beispiel einer B16-F1-Zelle mit dem Ausdruck PA-GFP-Aktin vor photoaktivierungen in einer cytosolischen Region auslösen, wie durch den roten Kreis (PA) angegeben. Verschiedenfarbige Konturen sind beschriftet, um anzugeben, welche Regionen für Fluoreszenz-Intensität-Messungen im Laufe der Zeit galten. (b) eine Darstellung der zeitlichen Verteilung der PA-GFP-Aktin Folgendes photoaktivierungen. Beachten Sie die schrittweise Verringerung der Fluoreszenz in der photoaktiviert, cytosolischen Region (roter Kreis), wie die photoaktiviert-Aktin davon diffundiert. Aufgrund ihrer Verbreitung auf der Vorder- und Montage in das Netzwerk sind Aktin-Monomere photoaktiviert allmählich in Lamellipodia (Cyan Region) und in der Zellflüssigkeit (verschiedene farblich gekennzeichneten Regionen) auf Distanz und Zeit-abhängige Weise verbessert. (c) Vertreter, zeitliche Abnahme der Fluoreszenz in der photoaktiviert cytosolischen Region (rote Kontur in b). (d) zeitliche Änderungen in Fluoreszenzintensität in der Lamellipodial Region (Cyan Kontur in b). (e) Kurven repräsentativ für die zeitlichen Veränderungen in der Fluoreszenzintensität der cytosolischen Regionen (farbcodiert in b) aufgrund der Positionierung in Variablen Abständen aus dem Bereich der photoaktivierungen. Beachten Sie wie zweieinhalbmal erreichen die Fluoreszenz plateau (angegeben in der Legende auf der rechten Seite) erhöhen mit dem Abstand der gegebenen Region auf dem Gebiet der photoaktivierungen, wahrscheinlich korrelieren mit der zunehmenden Zeiten für Diffusion von Actin-Monomere in der jeweiligen Region. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Das übergeordnete Ziel einer Kombination aus Mikromanipulations- und Lichtmikroskopietechniken wie FRAP und Photoaktivierung besteht darin, die räumliche Dynamik von Proteinen zu überwachen, die an der Regulation und Migration des Zytoskeletts unter bestimmten Bedingungen oder auf eine vom Signalweg abhängige Weise beteiligt sind. Die hier diskutierten Mikromanipulationsmethoden sind sowohl für die direkte Abgabe beliebiger Arten von Molekülen in Zellen als auch für eine lichtinduzierte Manipulation der Proteinaktivität innerhalb definierter subzellulärer Stellen nützlich. Der Hauptvorteil der hier vorgestellten Techniken besteht also darin, dass sie es ermöglichen, die unmittelbaren Wirkungen, die Proteine auf die Zellen ausüben, zu bestimmen und ihre Mobilität in der gesamten Zelle zu verfolgen.Um dieses Verfahren zu beginnen, wurden zuvor gezüchtete B16-F1-Zellen im Verhältnis von eins zu fünf in eine drei Zentimeter große Kunststoffschale gegeben. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie Trypsin EDTA hinzu, um die Zellen zu lösen.Geben Sie Zellkulturmedium zu den trypsinisierten Zellen. Die Zellen wieder suspendieren und in Falcon-Röhrchen überführen, danach drei bis fünf Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugieren. Nachdem Sie die B16-F1-Zellen in eine drei Zentimeter große Schale gelegt und sie mindestens sechs Stunden lang ausgebreitet haben, transfizieren Sie die B16-F1-Zellen, indem Sie eine Mischung aus 500 Nanogramm DNA-Konstrukt und einem Mikroliter Transfektionsreagenz in eine Lösung geben, die 150 Millimolare Natriumchlorid enthält.Für die B16-F1-Zellen werden 15 Millimeter Deckgläser mit 150 Mikrolitern Lamininlösung beschichten und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Für die NIH 