Hochauflösendes Video Tracking von Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Beim Video-Tracking-Assay müssen die Fliegen ohne Anästhesie in eine quadratische Beobachtungskammer geladen werden. Dazu muss ein kleiner Trichter mit Schraubenlöchern in der Kammer aufgereiht werden, um die Fliegen in die Kammer zu schlagen. Mit Hilfe dieses Trichters werden dann die Löcher der Kammer mit Schrauben verschlossen und durch die Lüftungsschlitze ein Luftimpuls abgegeben, um die Fortbewegung einzuleiten.

Eine Videokamera, die über der Kammer hängt, erfasst diese Fortbewegung und sendet sie an einen Computer, wo die Wege der Fliegen verfolgt und analysiert werden. Hallo, ich bin Justin Slawson vom Griffith Lab hier am Biology Department der Brandeis University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur hochauflösenden Videoverfolgung der Fortbewegung

Wir werden dieses Verfahren in unserem Labor verwenden, um das Verhalten von Fortbewegungen bei erwachsenen Fliegen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Um mit dem Experiment zu beginnen, züchten Sie Fliegen und Flaschen mit hefefreien Standardmedien.

Dieses Protokoll erfordert eine große Anzahl von Fliegen, so dass Kreuzungen entsprechend eingerichtet werden müssen. Fliegen sollten in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 Grad Celsius gezüchtet werden. Sammeln Sie die Fliegen ein bis drei Tage, nachdem Sie einen Kohlendioxid-Diffusor verwendet haben, um Fliegen in Reagenzgläser mit hefefreien Medien zu sortieren, sortieren Sie 10 Männchen pro Reagenzglas.

Warten Sie mindestens ein oder zwei Tage nach der Einnahme von Kohlendioxid, bevor Sie die Verhaltensexperimente durchführen. Sobald die Fliegen eingesammelt und sortiert sind, können sie im Video-Tracking-System ausgeführt werden. Die Video-Tracking-Experimente werden in einem Umgebungsraum durchgeführt, in dem eine konstante Temperatur von 25 Grad Celsius bei einer Luftfeuchtigkeit von 70 % herrscht.

Um fliegende Fliegen in Bewegung auf Video aufzunehmen, müssen Sie eine digitale Videokamera über den aufzunehmenden Bereich hängen. Mit der Kamera nach unten hängen wir die Kamera über einem Leuchtkasten, da unsere Tracking-Software kontrastbasiert ist. Verbinden Sie die Kamera anschließend mit einem Firewire-Kabel mit einem Computer.

Wir verwenden das Softwareprogramm Windows Movie Maker, um das Video direkt auf dem Computer aufzunehmen. Da in diesem Protokoll Luftimpulse verabreicht werden, muss eine Luftstromquelle im Raum vorhanden sein. Ein Gummischlauch verbindet die Luftquelle mit einem Kohlefilter zur Luftfilterung.

Ein Gummischlauch verbindet auch die andere Seite des Aktivkohlefilters über einen hohlen Gummistopfen mit einem Erlenmeyerkolben. Der Kolben sollte mit etwa einem halben Zentimeter Wasser gefüllt werden, das die Luft befeuchtet. Der Kolben sollte auch einen kleinen Seitenarm haben, der über einen weiteren Gummischlauch mit einem Y-förmigen Ventil verbunden werden sollte.

Ein Zweig des Y-Ventils ist mit einem Durchflussmesser verbunden, während der andere Zweig mit der quadratischen Fortbewegungskammer verbunden ist. Diese quadratische Fortbewegungskammer basiert auf dem Design von Wolf Etal 2002 mit kleinen Abwurfschalen, um zu verhindern, dass die Fliegen in der Kammer fliegen, bevor die Kammer mit dem Tracking-System verbunden wird. Denken Sie daran, 70% Ethanol zu verwenden, um alle Kammerkomponenten zu sterilisieren. Lassen Sie die Komponenten vor dem Gebrauch fahren.

Jetzt, da das Tracking-System fertig ist, können wir die Fliegen in die Lokomotionskammer bringen, um die Fliegen in die Kammer zu bringen. Entferne die Schrauben, die normalerweise die kleine Plexiglasoberseite der Kammer sicher halten. Positionieren Sie dann die Plexiglasplatte so, dass das Schraubenloch direkt über der Innenkammer sitzt.

Betäubung der Fliegen unmittelbar vor der Leitung. Ein Verhaltenstest kann möglicherweise die Leistung beeinträchtigen. Um eine Anästhesie zu vermeiden, verwenden Sie einen Trichter mit kleinem Auslass, um die Fliegen vorsichtig in die Kammer zu schlagen.

