Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, T-Zell-Antworten auf Antigene von Interesse nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Immobilisierungsantikörpern kodiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Zellen und die Antigene von Interesse hinzuzufügen und anschließend über Nacht zu inkubieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht im Hinzufügen von Nachweisantikörpern. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Entwicklung der Platte mit Substratreagenzien und die Analyse der Flecken. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Zytokine von Interesse durch die Analyse von spotbildenden Einheiten auswählen.

Hallo, mein Name ist Dr. Ki Richter und ich bin wissenschaftlicher Assistent in Dr. Wonder Drakes Labor an der Vanderbilt University in der Abteilung für Infektionskrankheiten. Heute demonstrieren wir die ELISpot-Technik, auch bekannt als enzymgekoppelte Immunospot-Assay. Dr. Isfahan Chambers und Tiffany Cone werden Ihnen die Technik heute vorführen.

Um die Zellkulturstandards aufrechtzuerhalten, führen Sie die Manipulationen unter sterilen Bedingungen im Sicherheitswerkbank durch, öffnen Sie eine Ally-Spot-Platte und waschen Sie diese dreimal mit PBS. Bereiten Sie eine Beschichtungslösung des Capture-Antikörpers in PBS vor. Mischen Sie gut durch Vortexen, um die Handhabung zu erleichtern.

Übertragen Sie die Antikörperlösung in ein Reservoir für den Mehrkanalpipettierer und pipettieren Sie 100 Mikroliter der Beschichtungslösung in jedes Loch. Versiegeln Sie die Platte mit Perfil und stellen Sie sie über Nacht in einen Kühlschrank. Diese mit Antikörpern beschichteten Platten sind wochenlang haltbar.

Als Faustregel gilt, dass eine Platte verwendet werden kann, wenn sich noch Flüssigkeit in den Vertiefungen befindet. Um die Zellen für diesen Assay vorzubereiten, färben Sie frisch isolierte periphere mononukleäre Blutzellen mit Trypanblau zur Bestimmung der Vitalität und zählen Sie diese. Säen Sie die PBMCs mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro Milliliter in unserem 10-Medium aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Um den Überblick über das Experiment zu behalten, beschriften Sie den Deckel der ELISpot-Platte mit der Probenidentifikationsnummer, den Bedingungen der Vertiefungen und dem Datum.

Waschen Sie die Platte sechs Mal mit steriler PBS unter Verwendung der Ausgieß- und Abtupfmethode. Achten Sie darauf, beim Ausgießen nicht zu spritzen, da dies dazu führen könnte, dass die Vertiefungen der Platte lila verfärben. Geben Sie unser 20er-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Während die Platte inkubiert wird, zählen Sie die Zellen, die über Nacht ruhten. Gewinnen Sie die PBMCs durch Zentrifugation. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in unserem 10-Medium bei einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter.

Nach der einstündigen Inkubation der Ally-Testplatten entfernen Sie das R 20-Medium mit der Ausgieß-und-Antupf-Methode. Achten Sie darauf, dass beim Ausgießen keine Spritzer entstehen. Geben Sie 100 Mikroliter Zellsuspension zu jeder hinzu.

Wir befolgen das experimentelle Design mit der Zugabe von Peptiden und Antigenen zu den entsprechenden Testmulden. Führen Sie stets eine negative Kontrolle mit Zellen ohne Peptide sowie positive Kontrollmulden mit zugesetztem Phytohämaggglutinin durch. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Platte sechs Mal mit jeweils 150 Mikrolitern 1× PBS unter Verwendung der Ausgieß- und Abtupfmethode. Geben Sie 100 Mikroliter PBS in jedes Loch der Platte und stellen Sie die Platte 15 Minuten lang in den Kühlschrank oder bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Biotin-Antikörper-Lösung in PBS vor.

Nehmen Sie die ALI-Spot-Platte aus dem Kühlschrank und entsorgen Sie das PBS, indem Sie es in den Abfalleimer abschütteln. Geben Sie vorsichtig einen Aliquot der Biotin-Antikörperlösung in jedes Loch, ohne die Platte zu verschütten, und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Zellkulturlaminarflusswerk. Waschen Sie die Platte sechsmal mit PBS, wobei Sie beim letzten Waschgang die Dump-and-Blot-Methode anwenden.

Lassen Sie das PBS nun auf der Platte. Bereiten Sie die STREPTAVIDIN-Antikörperlösung in PBS vor und wirbeln Sie die Lösung gründlich um, um sie zu mischen. Entsorgen Sie die letzte PBS-Waschung aus den Vertiefungen und platzieren Sie die ALI-Spot-Platte.

Fügen Sie die Streptavidin-Antikörper-Lösung zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Zellkulturwerk. Um überschüssigen Trevain-Antikörper zu entfernen, waschen Sie die Platte sechsmal mit PBS, wobei Sie beim letzten Waschgang die Dump-and-Blot-Methode anwenden und das PBS auf die Platte geben. Berücksichtigen Sie die Lichtempfindlichkeit der B-C-I-P-M-B-T-Alkalischen-Phosphatase-Substratlösung.

Arbeiten Sie bei der Zubereitung der Substratlösung im Dunkeln, wie in den Anweisungen des Alkalischen-Phosphatase-Substrat-Kits beschrieben. Entsorgen Sie das verbleibende PBS aus den Vertiefungen und tupfen Sie die Ly-Spot-Platte ab. Geben Sie die Substratlösung in jede Vertiefung und schalten Sie das Licht ein. Lassen Sie die Reagenzien nach fünf bis zehn Minuten Farbentwicklung so lange auf der Platte, bis die Flecken beginnen, sich violett zu färben und deutlich dunkel werden.

Das dauert bis zu 20 Minuten. Spülen Sie die Ali-Spot-Platte dreimal mit Leitungswasser aus und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Jede Platte enthält eine positive Kontrolle, eine negative Kontrolle und das Peptid der Untersuchung, jeweils mindestens im Duplikat.

Die positiven Kontrollgefäße weisen eine dunkelviolette Farbe auf, die eine konfluente Zellschicht widerspiegelt, und zeigen kaum einen weißen Hintergrund. Die negativen Kontrollgefäße weisen wie erwartet keinen violetten Hintergrund und keine Flecken auf. Die Testprobengefäße veranschaulichen hier die zellulären Reaktionen auf mikrobielle Peptide.

Die violetten Flecken repräsentieren eine einzelne reaktive Zelle, die das Zytokin von Interesse exprimiert, wenn die LA-Spot-Technik durchgeführt wird. Achten Sie darauf, die Membran nicht mit den Pipettenspitzen zu durchstechen und vermeiden Sie, dass Ihre Platte austrocknet, da dies zu einem hohen Hintergrund führen würde.