Experimentelles Protokoll für die Prüfung Verhaltensreaktion Profile in Larval Fish: Anwendung auf die Neuro-Stimulans Koffein
July 24th, 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Larven Zebrafisch und Fathead Elritze motorischen Aktivitäten und Photomotor Antworten (PMR) mithilfe einer automatischen Tracking-Software prüfen. Wenn gemeinsam Toxikologie Bioassays enthalten, liefern Analysen dieser Verhaltensweisen ein Diagnose-Tool um chemische Bioaktivität zu untersuchen. Dieses Protokoll wird beschrieben mit Koffein, ein Modell Neurostimulant.
Fischmodelle haben viele Vorteile und werden daher zunehmend in den biomedizinischen Wissenschaften eingesetzt. Von der Entwicklung über die Wirkstoffforschung bis hin zu toxikologischen Studien. Das Verhalten von Fischmodellen wird in ähnlicher Weise zunehmend für die Umwelt- und biomedizinische Forschung genutzt.
Hier ist es besonders wichtig, jahrzehntelange Forschungserfahrung in der aquatischen Toxikologie und Verhaltensökologie zu nutzen, um die umweltbiomedizinischen Wissenschaften voranzubringen. Unsere Methode könnte verwendet werden, um die Bioaktivität von Chemikalien und die Vorteile und Gefahren, die sie darstellen können, zu verstehen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es einen sensitiven und schnellen Ansatz zum Verständnis diagnostisch chemischer Aktivitäten bietet, die für die Umwelt- und biomedizinischen Wissenschaften von Nutzen sind.
Die Implikationen dieser Technik sollen die Diagnose kommerzieller Bioaktivitäten und Verhaltenseffekte unterstützen. Den meisten dieser Chemikalien fehlen oft wichtige Informationen zur Toxizität. Es kann jedoch auch angewendet werden, um die Auswirkungen anderer Chemikalien wie Pharmazeutika und Pestizide zu verstehen.
Dieser Aspekt ist wichtig zu berücksichtigen, da für industrielle Verbindungen häufig vergleichende umweltpharmakologische und toxikologische Daten fehlen. Neben der Messung der lokomotorischen Aktivität der Larven während der Veränderung der hellen, dunklen Photoperioden kann dieses Protokoll auch zur Messung der photomotorischen Reaktionen der Larven verwendet werden. Die effektiv das Ausmaß des Bewegungsunterschieds zwischen Hell zu Dunkel und von Dunkel zu Hell untersuchen.
Lösen Sie zunächst Koffein in rekonstituiertem hartem Wasser auf. Führen Sie dann serielle Verdünnungen durch, um niedrigere Koffeinbehandlungswerte zu erzielen. Zur Vorbereitung der einzelnen Expositionskammern werden 20 Milliliter Lösung in vier 100-Milliliter-Glasbecher für den Zebrafisch gegossen.
Gießen Sie 200 Milliliter Lösung in drei 500 Milliliter Glasbecher für die dickköpfigen Elritzen. Verwenden Sie anschließend eine Transferpipette, um 10 Zebrafischembryonen im Alter von vier bis sechs Stunden nach der Befruchtung in jeden der Becher zu geben. Mit einer modifizierten Transferpipette werden 10 innerhalb von 24 Stunden nach dem Schlüpfen gealterte Dickkopf-Elritzenlarven in jede der Expositionskammern gegeben.
Legen Sie die Kammern des Zebrafisches und der Dickkopf-Elritze in einen Inkubator. Nach 96 Stunden werden die einzelnen Fische in separate Vertiefungen mit 48 und 24 Vertiefungen geladen. Stellen Sie eine Vertiefungsplatte mit mindestens einer Fischlarve in die Aufzeichnungskammer.
Klicken Sie dann in der Video-Tracking-Software auf Protokoll zum Generieren von Dateien. Geben Sie im Feld Ortsanzahl des Dialogfensters die Anzahl der einzelnen Vertiefungen der Vertiefungsplatte ein. Klicken Sie dann OK.At oberen Bildschirmrand auf Vollbild anzeigen.
So zeigen Sie eine Overhead-Kameraansicht der Well-Platte an. Klicken Sie dann auf das Symbol zum Zeichnen von Bereichen. Wählen Sie das Kreissymbol in dem Feld mit der Bezeichnung "Bereiche" aus.
Markieren Sie mit dem Cursor den kreisförmigen Video-Tracking-Bereich im oberen linken Bereich der Platte. Wählen Sie die Markierung oben rechts aus und umranden Sie den Anzeigebereich der oberen rechten Well. Wählen Sie als Nächstes die untere Markierung aus, um die untere rechte Seite gut zu umranden.