Um einen Trichter mit kleinem Auslass herzustellen, befestigen Sie eine blaue Pipettenspitze P 1000 am Ende des Trichters. Schneide mit einer Schere das äußerste Ende der Pipettenspitze ab, damit die Öffnung groß genug ist, damit eine Fliege hindurchpasst. Nehmen Sie dann ein Reagenzglas mit den Fliegen und legen Sie es kopfüber über den Trichter.

Setze dann das Ende des Trichters in das Schraubenloch ein. Bewegen Sie den Trichter nicht, da dies die Fliegen verletzen oder beschädigen könnte. Schlagen Sie stattdessen vorsichtig auf den gesamten Kammertrichter und alles, bis alle Fliegen in der Kammer sind.

Verwenden Sie ein Mauspad, um den Schock dieses Knalls zu absorbieren. Wenn sich Fliegen im Inneren befinden, entfernen Sie den Trichter und positionieren Sie die Plexiglasplatte wieder über den Schraubbetten, dann schieben Sie die Plexiglasplatte an ihren Platz. Sobald die Fliegen richtig geladen sind, stelle die Kammer auf einen Leuchtkasten.

Schalten Sie die anderen Lichter im Umweltraum aus und lassen Sie die Fliegen 30 Minuten lang in der Kammer akklimatisieren. Nach der 30-minütigen Akklimatisierungsphase fahren Sie mit dem Bewegungstest fort, um den Assay zu beginnen. Schalten Sie das Y-Ventil im Luftstromsystem so, dass die Luft nur zum Durchflussmesser strömt, schalten Sie die Luft ein und fahren Sie die Luft auf die gewünschte Geschwindigkeit hoch.

Jede Geschwindigkeit innerhalb von vier bis sechs Litern pro Minute funktioniert. Wir verbrauchen in der Regel fünf bis fünfeinhalb Liter pro Minute. Sobald die gewünschte Luftgeschwindigkeit erreicht ist, schalten Sie das Y-Ventil so, dass die Luft in die Bewegungskammer strömt.

Messen Sie diesen Luftimpuls 15 Sekunden lang und schalten Sie dann abrupt die Luft aus, wenn Sie die Luft ausschalten. Schalten Sie die Kamera in den Aufnahmemodus. Dieser Schritt erfordert Übung, um alles auf einmal zu tun.

Wir zeichnen den 32. Versuch mit 10 Bildern pro Sekunde und mindestens acht Versuche pro Genotyp auf. Stoppen Sie die Aufzeichnung, wenn die Testversion abgeschlossen ist, und stellen Sie sicher, dass Sie den Film speichern, wenn die Testphase abgeschlossen ist. Wir können mit der Videoanalyse fortfahren, um eine Bewegungsverfolgung der Bewegungsassay-Videos durchzuführen.

Um diese Software nutzen zu können, verwenden wir das dynamische Bildanalysesystem. Konvertieren Sie die Videos mit QuickTime 7.5 0.5 in ein A-VI-Dateiformat. Verwenden Sie als Nächstes die Funktion auto trace by threshold, um die Fliegen basierend auf dem Kontrast zu verfolgen, gefolgt von der Funktion make path from trace to digitize.

Diese Ablaufverfolgungen wenden dann die Funktion zum Berechnen von Parametern an, um die momentanen Geschwindigkeiten jeder Fliege in einer Datenbankdatei auszugeben. Diese Funktion ermöglicht auch die Datenglättung. Wir verwenden ein 5 15 60 15 5 Glättungsfenster.

Sobald diese Informationen als Datenbankdatei ausgegeben werden, öffnen und speichern wir die Dateien in Microsoft Excel. Excel-Dateien werden mit einem MATLAB-Skript verarbeitet, um die Momentangeschwindigkeiten zu kompilieren und zusätzliche Parameter zu berechnen, die für das Verständnis der Bewegungsdynamik erforderlich sind. Und die Struktur.

Hier ist ein repräsentatives Ergebnis dieses Assays. Die Abbildung auf der linken Seite zeigt Spuren von Wildtyp-Organismen aus Kanton, während die Abbildung auf der rechten Seite die Fliegen null für das Dask-Gen zeigt, die durch die Kreuzung von zwei grossen überlappenden Deletionen entstanden sind. Wie Sie in unserem Paradigma sehen können, zeigen die Dask-Nullfliegen eine stark verminderte Fortbewegung im Vergleich zu Canton S, was in der Literatur bereits mit einer anderen Art von Lokomotorik-Assay berichtet wurde.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie einen Workout-Video-Tracking-Assay einrichten und ausführen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Assays jeden Tag innerhalb des gleichen Zeitfensters von zwei bis drei Stunden durchzuführen, um Probleme mit dem zirkadianen Rhythmus zu vermeiden, und immer zuerst Wildtyp-Organismen laufen zu lassen, um sicherzustellen, dass die Verhaltensreaktionen an einem bestimmten Tag im normalen Bereich liegen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.