TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stoffwechselforschung zu beantworten, z. B. ob bestimmte Lebensstilinterventionen wie Bewegung bestimmten Personen zugute kommen können. Oft haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, Larven im ersten Stadium zu identifizieren. Der Schlüssel ist, Larven zu sammeln, die fast so groß wie die Eier sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Bewegung unter vielen experimentellen Bedingungen und Genotypen zu bewerten. Zuerst werden für jede Versuchsgruppe Legekammern zusammengebaut. Tragen Sie einen Klecks Hefepaste auf eine Apfelsaft-Agar-Platte auf und befestigen Sie die Platte an einer Plastikflasche mit einem Gewicht von sechs Unzen.

Apfelsaft-Agar-Platten werden hergestellt, indem eine 3%ige Agar-Lösung in gekauftem Apfelsaft hergestellt wird. Und dann füllen Sie 35 x 10 Millimeter große Schalen zu 3/4 der Wand hinauf. Hefepaste wird hergestellt, indem gekaufte aktive Trockenhefe mit Wasser in einem Verhältnis von etwa zwei Millilitern destilliertem Wasser pro Gramm Hefe gemischt wird.

Halten Sie die Paste locker abgedeckt, damit sie entgasen kann, und tragen Sie etwa drei Millimeter Kleckse auf jede Platte auf. Die Flasche aus Polypropylen muss mit kleinen Löchern zur Belüftung vorbereitet werden. Nachdem Sie die Komponenten für die Kammer vorbereitet haben, fahren Sie mit der Beladung der Erwachsenen fort.

Sobald die erwachsenen Tiere des gewünschten Genotyps alle in der Flasche sind, verschließen Sie die Flasche mit der Platte und sichern Sie die Montage mit Gummibändern. Um eine ausreichende Anzahl erwachsener Fliegen für die Legekammern sicherzustellen, muss man wahrscheinlich mehrere Generationen vor dem geplanten Experiment mit der Bildung von Populationszahlen beginnen. Wechsle nun die Apfelsaft-Agar-Platten zweimal täglich, einmal morgens und einmal abends.

Lassen Sie dann die Eier auf den gesammelten Platten 12 bis 24 Stunden lang zu ersten Larven im Stadium entwickeln. Um diese Larven zu sammeln, verwenden Sie einen dünnen Pinsel oder eine Spitzhacke aus einer flexiblen, dünnen Nadel und einem Griff. Für jede Versuchsgruppe werden 50 Larven des ersten Stadiums in ein Fläschchen mit frischem Futter umgefüllt und bis zum Erwachsenenalter entwickelt.

Um sicherzustellen, dass Sie in der Lage sind, genügend Larven für jedes Ihrer Replikate zu sammeln, stellen Sie sicher, dass Forscher verfügbar sind, die effizient Larven sammeln, um die Anzahl zu erhalten, die Sie benötigen. Nach der Verpuppung sammeln Sie die Puppen, indem Sie sie zuerst mit einem kleinen feuchten Pinsel anfeuchten. Schöpfen Sie dann mit einem Spatel vorsichtig Puppen von den Seiten der Fläschchen ab.

Laden Sie die Puppen in leere Fläschchen. Übertragen Sie dann die Erwachsenen nach dem Lösen in Standard-Futterfläschchen. Ein bis fünf Tage nach der Eklosion trennen Sie die Fliegen nach Geschlecht und teilen Sie jedes Geschlecht in zwei Gruppen ein, experimentell und kontrolliert.

Halten Sie die erwachsenen Tiere bei 50 Fliegen pro Durchstechflasche. Geben Sie den Fliegen alle zwei Tage frische Fläschchen mit lebender Hefe. Während es möglich ist, Erwachsene ohne Lebendhefe-Supplementierung zu halten, haben wir festgestellt, dass Erwachsene mit dem Präparat bessere Leistungen erbringen.

Die Supplementierung mit Lebendhefe ist eine Variable, die Forscher an ihre spezifischen Forschungsziele anpassen können. Das Trainingsgerät verwendet ein einfaches Riemen- und Flaschenzugsystem, das von einem Motor mit variabler Drehzahl angetrieben wird. Entfernen Sie vor der Verwendung des Trainingsgeräts alle daran befestigten Fläschchen und kalibrieren Sie die Motordrehzahl mit dem Netzteil so, dass eine volle Rotationsperiode 15 Sekunden beträgt.