Nachdem Sie die Bohrlochverfolgungsbereiche definiert haben, klicken Sie auf Erstellen, um die Software aufzufordern, die Anzeigebereiche der verbleibenden Bohrlöcher abzugrenzen. Klicken Sie im Kalibrierungsbereich auf Maßstab zeichnen, und zeichnen Sie eine horizontale Linie über die Platte. Sobald die Linie gezeichnet ist, wird ein Dialogfeld mit der Bezeichnung Kalibrierungsmessung angezeigt.
Geben Sie die Länge der Well-Platte in dieses Feld ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Auf Gruppe im Kalibrierungsbereich anwenden. Um den Zeichnungsmanager zu beenden, klicken Sie auf das Symbol für Zeichnungsbereiche. Klicken Sie anschließend auf das Kachelsymbol.
Markieren Sie mit dem Cursor alle Felder, die auf dem Anzeigebildschirm angezeigt werden, sodass jedes Kästchen grün ist. Klicken Sie auf Ansicht und Vollbild. Klicken Sie dann im Feld für den Erkennungsschwellenwert auf bkg und verwenden Sie die Schwellenwertanpassungsleiste, um den Schwellenwert für die Pixelerkennung festzulegen.
Sobald der entsprechende Schwellenwert ausgewählt ist, klicken Sie auf Auf Gruppe anwenden. Geben Sie in das Feld mit der Bezeichnung "Bewegungsschwellenwert" die gewünschten Parameter für die Verfolgung der Bewegungsgeschwindigkeit ein. Nachdem Sie die Geschwindigkeitsparameter festgelegt haben, klicken Sie auf Auf Gruppe anwenden.
Klicken Sie anschließend im Dropdown-Menü auf Protokollparameter. Wählen Sie im Dialogfeld die Registerkarte Zeit und geben Sie die Beobachtungs- und Integrationszeiten ein. Klicken Sie auf OK und öffnen Sie das Dialogfeld für die Einstellungen des Lichttreibers, indem Sie im Dropdown-Menü "Parameter" die Option "Light Driving" auswählen.
Legen Sie für jeden Fotozeitraum die Hell-Dunkel-Fotoperiode, die Zeiten und die Lichtintensität fest. Klicken Sie dann auf OK. Speichern Sie anschließend das Beobachtungsprotokoll.
Legen Sie zunächst die Well-Platte mit dem Versuchsfisch in die Verhaltensaufzeichnungskammer. Öffnen Sie dann das zuvor entwickelte Tracking-Protokoll. Stellen Sie im Video-Tracking-Viewer sicher, dass alle Larven sichtbar sind, dass sich nur eine Larve in jeder Vertiefung befindet und dass die Vertiefungen mit den definierten Beobachtungsbereichen ausgerichtet sind.
Klicken Sie anschließend auf Experiment und führen Sie es aus. Geben Sie den Namen und den Speicherort der Daten an. Klicken Sie auf das Symbol für mehrere Live-Bilder, um alle vordefinierten Anzeigebereiche hervorzuheben.
Schließen Sie abschließend das Bedienfeld der Aufnahmekammer und klicken Sie auf den Hintergrund, gefolgt von Start auf dem Computermonitor. Nach 96-stündiger Exposition gegenüber Koffein wurde die photomotorische Reaktion der Larven von Dickkopf-Elritzen durch Koffein in geringerem Maße verändert als bei Zebrafischen. Beim Zebrafisch war jedoch eine deutlich größere Anzahl von photomotorischen Endpunkten betroffen.
Zusätzlich wurde die hell- und dunkelmotorische Aktivität über drei Geschwindigkeitsschwellen für die zurückgelegte Strecke, die Anzahl der Bewegungen und die Dauer der Bewegungen analysiert. Bei beiden Spezies hemmte Koffein die Aktivität überhaupt und beeinflusste signifikant die Endpunkte des Bewegungsapparates. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Verhaltensassays mit einem engen spezifischen Zeitfenster zu verbinden.
