Name: Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Lernen Sie eine epitheliale Korneaabnutzung mit okulärem Burr bei Mäusen zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der Hornhautwundheilung. Diese Methode ermöglicht wertvolle Einblicke in die Regeneration des Auges.

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Wir möchte Kaisa Ikkala für ihre wertvolle technische Hilfe und aufschlussreiche Hilfe, wenn Sie diese Methode Aktualisierungstendenz sowie später bei der Umsetzung auf unsere zentralen Forschungsfragen zu danken. Wir möchten auch Laboratory Animal Center und Anna Meller für ihre Hilfe bei der Planung der Richtlinien der tierärztlichen Arbeit danken.

Alle Experimente werden von den nationalen Tierversuch Board genehmigt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie alle Lösungen und halten bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben. Befolgen der Abfallentsorgung zu entsorgen verwendete Materialien und Lösungen.</li>
	<li>Verwendung NMRI und ICR fremd-Bestände Alter zwischen 4 und 12 Wochen und beiderlei Geschlechts. Wenn den Stamm C57BL/6 verwenden, folgen Sie den Ketamin-Medetomidine Vorbereitung Methode im Schritt 1.3.2. Folgen Sie für weitere Schritte den Anweisungen in 1.3.3.-1.3.5 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Veterinärmedizin, frisch und in der Zeit vor der Inbetriebnahme. Carprofen wird später verwendet werden, so ist es nicht notwendig, um es an dieser Stelle vorbereitet.<ol>
<li>Um eine Lösung von Ketamin-Medetomidine Anästhesie vorzubereiten, mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin (Ketaminol Vet) mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine (Cepetor Vet) und 1,25 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg, Ketamin und 1 mg/kg, Medetomidine).</li>
		<li>Um eine mehr verdünnte Lösung von Ketamin-Medetomidine Vorbereitung der Anästhesie bei C57BL/6 Mäusen mischen 0,375 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Ketamin mit 0,25 mL (Konzentration Lager 1 mg/mL) von Medetomidine und 2,5 mL steriler 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (3,75 mg/kg, Ketamin und 0,5 mg/kg, Medetomidine). Hinweis: Dies ist eine alternative Schritt nur für Erwachsenen C57BL/6 Mäusen.</li>
		<li>Zur Analgesie Buprenorfin Vorbereitung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 0,3 mg/mL) des Buprenorfin auf 1,9 mL steriler 0,9 % NaCl. 0,2 mL/20 g Maus Gewicht (0,15 mg/kg) zu verwalten.</li>
		<li>Atipamezol Vorbereitung für die Anästhesie Einstellung, fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 5 mg/mL) von Atipamezol bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Verwenden Sie für Analgesie während der Post-Narkose Carprofen. Fügen Sie 0,1 mL (Konzentration Lager 50 mg/mL) von Carprofen bis 4,9 mL 0,9 % NaCl. Verwalten Sie 0,15 mL/20 g Maus Gewicht (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluoreszierende Färbelösung vorbereiten<ol>
<li>Zur Visualisierung des Abrieb unter dem Kobalt Blaulicht (Abbildung 1), verwenden Sie eine fluoreszierende Lösung. Bereiten Sie eine 0,1 % Fluorescein-Lösung durch die erste Messung 10 mg von Fluorescein Salz mit einer feinen Skala und fügen Sie ihn auf 10 mL in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Die Fluorescein-Lösung vor Licht schützen und für 5 Minuten auf einem Shaker schütteln. Hinweis: Die Fluorescein-Lösung ist lichtempfindlich; halten Sie die Lösung von Licht bedeckt. Diese Lösung kann für 2-3 Tage bei + 4 ° C aufbewahrt werden. Für den Einsatz ist es hilfreich, die Fluorescein-Lösung in einer Tropfflasche zu legen, die für Augentropfen verwendet wird. Verwenden Sie ein Sterilfilter, beim Wechsel der Lösung auf die Tropfflasche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie die okuläre Burr-Tipp vor und nach Gebrauch; zuerst mit PBS und dann mit 70 % EtOH. Wenn einen Abrieb an mehrere Mäuse während der gleichen Operation vorgenommen werden, tun die Reinigungsschritte zwischen jeder Maus.</li>
	<li>Die beheizte Platte auf (+ 37 ° C) und platzieren Sie ein Papiertuch auf ihn.</li>
</ol>(2) Korneaabnutzung
Achtung: Verwenden Sie Schutzkleidung (Handschuhe, Kittel) beim Umgang mit Mäusen. Wiegen Sie die Maus, um das Volumen der Medikamente zu verabreichen zu schätzen.