Um die Drehzahl zu messen, befestigen Sie einen kleinen Pinsel an der Motorabdeckung und positionieren Sie den Pinsel so, dass er eine der drehbaren Halterungen berührt. Messen Sie dann die Anzahl der Umdrehungen, indem Sie die Kontakte der Bürste und der Halterung pro Minute zählen. Fahren Sie mit einem kalibrierten Gerät mit dem ersten Tag des Trainings fort, normalerweise einem Montag.

Schieben Sie die Stopfen der Fläschchen in die Fläschchen. Lassen Sie den Fliegen einen Zentimeter Platz in Kontrollfläschchen und sechs Zentimeter Platz in Übungsfläschchen. Legen Sie nun die Fläschchen in die Klammern und lassen Sie die Fliegen mit 10 Minuten akklimatisieren.

Das Trainingsgerät kann bis zu 48 Fläschchen aufnehmen. Die Raumtemperatur sollte während des mehrtägigen Eingriffs konstant bleiben oder das Trainingsgerät passt auf Wunsch in einen Inkubator. Das Versuchsdesign besteht aus fünf aufeinanderfolgenden Bewegungstagen pro Woche.

Jeder Bewegungstag enthält abwechselnd Bewegungs- und Ruhephasen. An jedem Tag werden fünf Minuten zu einer der Übungsperioden addiert, so dass sich bei einer Fünf-Tage-Woche alle vier Übungsperioden um fünf Minuten verlängern. Sobald sich die Fliegen akklimatisiert haben, beginnen Sie mit der ersten Übungsperiode.

Lassen Sie die Maschine 15 Minuten lang laufen. Lassen Sie die Fläschchen während der fünfminütigen Pause zwischen den Perioden auf den Klammern. Nachdem Sie den vierten Übungszyklus abgeschlossen haben, bringen Sie die Stopfen des Futterfläschchens wieder in ihre normale Position und legen Sie die Fliegen wieder in ihren Inkubator.

Um festzustellen, ob das Training auf dem TreadWheel die Stoffwechseleigenschaften beeinflusst, wurde die Triglyceridspeicherung in Oregon R und gelben weißen Fliegen gemessen und gegen die Proteinkonzentration der Fliegen normalisiert. Die statistische Analyse ergab einen signifikanten Genotyp durch körperliche Interaktion, der die Triglyceridspeicherung beeinflusst. Es gab auch einen signifikanten sexuell dimorphen Effekt, bei dem Männer mehr Triglyceride speicherten als Frauen.

Weibliche trainierte Fliegen hatten signifikant niedrigere Triglyceridspiegel als ihre untrainierten Artgenossen. Dies wurde bei Männchen nicht beobachtet. Als nächstes wurden die Fliegen mit variabler Ernährung aufgezogen, dem Trainingsprogramm unterzogen und dann mit einem RING-ähnlichen negativen Geotaxis-Assay getestet.

Die Weibchen kletterten signifikant höher, wenn sie mit der fettreichen Diät aufgezogen wurden, als mit jeder anderen Behandlung. Bei den Männchen verbesserte Bewegung das Klettern erst, wenn sie mit einer normalen Ernährung aufwuchsen. Eine fettreiche Ernährung hatte keine Wirkung.

Interessanterweise gab es bei Hündinnen aus der DGRP 153-Linie eine Abnahme der Kletterleistung nach dem Training, wenn sie mit normaler Ernährung aufwuchsen. Daher ist Bewegung möglicherweise nicht für alle Genotypen eine einheitlich positive Intervention. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Hämolymphglukose-Assays oder Lebensdaueranalysen durchgeführt werden, um die Wirkung von Bewegung auf Typ-II-Diabetes oder die Langlebigkeit zu beurteilen.

Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Genetik und des Stoffwechsels, die Rolle von Bewegung bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Gesundheit im Modellorganismus Drosophila zu untersuchen.