Denn die Tageszeit kann das Verhalten von Fischlarven beeinflussen. Nach diesem Verfahren können Methoden auf standardisierte Richtlinien für andere Chemikalien angewendet werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem Verhalten von Fischen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Verhalten und die photomotorischen Reaktionen von Fischlarvenmodellen beobachten können, wenn Sie Toxizitäts-Bioassays mit standardisierten Richtlinien durchführen, die für die Umwelt- und biomedizinischen Wissenschaften relevant sind.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit bestimmten Chemikalien gefährlich sein kann, also stellen Sie sicher, dass Sie bei der Durchführung dieses Protokolls eine geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Untersuchung der lokomotorischen Aktivitäten und photomotorischen Reaktionen von Zebrafisch- und Fathead-Minnow-Larven mittels automatisierter Tracking-Software. Die Methode zielt darauf ab, toxikologische Bioassays durch die Bereitstellung von Einblicken in die chemische Bioaktivität zu verbessern, wie am Beispiel von Koffein als Modell-Neurostimulans gezeigt wird.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Verhaltensökologie
- Aquatische Toxikologie
- Biomedizinische Forschung
Hintergrund
- Fischmodelle werden zunehmend in den biomedizinischen Wissenschaften verwendet.
- Verhaltensstudien an Fischen können Umwelt- und biomedizinische Forschung beeinflussen.
- Das Verständnis chemischer Bioaktivitäten ist entscheidend für die Bewertung ihrer Vorteile und Gefahren.
- Vergleichende Daten zur Umweltpharmakologie und -toxikologie fehlen oft.
Zweck der Studie
- Um eine empfindliche und schnelle Methode zur Bewertung chemischer Aktivitäten zu entwickeln.
- Um die Diagnose kommerzieller Bioaktivitäten und Verhaltenseffekte zu unterstützen.
- Um einen standardisierten Ansatz für die Bewertung der Wirkungen verschiedener Chemikalien bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Auflösen von Koffein in rekonstelliertem Hartwasser für die Exposition.
- Verwendung automatisierter Tracking-Software zur Analyse lokomotorischer und photomotorischer Reaktionen.
- Durchführen von Serienverdünnungen zur Bewertung verschiedener Koffeinkonzentrationen.
- Überwachung des Verhaltens von Fischlarven während Licht- und Dunkelzyklen.
Hauptergebnisse
- Koffein veränderte photomotorische Reaktionen bei Fathead-Minnows bei niedrigeren Konzentrationen als bei Zebrafischen.
- Zebrafische zeigten eine größere Anzahl betroffener photomotorischer Endpunkte.
- Beide Arten zeigten eine gehemmte Aktivität bei allen lokomotorischen Endpunkten.
- Die Tageszeit beeinflusst signifikant das Verhalten von Fischlarven.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen Rahmen für die Bewertung der Verhaltenseffekte von Chemikalien.
- Methoden können für andere Chemikalien standardisiert werden, um zusätzliche Fragen zu untersuchen.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis des Fischverhaltens in toxikologischen Studien.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid behavioral profiling of larval fish to assess neuroactive compound effects, supporting early-stage target validation in neuropharmacology. By quantifying photomotor and locomotor responses, it provides mechanistic insights that aid in de-risking CNS-active compounds before mammalian testing. The comparative sensitivity between zebrafish and fathead minnows offers a translational advantage for species-specific behavioral screening in environmental and biomedical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring neurostimulant-induced behavioral changes in larval fish models.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantifiable photomotor and locomotor endpoints.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with significant behavioral effects at environmentally relevant concentrations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated behavioral assays for downstream compound screening using automated tracking.
- Quantitative Outputs: Generates measurable locomotor and photomotor data across speed thresholds for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardizes light/dark cycle protocols to ensure consistent behavioral readouts across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neuropharmacological responses relevant to CNS disorder target engagement.
- Translational Continuity: Bridges behavioral ecotoxicology with biomedical screening through conserved behavioral endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by highlighting species-specific sensitivity differences in neuroactive compound responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing and lead identification through behavioral phenotyping of larval fish exposed to neuroactive compounds.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking compound exposure to altered photomotor and locomotor behaviors.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible behavioral readouts for compound effect comparison.
- Analytics: Provides quantitative movement thresholds and photomotor response metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects behavioral ecotoxicology to preclinical neuropharmacology via conserved behavioral assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable behavioral profiling platform applicable to diverse chemical libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuroactive compound screening.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of behavioral assays across species and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS-active compounds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on quantitative behavioral effect thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in larval fish husbandry and behavioral tracking software operation.
- Dependent on automated video tracking systems and controlled environmental incubators.
- Necessitates cross-team standardization of exposure protocols and behavioral endpoint definitions.
- Must account for diurnal behavioral variability when scheduling assays.
- Limited to behavioral endpoints; does not replace mechanistic or molecular target validation.
