Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den zellulären und molekularen Mechanismen der Hornhautwundheilung zu beantworten. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie die Situationen in der Notaufnahme im Falle eines Hornhauteinsatzes, d.h. eines Abschürfes oder Kratzers auf der Augenoberfläche, widerspiegelt. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich die Vorläuferzellen des Hornhautepithels und ihr Verhalten in einer Situation untersuchte, die die homöostatische Aufrechterhaltung der Hornhaut in Frage stellte.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Durchführung des Hornhautabriebs schwierig ist und Übung erfordert. Bereiten Sie zunächst eine 0,1%ige Florecin-Lösung vor, um den Abrieb unter kobaltblauem Licht sichtbar zu machen, indem Sie 10 Milligramm Florecinsalz mit einer feinen Skala messen. Geben Sie dann das Salz in 10 Milliliter Fosfate gepufferte Kochsalzlösung.

Schützen Sie die Florecine-Lösung vor Licht und schütteln Sie sie fünf Minuten lang. Filtern Sie die Lösung steril in eine Pipettenflasche und schützen Sie sie vor Licht. Die Florecin-Lösung kann zwei bis drei Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Reinigen Sie die Spitze des Augengrats vor und nach dem Gebrauch. Zuerst mit PBS und dann mit 70% Ethanol. Beginnen Sie damit, die betäubte Maus auf ein Papiertuch auf eine auf 37 Grad Celsius erhitzte Warmhalteplatte zu legen.

Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie eine Schwanzklemme und eine Zehenkneifung verabreichen. Der Grad der Anästhesie ist gut, wenn der Schwanzreflex fehlt, aber der Zehenreflex vorhanden ist. Drehen Sie die Basis des Grats, um die Vibration einzuschalten.

Öffnen Sie das zu entfernende Auge, indem Sie die Augenlider mit den Fingern auseinander halten. Berühren Sie dann den Grat fest mit der Hornhaut und bewegen Sie das Instrument auf der Augenoberfläche hin und her und seitwärts, ohne den Grat anzuheben. Die Gratvibration führt den Kratzer aus.

Drücken, schütteln oder reißen Sie nicht auf die Hornhaut. In der zentralen Hornhaut reichen 20 Abriebbewegungen auf der Oberfläche aus, um die Wunde zu induzieren. Die Herstellung des Hornhautabriebs ist eine Herausforderung und erfordert Übung.

Achten Sie auf den richtigen Druck und versuchen Sie, den Abrieb in nur einem Versuch durchzuführen. Verabreichen Sie einen Tropfen Flourecin-Lösung aus der Tropfflasche auf das abgeschürfte Auge. Waschen Sie dann das Auge einmal mit 0,9 % Kochsalzlösung, um den Hintergrund des Florecins zu reduzieren.

Nehmen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem weichen Tuch auf und reinigen Sie die Wimpern bei Bedarf. Um den Abrieb abzubilden, positionieren Sie eine Tischlampe mit einer angebrachten kobaltblauen Stiftlampe direkt über dem Mausauge. Der Knopf der Stiftlampe kann mit Klebeband abgeklebt werden, um das Licht auch bei der alleinigen Arbeit eingeschaltet zu halten.

Fokussieren Sie eine Spiegelreflexkamera bei Raumlicht auf das Auge und schalten Sie dann alle anderen Lichter außer dem kobaltblauen Stiftlicht aus. Wenn sie mit dem kobaltblauen Stiftlicht beleuchtet wird, fluoresziert der abgeschliffene Bereich grün, da Florecinmoleküle in der unebenen Oberfläche eingeschlossen sind. Verwenden Sie die Spiegelreflexkamera, um Bilder vom Auge zu machen.

Nachdem Sie das Auge abgebildet haben, legen Sie die Maus wieder auf die erwärmte Platte. Geben Sie einen Tropfen antibakterielle Fucidin-Augensalbe sowohl in die abgeriebenen als auch in die nicht abgeriebenen Augen, um die Augenoberfläche nach der Anästhesie mit Feuchtigkeit zu versorgen und frei von Bakterien zu halten. Beobachten Sie die Maus auf der erhitzten Platte für die fünf- bis 20-minütige Aufwachphase nach der Anästhesie.

Wenn sie mobil wird, bringen Sie die Maus einzeln in einem sauberen Käfig unter. Nachdem Sie das Tier mit einer zugelassenen Methode eingeschläfert haben, entnehmen Sie den Augapfel, indem Sie zuerst mit einer Sezierschere in die Haut an der Seite des Auges schneiden und öffnen. Platzieren Sie dann die Schere unter dem Augapfel und schneiden Sie den Augennerv durch, um den Augapfel aus der Augenhöhle zu pumpen.

Lege das Auge in eine Schale, die PBS enthält. Verwenden Sie eine 26-Gramm-Nadel, um ein Loch auf der Rückseite des Auges auf der Netzhautseite zu bohren, um ein freies Eindringen der Lösungen in das Auge zu ermöglichen. Übertragen Sie das Auge in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen, das PBS enthält.

Entfernen Sie dann das PBS, fügen Sie vier Prozent Paraformaldehyd hinzu und fixieren Sie das Auge vier bis fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius. Dieses Bild zeigt ein Mausauge unmittelbar nach der Abrasion. Das Florecin-Signal markiert die abgeschliffene Region in hellem Grün, während alle anderen Regionen im Epithel dunkel bleiben.

Die gestrichelte Linie markiert die Ränder der Wunde. Das Bild zeigt das unverletzte beidseitige Auge, das als Kontrolle dient. Der weiße Fleck ist die Reflexion der Kamera.

18 Stunden nach der Abrasion hat sich das Hornhautepithel über der exponierten Stelle weitgehend geschlossen, es ist nur noch eine geringe Schürfwunde übrig. 72 Stunden nach dem Abrieb ist kein grünes Signal mehr sichtbar. Dies deutet darauf hin, dass das Hornhautepithel 72 Stunden nach der Abrasion wieder vollständig epithelialisiert war.

Die Abrasion konzentriert sich auf das Hornhautepithel, hier im intakten Auge, so dass die tieferen Schichten der Hornhaut intakt bleiben. Unmittelbar nach der Abrasion zeigt die H- und E-Färbung den Rand der Abschürfung, der bei diesem Sternchen als schmaler, a-zelliger Rand angezeigt wird, der von einem regelmäßigen vier bis fünf Zellschichten dicken Hornhautepithel ausgeht. 18 Stunden nach der Verletzung ist der Heilungsprozess aktiv und die Reepithelisierung ist im Gange.

Darauf deutet das Erscheinungsbild einer Vorderkante von ein bis zwei Epithelzellschichten hin, die den exponierten Bereich bedeckt. Die Oberfläche scheint nach 72 Stunden vollständig reepithelisiert zu sein, da die wandernden Fronten die Wunde bedecken und alle Epithelschichten wieder vorhanden sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie von zwei Forschern richtig ausgeführt wird.

Bei der Planung und dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die örtlichen Tierschutzrichtlinien zu befolgen und eine gute und sterile Laborpraxis zu pflegen. Nach diesem Protokoll können andere Methoden wie die Linisverfolgung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Wundheilung der Hornhaut, zur Reepithelisierung und zur Wiederherstellung der Gewebehomöostase in der Hornhaut zu beantworten.