Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, T-Zell-Antworten auf Antigene von Interesse zu detektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Capture-Antikörpern kodiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Zellen und Antigene von Interesse hinzuzufügen und dann über Nacht zu inkubieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Zugabe von Nachweisantikörpern. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Entwicklung der Platte mit Substratreagenzien und die Analyse von Flecken. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch die Analyse von Spotforming-Einheiten die interessierenden Zytokine auswählen.

Hallo, mein Name ist Dr.Ki Richter und ich bin Forschungsdozent im Labor von Dr. Wonder Drake an der Vanderbilt University in der Abteilung für Infektionskrankheiten. Heute demonstrieren wir die Ellie-Spot-Technik, die auch als Enzyme Linked Immuno Spot Assay bekannt ist. Dr. Isfahan Chambers und Tiffany Cone werden Ihnen heute die Technik demonstrieren.

Um die Standards der Zellkultur aufrechtzuerhalten, führen Sie Manipulationen unter sterilen Bedingungen in der Haube durch, öffnen Sie eine verbündete Spotplatte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Bereiten Sie eine Beschichtungslösung des Fängerantikörpers in PBS vor. Gut mischen, indem Sie es der Einfachheit halber vortexen.

Übertragen Sie die Antikörperlösung in ein Reservoir für den Mehrkanal, pipettieren Sie und aliquotieren Sie jeweils 100 Mikroliter Beschichtungslösung. Die Platte gut mit Perfil verschließen und über Nacht in den Kühlschrank stellen. Diese mit Antikörpern beschichteten Platten sind wochenlang gut.

Als Faustregel gilt, dass eine Platte verwendet werden kann, wenn sich noch Flüssigkeit in den Vertiefungen befindet. Um die Zellen für diesen Assay vorzubereiten, färben Sie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut mit Trienblau auf Lebensfähigkeit und zählen Sie sie: Plattieren Sie das pbmc bei 2 Millionen Zellen pro Milliliter in unseren 10 Medien und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Um den Überblick über das Experiment zu behalten, beschriften Sie den Deckel der Ali-Spotplatte mit der Probenidentifikationsnummer, den Well-Bedingungen und dem Datum.

Waschen Sie die Platte sechsmal mit sterilem PBS nach der Dump-and-Blot-Methode. Achten Sie darauf, dass Sie die Platte beim Entleeren nicht bespritzen, da dies dazu führen kann, dass sich die Vertiefungen der Platte violett verfärben. Geben Sie unsere 20 Medien in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Während die Platte inkubiert, zählen Sie die Zellen, die über Nacht geruht haben. Ernten Sie das pbmc durch Zentrifugation. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in unseren 10 Medien bei einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter.

Nach der einstündigen Inkubation der verbündeten Spotplatte wird das R 20-Medium mit der Dump-and-Blot-Methode entfernt. Achten Sie darauf, dass Sie die Platte beim Entleeren nicht bespritzen. Fügen Sie jeweils 100 Mikroliter Zellsuspension hinzu.

Nun folgen Sie dem Versuchsdesign mit Zugabe von Peptiden und Antigenen in die entsprechenden Testvertiefungen. Schließen Sie immer eine Negativkontrolle von Zellen ohne Peptide und auch Positivkontrollvertiefungen mit zugesetztem Phyto-Hämagglutinin ein. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Platte sechsmal mit 150 Mikrolitern eines XPBS nach der Dump-and-Blot-Methode. Geben Sie 100 Mikroliter PBS in jede Vertiefung der Platte und stellen Sie die Platte 15 Minuten lang in den Kühlschrank oder bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Biotin-Antikörperlösung in PBS vor.

Nehmen Sie die ALI-Spotplatte aus dem Kühlschrank und entsorgen Sie das PBS, indem Sie es in den Papierkorb werfen. Achten Sie darauf, die Platte nicht zu bespritzen, während Sie ein Aliquot der Biotin-Antikörperlösung in jede Vertiefung kippen, und inkubieren Sie die Platte in der Gewebekulturhaube eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte beim letzten Waschgang sechsmal mit PBS nach der Dump-and-Blot-Methode.

Lassen Sie das PBS jetzt auf dem Teller. Bereiten Sie die STREPTAVIDIN-Antikörperlösung in PBS vor und stellen Sie sicher, dass die Lösung zum Mischen vortext. Entsorgen Sie die letzte PBS-Wäsche aus den Vertiefungen und plotten Sie die ALI-Spotplatte.

Geben Sie Streptavidin-Antikörperlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte in der Gewebekulturhaube eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Um überschüssige Trevain-Antikörper zu entfernen, waschen Sie die Platte sechsmal mit PBS unter Verwendung der Dump-and-Blot-Methode, führen Sie das PBS beim letzten Waschgang auf die Platte. Angesichts der Lichtempfindlichkeit der alkalischen Phosphatase-Substratlösung B-C-I-P-M-B-T.

Arbeiten Sie bei der Zubereitung der Stiellösung im Dunkeln, wie von den Herstellern in den Anweisungen für das alkalische Phosphatase-Substrat-Kit beschrieben, entsorgen Sie das restliche PBS aus den Vertiefungen und tupfen Sie die Spot-Platte ab. Geben Sie Substratlösung in jede Vertiefung und schalten Sie das Licht ein. Lassen Sie die Reagenzien nach fünf bis 10 Minuten Farbentwicklung auf der Platte verbleiben, bis die Flecken anfangen, sich violett zu verfärben und ziemlich dunkel sind.

Dies dauert bis zu 20 Minuten. Waschen Sie die Ali Spot Platte dreimal mit Leitungswasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Jede Platte enthält eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle und ein Peptid of Interest, die mindestens in doppelter Ausführung durchgeführt werden.

Die positiven Kontrollvertiefungen haben eine tiefviolette Farbe, reflektieren eine konfluente Zellschicht und kaum einen weißen Hintergrund. Die negativen Kontrollvertiefungen haben erwartungsgemäß keinen violetten Hintergrund und keine Flecken. Die Testmuster-Wells veranschaulichen hier zelluläre Reaktionen auf mikrobielle Peptide.

Die violetten Flecken stellen eine einzelne reaktionsfähige Zelle dar, die das Zytokin exprimiert, das bei der Durchführung der LA-Spot-Technik von Interesse ist. Bitte achten Sie darauf, die Membran nicht mit den Pipettenspitzen zu durchstechen oder Ihre Platte austrocknen zu lassen, da dies zu einem hohen Hintergrund führt.