<ol><li>Verwenden Sie die einhändige scruffen Methode um die Maus23behandeln. Ketamin-Medetomidine Mischung intraperitoneal verwalten (i.p.) auf den linken Unterbauch. Platzieren Sie den Mauszeiger in einen einzelnen Käfig und warten Sie, bis es zum Einschlafen. Dies dauert in der Regel weniger als 5 Minuten. Verwalten Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen dann. Verwenden Sie die gleichen Umgang mit Technik. Hinweis: Wenn Anästhesie gegeben ist, sollte das Protokoll nicht jederzeit angehalten werden.</li>
	<li>Prüfen Sie bevor Sie fortfahren, ob die beheizte Platte warm ist. Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf der beheizten Platte. Das Niveau der Anästhesie ist gut, wenn der Schweif Reflex fehlt, aber der Fuß-Reflex vorhanden ist. Überprüfen Sie diese Reflexe durch Kneifen das Heck und alle Zehen mit den Fingern oder einer Pinzette. Keine Gewalt anwenden. Anästhesie ist 20-25 Minuten.</li>
	<li>Um einen Abrieb zu machen, verwenden Sie den gereinigten okulären Grat. Drehen Sie die Basis der Grat schalten Sie die Vibration, die unerlässlich ist, den Abrieb zu machen. Spüren Sie die Vibration in der hand, wenn der Grat einwandfrei funktioniert.<ol>
<li>Öffnen Sie ein Auge zu einer Zeit, indem Sie die Augenlider separat mit den Fingern halten. Dann fest berühren Sie den Grat an der Hornhaut und bewegen Sie das Gerät hin und her sowie auf der Augenoberfläche wie seitwärts. Die Grat Schwingung führt den Kratzer; nicht drücken, schütteln oder die Hornhaut zu reißen. In der zentralen Hornhaut sind 20 schleifende Bewegungen auf der Oberfläche ausreichen, um die Wunde zu induzieren. Heben Sie den Grat nicht und versuchen Sie, bleiben in der Region der Hornhaut abgeschliffen werden. Erwerb eines Standardgröße Abrieb werden mehrere Runden der Praxis erfordern.</li>
	</ol>
 Hinweis: Hornhaut Asepsis vor Abrieb lässt sich mithilfe von ophthalmologischen Betadine Lösung.</li>
</ol>(3) Bildgebung den Abrieb
<ol><li>Die abgeriebenen Region mit Kobaltblau Stift Licht (Abbildung 1) und Fluorescein Lösung zu beleuchten. Die Augenoberfläche wird farblos bei Umgebungslicht. Nach Fluorescein Anwendung fluoresziert abgeschürfte Region in grün, wenn das Auge mit dem Stift Licht beleuchtet.<ol>
<li>Bei Bedarf öffnen Sie das abgeschliffene Auge ähnlich wie bei 2.3 und verwalten Sie einen Tropfen von Fluorescein-Lösung aus der Tropfflasche. Waschen Sie das Auge einmal mit PBS oder 0,9 % NaCl, Hintergrund der Fluorescein zu reduzieren. Verwenden Sie eine Tropfflasche oder Pipette zum Waschen. Aspirieren Sie die Flüssigkeit mit einem weichen Tuch entfernt und reinigen Sie die Wimpern nach Bedarf. Die überschüssige Flüssigkeit sammelt sich in der Regel zur nasalen Grenze des Auges, in der Nähe von der Eröffnung des Kanals Träne. Achtung: Berühren Sie die Hornhaut während Ablaufrinnen da kleinere Abschürfungen induziert werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Machen Sie Fotos von der korneaabnutzung.<ol>
<li>Um ähnliche Bilder bei allen bildgebenden Sitzungen zu erhalten, verwenden Sie stabile Befestigung Werkzeuge für das Kobaltblau Stift Licht und die SLR-Kamera (Abbildung 2). Dieses Protokoll bietet eine Setup, das einfach zu wiederholen (Abbildung 2).<ol>