3T3-Zellen beschichten Sie die Deckgläser mit Fibronektinlösung und inkubieren eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die mit Laminin und Fibronektin inkubierten Deckgläser mit PBS und aspirieren Sie dann das PBS.Säen Sie zwei Milliliter der NIH 3T3-Fibroblasten im Verhältnis eins zu 20 aus einer konfluenten Schale auf die mit Fibronektin beschichteten Deckgläser. Pipettieren Sie zwei Milliliter der transfizierten B16-F1-Zellen im Verhältnis eins zu 30 aus einer konfluenten Schale auf die mit Laminin beschichteten Deckscheiben. Anschließend können sich die Zellen vor der Mikroskopie über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius auf mit Laminin und Fibronektin beschichteten Deckgläsern ausbreiten.Legen Sie das Deckglas mit der Zellenseite nach oben auf eine wärmeleitende RC-26-Aluminium-Bildgebungskammer. Legen Sie dann eine Kunststoffversiegelung auf das Deckglas, um eine sichere Abdichtung zwischen dem Deckglas und der Kammer zu gewährleisten, und befestigen Sie sie, indem Sie die Kunststoffversiegelung mit den Schiebeklammern der Kammer verschrauben, um ein Auslaufen des Mediums zu verhindern. Pipettieren Sie nun 37 Grad Celsius vorgewärmtes Mikroskopiemedium in den zentralen Bereich.Setzen Sie den Wärmemelder in den dafür vorgesehenen Schlitz der Kammer ein und verbinden Sie die Elektroden der Kammer mit einem automatischen Temperaturregler TC-324B, der eine konstante Temperatur von 37 Grad Celsius aufrechterhält. Zentrifugieren Sie eine zuvor aufgetaute Proteinlösung bei 10.000 g für mindestens 30 Minuten, um Proteinaggregate zu entfernen, die zu einer Verstopfung der Nadel führen können, wenn sie in der Mikroinjektionskapillare vorhanden sind. Laden Sie mit einer flexiblen Pipettenspitze eine Mikroinjektionsnadel mit einem Mikroliter Proteinlösung von der Rückseite.Wenn Luftblasen in der Nadelspitze vorhanden sind, klopfen Sie vorsichtig auf den Nadelboden, um sie zu entfernen. Stellen Sie dann den Nadelhalter vorsichtig an der Mikromanipulationsvorrichtung ein. Nachdem Sie die Mikroinjektionsnadel in den Nadelhalter eingeschraubt haben, üben Sie mit einem Mikroinjektionsdruckgerät Druck auf die Nadel aus, bevor Sie die Nadelspitze in das Zellkulturmedium verschieben.Positionieren Sie dann die Nadel mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Sichtfeld, suchen Sie dann eine interessante Zelle und senken Sie die Nadel allmählich über die Zelle. Berühren Sie für die Mikroinjektion vorsichtig die Plasmamembran der Zelle, die ausreichen kann, um in die Zelle einzudringen oder einen vorübergehenden Membranbruch durch ein sehr sanftes Klopfen auf das Mikroskop zu unterstützen. Stoppen Sie den Injektionsvorgang, sobald der Durchfluss in die Zelle sichtbar ist, indem Sie die Nadelspitze nach oben in das Medium bewegen.Wechseln Sie vor dem Auslösen des Lasers auf den GFP-Kanal und starten Sie die Bildzeitrafferaufnahme. Zeichnen Sie anschließend manuell den zu photogebleichten Bereich auf dem GFP-Kanal, während Sie die Anzeige betrachten. Starten Sie das Photobleaching durch einen manuellen Auslöser des 405-Nanometer-Lasers mindestens drei bis vier Bilder nach Beginn der Bildaufnahme.Stellen Sie die GFP 488-Nanometer-Bilderfassung in der Software auf eine Belichtungszeit von 500 Millisekunden und ein Zeitintervall von 1500 Millisekunden ein. Passen Sie als Nächstes die Softwareeinstellungen für die Aufnahme