Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Immunogenität und Bioanalytik über den Einfluss neutralisierender Antikörper auf die Arzneimittelsicherheit, Wirksamkeit sowie pharmakokinetische und pharmakodynamische Profile zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine empfindliche und biologisch relevante zellbasierte Methode zur semiquantitativen Messung von arzneimittelspezifischen neutralisierenden Antikörpern bietet. Bei dieser Technik gelangen Fluorophor-markierte Enzyme durch die Bindung eines Mannose-6-Phosphat-Rests an den Kationenunabhängigen Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder CI-M6PR in Jurkat-Zellen.

Neutralisierende Antikörper, die die Enzymrezeptor-Interaktion verhindern, induzieren eine Abnahme der Fluoreszenz, gemessen durch Durchflusszytometrie. Säen Sie zunächst 7,5 mal 10 bis 4 Jurkat-Zellen in 100 Mikrolitern Zellwachstumsmedium pro Well in einer 96-Well-Zellkulturplatte mit rundem Boden für eine 14- bis 20-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit aus. Verdünnen Sie die Proben zunächst in serumfreiem Medium im Verhältnis eins zu 2,5.

Geben Sie dann 60 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus weißem, nicht bindendem Polypropylen mit rundem Boden. Dies wird die Probeninkubationsplatte sein. Bei Proben, die positiv getestet wurden und bestätigt werden müssen, vortexen Sie ein Fläschchen mit Enzymersatztherapie- oder ERT-Kügelchen und geben Sie die entsprechende Anzahl von Kügelchen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen für eine weitere Vortexing.

Legen Sie dann das Röhrchen für zwei Minuten in ein magnetisches Röhrchengestell und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie nach der vierten Wäsche 100 Mikroliter Kügelchen in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen weißen 96-Well-Polypropylenplatte mit rundem Boden. Wenn alle Kügelchen plattiert sind, legen Sie die Platte auf einen 96-Well-Magneten mit seitlichem Rand und lassen Sie die Kügelchen ein Pellet bilden, bevor Sie den durchsichtigen Überstand vorsichtig entfernen.

Geben Sie anschließend 140 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen und verschließen Sie die Platte mit Kunststofffolie, um sie mindestens 60 Minuten lang auf einem Rotationsschüttler bei ca. 800 U/min bei Raumtemperatur zu schütteln. Setzen Sie dann die Bestätigungsplatte auf den 96-Well-Magneten mit seitlichem Rand, damit die Kügelchen ein weiteres Pellet bilden können, und geben Sie 60 Mikroliter Probe in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Inkubationsplatte aus Polypropylen mit weißem, nicht bindendem Polypropylen-Boden. Bei Proben, die gescreent wurden und sich als positiv erwiesen haben, kann eine Titerreihe durchgeführt werden.

Um eine Titerreihe herzustellen, verdünnen Sie die Probe in der gepoolten Matrix nacheinander so oft, dass der vorbestimmte Titer-Grenzwert überschritten wird, und fügen Sie 60 Mikroliter jeder verdünnten Probe in die entsprechenden Vertiefungen der Probeninkubationsplatte und 60 Mikroliter der entsprechenden Konzentrationen von fluorophormarkiertem ERT in die entsprechenden Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte aus weißem, nicht bindendem Polypropylen mit rundem Boden gemäß dem Textprotokoll hinzu. Pipettieren Sie dann die Fluorophor-ERT-Probenlösung mehrmals, um sie zu mischen, und wickeln Sie die Platten für eine 14- bis 20-stündige Inkubation bei zwei bis acht Grad Celsius in Folie ein. Am nächsten Morgen erwärmen Sie die Probenplatten 10 bis 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Bead-Bad und überprüfen Sie die plattierten Zellen an einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund und gleichmäßig über die Vertiefungen verteilt sind.

Wenn sich die Platten erwärmt haben, geben Sie 100 Mikroliter Probe und fluorophormarkiertes ERT-Gemisch gemäß der experimentellen Plattenkarte auf die Zellplatte und bringen Sie die Zellen für weitere drei Stunden und 15 Minuten in den Zellkulturinkubator zurück. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und bestätigen Sie das Vorhandensein eines Pellets am Boden jeder Vertiefung. Halten Sie die Platte in einem Winkel von 30 bis 45 Grad, entfernen Sie vorsichtig den Überstand in jeder Vertiefung, ohne die Pellets zu stören, und waschen Sie die Zellen dreimal in 200 Mikrolitern DPBS pro Vertiefung und Zentrifugation.

Geben Sie nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter lebenden toten Fleck in jede Vertiefung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen die Zellen mit 200 Mikrolitern DPBS pro Well. Resuspendieren Sie die gewaschenen Pellets in 100 Mikrolitern mit zwei bis acht Grad Celsius 1 % Paraformaldehyd pro Vertiefung und versiegeln Sie die Platte für eine sanfte Impulswirbelbildung.

Wickeln Sie die Platte dann für eine 10-minütige Fixierung bei zwei bis acht Grad Celsius in Folie ein. Um die Lebensfähigkeit der Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, mischen Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern DPBS pro Well, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und lesen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer gemäß den Standard-Durchflusszytometrieprotokollen ab. Die Fluorophor-konjugierte ERT-Aufnahme kann dann anhand der Medianen Fluoreszenzintensität (MFI) der lebenden Einzelzellen beurteilt werden.

Vor der Prüfung im Assay wird ein experimenteller Screening-Cutpoint als Schwellenwert für die Bestimmung der positiven und negativen Proben berechnet. In diesem Beispiel sind Qualitätskontrollen dargestellt, die mit hohen oder niedrigen Mengen an neutralisierenden Antikörpern versetzt wurden. Positive Proben werden dann in einem Bestätigungsassay mit konjugierten magnetischen Beads getestet, um den arzneimittelspezifischen Antikörper aus den Proben zu depletieren.

Proben mit einem Wiederfindungsverhältnis, das über dem Bestätigungsgrenzwert liegt, gelten als positiv. Proben, die gescreent und als positiv bestätigt wurden, werden seriell verdünnt und im Titerassay getestet, um den relativen Titer der neutralisierenden Antikörper in jeder Probe zu bestimmen. Titer ist der interpolierte Wert zwischen zwei Verdünnungen, die den Titer-Grenzwert überschreiten.

Hier gezeigt, bewerteten die lebenden einzelligen MFIs die Fluorophor-konjugierte ERT-Aufnahme. Zum Beispiel hemmte in diesem Experiment die Matrix, die mit dem Positivkontroll-Antikörper gespickt war, die Fluorophor-konjugierte ERT-Aufnahme, was zu einer niedrigen medianen Fluoreszenzintensität führte. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit der Matrix in Abwesenheit des Positivkontroll-Antikörpers inkubiert wurden, eine höhere mediane Fluoreszenzintensität, was auf die Aufnahme des Fluorophor-konjugierten ERT hinweist.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, strenge Inkubationsfenster einzuhalten, um zuverlässige und konsistente Ergebnisse zu erzielen. Es ist auch wichtig, den Assay für jede Enzymersatztherapie zu optimieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Immunogenitäts- und Bioanalytiker in der Arzneimittelentwicklung, um den Einfluss der Zellaufnahme neutralisierender Antikörper auf die Sicherheit und Wirksamkeit von ERT zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben äußerst gefährlich sein kann und dass alle Proben bei der Durchführung dieses Verfahrens so behandelt werden sollten, als wären sie potenziell infektiös.