<li>Um das Stift Licht und die Kamera zu befestigen, verwenden Sie eine Tischleuchte mit flexiblem Arm und Klemme und einen verstellbaren Kameraarm mit einer Klammer bzw.. Kabelbinder der Stift leicht um die Tischleuchte und Position genau über die Maus Auge. Positionieren das Licht anders könnte die Visualisierung der Abrieb verändern. Ein Vorschlag für die Positionierung dieser Werkzeuge ist in Abbildung 2beschrieben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie die SLR-Kamera um zu fotografieren des Auges. Legen Sie das Tier in einen gewünschten Abstand, Position und Ausrichtung der Kamera (01:12) im Raumlicht. Danach schließen Sie alle anderen Lichter außer Kobaltblau Stift Licht. Hinweis: Den Stift leicht Griff nach unten mit Klebeband oder verwenden Sie ein Gummiband um das Licht auf die ganze Zeit während der Bildgebung zu halten. Dies könnte helfen, wenn das Bild unscharf wird. Es ist am einfachsten, die bildgebende Schritt mit einem Kollegen durchführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) aufwachen nach Korneaabnutzung
<ol><li>Verabreichen Sie erste Buprenorfin und dann Atipamezol über i.p Injektionen. Verwenden Sie die gleiche Handhabung Technik wie in 2.1.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der antibakteriellen, Fucidin Säure Augensalbe (Isathal) abgeschliffen und nicht abgeschliffen Augen zu befeuchten der Augenoberfläche sauber von Bakterien nach der Narkose.</li>
	<li>Wie die Maus in 5-20 Minuten auf der beheizten Platte aufwachen wird, beobachten Sie die Maus während der Post-Narkose aufwachen-Periode. Wenn es mobiler wird, legen Sie sie in einen einzelnen Käfig. Hinweis: Wenn Aufwachen länger dauert, platzieren Sie den Mauszeiger in den Käfig mit einem beheizten Pad oder legen Sie den gesamten Käfig auf der beheizten Platte und überwachen Sie die Maus regelmäßig zu. Während die Narkose nachlässt, wird die Maus in der Regel schüttelt und nach oben mit dem vorderen Körper erreicht. Dieses Verhalten sollte wieder normal in ca. 3-4 Stunden und dann platzieren Sie die Maus wieder zu einem gemeinsamen Käfig.</li>
	<li>Carprofen i.p für Analgesie und Auge Salbe an zwei aufeinanderfolgenden Tagen nach der Abrieb, ähnlich wie in den Schritten 2.2 zu verwalten. und 4.2.</li>
</ol>(5) Bildgebung bei der Wundheilung
<ol><li>In diesem Protokoll weist Nutzungszeit 18 h und 72 h nach Abrieb, der Wundverschluss zu beobachten.<ol>
<li>Betäuben Sie für aufeinander folgende Aufnahmen die Mäuse wie unter 2.2 erläutert.</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder, wie in 3 erläutert.</li>
		<li>Die Tiere mit Atipamezol i.p wachen Sie auf und überwachen Sie den Wake-up Zeitraum zu, wie in 4.3 erläutert. Hinweis: Wenn nicht weiter das Follow-up, einschläfern der Maus direkt nach 5.1.2. Sterbehilfe ist in 6.1 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Hornhaut Sammlung und Paraffin einbetten
<ol><li>Hinter dem letzten Zeitpunkt das Tier zu opfern. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine Kammer, die mit CO2gefüllt werden kann. Füllen Sie die Kammer Luft mit CO2. Wenn das Tier unbeweglich ist, verrücken der Halswirbel durch Ziehen fest von der Schwanzwurzel und Halsbereiches gleichzeitig nach unten drücken. Achtung: Befolgen Sie die Richtlinien des lokalen Tierschutz Körpers.</li>
	<li>Sammeln Sie die ganze Augapfel durch eine Öffnung in der Haut an der Seite des Auges mit Dissektion Schere schneiden. Legen Sie die Schere unter den Augapfel und Schneiden des okulären Nervs um den Augapfel aus der Umlaufbahn pop. Verwenden Sie Pinzette, wenn das Auge nicht leicht herauskommen.<ol>
<li>Machen Sie ein Loch auf der Rückseite des Auges auf der Netzhaut Seite mit einer 26G-Nadel zu Lösungen im Inneren des Auges frei eindringen. Hinweis: Lassen Sie nicht das Auge trocken, stattdessen werden, legen Sie es in PBS bis fort mit dem Protokoll.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie den Augapfel in der 2-mL-Tube mit PBS. Unterbrochen Sie das Experiment nicht an dieser Stelle.</li>
	<li>PBS zu entfernen und Augäpfel in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei + 4 ° C für 4-5 Stunden zu beheben.</li>