von Zweikanal- oder Dreikanal-Zeitrafferfilmen an, indem Sie das Quadrat der Wellenlängenreihe markieren und die gewünschte Anzahl von Kanälen im Menü "Wellenlänge erfassen" auswählen. Starten Sie vor dem Auslösen des Lasers die Bildzeitrafferaufnahme und zeichnen Sie den zu photoaktivierenden Bereich manuell auf dem Phasenkontrastkanal, während Sie das Display betrachten.Anschließend wird die Photoaktivierung durch einen manuellen Auslöser des 405-Nanometer-Lasers mindestens drei bis vier Bilder nach Beginn der Bildaufnahme eingeleitet. Um die FRAP-Ergebnisse zu analysieren, öffnen Sie die von VisiView abgeleiteten Zeitrafferfilme in der MetaMorph-Software. Leiten Sie Intensitätswerte der photogebleichten Bereiche für jeden Zeitpunkt der Fluoreszenzwiederherstellung ab, indem Sie die jeweiligen Regionen manuell mit MetaMorph zeichnen.Zeichnen Sie eine Form an der Spitze des Lamellipodiums, die den gesamten oder einen Teil des photogebleichten Bereichs abdeckt, und passen Sie die Position bei Bedarf manuell in den nachfolgenden Bildern an, um die Veränderungen der lamellipodalen Intensitäten der jeweiligen Region im Laufe der Zeit während der Verschiebung der vorrückenden Spitze zu verfolgen. Zur Korrektur des Hintergrunds und zur Photobleaching-Erfassung werden Regionen außerhalb bzw. innerhalb der Zellen analysiert. Sobald ein Bereich von Interesse ausgewählt ist, extrahieren Sie seine Intensitätswerte auf MetaMorph, indem Sie das Menü "Bereichsmessungen messen" verwenden.Stellen Sie sicher, dass die Optionen für die verstrichene Zeit und die durchschnittliche Intensität im Konfigurationsmenü ausgewählt sind. Klicken Sie auf Protokoll öffnen und wählen Sie Dynamischer Datenaustausch. Klicken Sie dann auf OK, um eine Excel-Tabelle zu öffnen, und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Protokoll öffnen, um die MetaMorph-Werte in Excel einzufügen.Verwenden Sie die von MetaMorph abgeleiteten Intensitätswerte, um FRAP-Fluoreszenzwiederherstellungskurven zu berechnen, indem Sie die Intensitätswerte in eine Excel-Tabelle mit den entsprechenden Formeln einfügen. Die Fluoreszenzerholung des photogebleichten Bereichs wird auf den Hintergrund und die Innenbereiche normalisiert. Um die Halbwertszeit der Fluoreszenzwiederherstellung zu berechnen, fügen Sie die Werte der Fluoreszenzwiederherstellungskurven mit den entsprechenden Zeiten in SigmaPlot ein und führen Sie dann eine Kurvenanpassung mit dem Werkzeug Exponentieller Anstieg auf Maximum des dynamischen Anpassungsassistenten durch und wählen Sie je nach bester Kurvenanpassung die mono- oder biexponentielle Funktion aus.Die Parameter, die durch das Lösen der ausgewählten Funktion erhalten werden, können in eine Excel-Tabelle eingefügt werden, die die entsprechende Formel enthält, die es ermöglicht, die jeweilige halbe Erholungszeit in Sekunden zu berechnen. Um die Diffusion von photoaktivierbarem Aktin nach der Aktivierung sowie seine Akkumulation in einer bestimmten Region, wie z.B. dem Lamellipodium, zu messen, verwenden Sie MetaMorph, um die Intensitäten im Laufe der Zeit in den jeweiligen Regionen sowie außerhalb der Zelle zu bestimmen, um die Hintergrundfluoreszenz für die Normalisierung zu bestimmen. Um die genaue Geschwindigkeit der Verschiebung von photoaktivierbarem Aktin weg von der Aktivierungsregion oder seine Einbaurate innerhalb des Lamellipodiums zu untersuchen, generieren