	<li>Bewegen Sie den festen Augapfel zu einer Gewebe-Kassette für Gewebe Verarbeitung. Benutzen Sie ein Tuch Verarbeitung Maschine und das folgende Programm:<ol>
<li>Spülen mit PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie 2 x 45 min in 70 % igem Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 2 x 1 h in 94 % Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 45 min. in absoluten Ethanol bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 1 h in Xylol, bei Raumtemperatur und letzten Xylol bei 37 ° c</li>
		<li>Inkubieren Sie 3 x 1 h in Paraffinwachs bei 60 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betten Sie nach Gewebe Verarbeitung den Augapfel in flüssiges Paraffin (+ 60 ° C) mit einem Gewebe einbetten Block ein. Legen Sie das Auge innerhalb des Blocks, so dass es zur Seite schaut und die peripheren Grenze nach oben zeigt. Lassen Sie den Block auf einem kühlen Teller für ca. 5-10 Minuten zu festigen.</li>
</ol>(7) Paraffin Abschnitte der Hornhaut
<ol><li>Bereiten Sie das Mikrotom für Schnitt gemäß den Anweisungen des Instituts oder des Herstellers. Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit scharfen Mikrotom Klinge.</li>
	<li>Ort ein Wasserbad mit Raumtemperatur Reinstwasser neben Mikrotom und ein weiteres mit Reinstwasser beheizt bis + 50 ° C.</li>
	<li>Machen Sie 5 µm dicke Schichten des Augapfels. Hinweis: Die Linse leicht bricht beim Schneiden. Um dies zu vermeiden, wischen Sie die Schnittfläche mit einem feuchten Tuch jedes Mal eine neue Reihe von Abschnitten gestartet wird. Verwenden Sie Leitungswasser, das Gewebe zu befeuchten.</li>
	<li>Legen Sie die Abschnitte nebeneinander im Wasserbad Raumtemperatur und verschieben Sie sie dann in dem heißen Wasserbad mit Hilfe von einem Objektträger. Dehnen Sie die Abschnitte in dem heißen Wasserbad, bis alle Falten entspannen und die Abschnitte werden Matte.</li>
	<li>Trocknen Sie die Glas-Objektträger mit Abschnitten über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Folien zuordnen Sie in den Abschnitten, indem man die Folie für 1 Minute auf einer beheizten Platte bei + 60 ° C. Danach können bei + 4 ° C. die Abschnitte direkt zum Beizen, immunohistologische Methoden verarbeitet oder gespeichert werden</li>
</ol>

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<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Verwundung Methoden sind populäre Werkzeuge, verschiedene Aspekte der Hornhaut Homöostase und Pathologien zu studieren. Der Abrieb-Modell bietet eine gut kontrollierte Methode zur relevanten Probleme in der Augenheilkunde. Allerdings sind einige kritische Punkte im Protokoll hervorzuheben. Insbesondere die Details bezüglich der Veterinärmedizin, heilende Wunde Timeline und Ergebnis skizziert sind optimiert für den Einsatz mit fremd-NMRI und ICR-Aktien, aber können unter Stämme von Mäusen26variiere...

Epitheliale Schichten zahlreiche Organe sind Verletzungen ausgesetzt. Sie enthalten jedoch auch die Möglichkeit zum Ausgleich Gewebeverlust durch Wundheilung. Die Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Es bildet die äußere Oberfläche des Auges und bietet eine Schutzschicht für die sensible okuläre Maschinen. So funktioniert Hornhaut als eine physikalische Barriere gegenüber Krankheitserregern und Wasserverlust. Es besteht aus drei Schichten; Epithel, Stroma und Endothel. Das Epithel der Hornhaut bildet die äußerste Schicht der Hornhaut. Epithelzellen pflegen die Barrierefunktion der Hornhaut durch die Einhaltung streng miteinander durch tight Junctions1,2,3. Eine azelluläre Hornhaut Basalmembran, die Bowman-Membran trennt das Epithel aus der umfangreichen Stroma, das feuerfeste keratozyten enthält. Unter das Stroma Kanal endotheliale Zellen Nährstoffe, Wasser und Sauerstoff, die obere Schicht.