Sie Fluoreszenzkurven aus Daten, die zuvor von MetaMorph abgeleitet wurden.Fügen Sie die Intensitätswerte für den für die Normalisierung verwendeten Hintergrundbereich, den photoaktivierten zytosolischen Bereich oder den zu untersuchenden lamellipodalen Bereich in eine Excel-Tabelle mit entsprechenden Formeln ein. Hier sind Gesichtskontrastbilder einer NIH 3T3-Fibroblastenzelle vor und nach der Mikroinjektion der kleinen GTPase Rac1 zu sehen. Etwa 12 Minuten nach der Mikroinjektion hat die Zelle ihre Morphologie verändert, was auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.Das Recycling von gebleichtem EGFP VASP durch ungebleichte Moleküle an der Lamellipodiumspitze ist hier zu sehen. In diesem speziellen Beispiel erreicht die Erholungsfluoreszenz ein Plateau bei etwa 80 % der Fluoreszenz vor dem Bleichen. Nach der Photoaktivierung diffundiert photoaktiviertes GFP-Aktin schnell aus der zytosolischen Region.Ein Teil der photoaktivierten Aktinmonomere verlagert sich nach vorne, was zu einem schnellen Fluoreszenzausbruch bei Lamellipodien führt. Der Einbau von Fluoreszenz ist in Lamellipodien, die weit von der photoaktivierten Region entfernt sind, erfreulich geringer, da der Anteil der photoaktivierten Aktinmonomere auf ihrem Weg durch das Zytosol mit nicht aktivierten Monomeren verdünnt wird. Da photoaktiviertes GFP-Aktin im Laufe der Zeit von der photoaktivierten Region weg diffundiert, wird es kontinuierlich durch nicht-photoaktiviertes, nicht-fluoreszierendes Aktin ersetzt.Als Folge davon ist eine allmähliche Abnahme der Fluoreszenzintensität dieser Region zu beobachten. Im Laufe der Zeit bauen Lamellipodien in der Nähe der zytosolischen Aktivierungsregion schnell fluoreszierendes Aktin ein. Der folgende Abfall der Fluoreszenz ist einfach auf die Aktin-Depolymerisation und die Monomerdiffusion weg vom Lamellipodium zurückzuführen.Wenn also Experimente an einem einzigen Mikroskopiesystem durchgeführt werden, kann die Kombination aus Mikroinjektion und entweder FRAP- oder Photoaktivierungstechniken realistischerweise in wenigen Minuten durchgeführt werden, abhängig von der Art der untersuchten Proteine. Denken Sie immer daran, sich vor, während und nach der Mikromanipulation oder nach der Einwirkung von Laserlicht bei Laune zu halten. Für FRAP und Photoaktivierung ist es besonders wichtig, dass die ausgewählte Region ihre strukturelle Integrität während der gesamten Dauer des Films beibehält.Das Mikroinjektionsverfahren kann durch die lokale Anwendung von Plasmamembran-permeablen Arzneimitteln oder Zytoskelett-Inhibitoren ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen bestimmter Behandlungen auf subzellulärer Ebene zu behandeln. Mikromanipulationstechniken haben den Weg geebnet, um die Diffusionseigenschaften und die subzelluläre Dynamik von Komponenten und Komplexen des Zytoskeletts zu erforschen und die Signalwege aus zweiter Hand zu verstehen, die die zelluläre Morphogenese regulieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die raumzeitliche Dynamik von zytosolischen Proteinen, von Proteinen, die in den Akt innerhalb des Zytoskeletts eingebaut sind oder sich in verschiedenen subzellulären Organellen befinden, verfolgen und überwachen können, um letztendlich die Kinetik der Zellregulation zu entschlüsseln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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