Hornhauterosionen sind sehr häufig in der Klinik4. Verletzungen der Hornhaut sind vielfältig, aber vor allem durch kleine Partikel wie Staub oder Sand, Kratzer oder andere Fremdkörper verursacht werden. Das Protokoll beschrieben hier zielt auf eine klinisch relevante Art von epithelialen korneaabnutzung zu reproduzieren. Dabei bietet dieses Protokoll eine kontrollierbare und bahnbrechende Methode für Kliniker und Wissenschaftler Hornhaut, in eigenen Studien zu implementieren. Wir haben eine in Vivo Verletzung Reparatur Assays auf der murinen Hornhaut durch Anrauen des Gewebes mit einer getrübten okuläre Burr, Algerbrush II durchgeführt. Unser Ziel hier, den Abrieb nur auf der zentralen Hornhaut-Epithel und lassen Sie die anderen Teile der Orgel ohne Schaden. So, das Protokoll ist ideal, um Studie Hornhaut Epithelzelle Dynamik oder der Basalmembran während Re Epithelisierung, Migration, Proliferation und Differenzierung in Vivo5Zelle. Vor kurzem wurde dieses Modell zum Analysieren der Stammvater Zelldynamik in der murinen Hornhaut als auch hinsichtlich der Kapazität der differenzierten Hornhaut epithelialen Zellen bei der Neugründung der Hornhaut Stammzellnische nach Verletzungen6,7zu enthüllen. Nach Abrieb kehrt die Hornhaut zu seiner normalen Transparenz und Zugfestigkeit. Interessant ist, eine in-vitro- Studie angedeutet, dass re Epithelisierung ohne erhöhte Zelle Verbreitung8tritt. Dieses Protokoll beschreibt die Zeitachse der ununterbrochenen Heilung in der murinen Hornhaut. Die Methode ist somit anwendbar, die Wirkung von Medikamenten auf die Heilung von Mustern und Geschwindigkeit zu testen.
Die Hornhaut ist beträchtlich für Wundheilung Studien benutzt worden. Jedoch haben viele Studien auf andere Modelle der Verletzung verlassen. Ein gut etabliertes Modell der Verletzung der Hornhaut ist die alkalische brennen, die durchgeführt wird, durch die Anwendung von Natriumhydroxid (NaOH) mit oder ohne Filterpapier auf die Hornhaut-Oberfläche-9. Alkalische Exposition führt zu einer großen und diffuse Verletzung, die betrifft nicht nur das Hornhaut-Epithel, sondern auch die Bindehaut und Stroma9,10. Starke alkalische Lösungen nachweislich hornhautgeschwüren, eintrübt und Neovaskularisation9induzieren. Entzündungszellen dringen in das Stroma in der Regel innerhalb von 6 h und bleiben dort bis zum 24 h-11. Somit ist alkalisch Verletzungen eine ratsam Methode in Studien im Zusammenhang mit Stromazellen Aktivierung. Eine andere Art von chemischen Verletzungen kann durch die Anwendung von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zugefügt werden, auf die Hornhaut9,10. Andere häufig verwendete Verletzungen Modelle umfassen incisional Wunden, die durch die Stroma und Keratektomie Wunden eindringen, die auf den oberen Teil der Stroma14,15beschränkt sind. Diese Methoden eignen sich auch zur Rede und Antwort bezüglich Stromazellen Wundheilung. Verschiedene Verletzungen Modelle haben ihre eigenen vor- und Nachteile. Abrieb oder Debridement, der das Hornhaut-Epithel wurde zuerst mit getrübten Skalpelle oder klingen auf ex Vivo Hornhaut16entwickelt. Diese Methode wurde später verwendet in Vivo auf Maus, Ratte und Kaninchen17,18,19,20,21,22. Mit Hilfe des okulären Grates (Abbildung 1), entfernen wir nur einen ausgewählten Bereich des Epithels, ohne Auswirkung auf den Rest des Epithels. Auf diese Weise ist es möglich auf die epithelialen Entfernung zu den verschiedenen Teilen der Hornhaut. Darüber hinaus kann die Größe der Abrieb mit Fluorescein Beflecken beurteilt werden. Darüber hinaus folgen wir hier Abrieb Schließung während der Einheilphase.
Diese Methode birgt einige Vorteile, i) einschließlich der genauen Standort der Abrieb Website, die nicht mit chemischen Verletzungen möglich ist, (Ii) der Abrieb ist schnell durchzuführen, und (Iii) Es ist nicht-invasiv. Hier beschreiben wir die Methode mit der outbred NMRI Maus als Modell, aber dies angewendet werden könnte, die breite Palette von genetischer Mausmodelle sowie der Ratte und Kaninchen, die gängigen Modelle zur Untersuchung der menschlichen Hornhaut Störungen sind.

<table><tbody><tr><td>NMRI-Maus</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % NaCl</td><td></td><td></td><td>verwenden steriles</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Marktname: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Marktname: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Marktname: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Marktname: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Marktname: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% Fucidinsäure Augensalbe</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Marktname: Isathal</td></tr><tr><td>Fluoresceinsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii Augengrat ( 0,5 mm Spitze)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Kobaltblaues Stiftlicht</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Spiegelreflexkamera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Verstellbarer Kameraarm und Klemme</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Höhe 28 cm</td></tr><tr><td>Tischleuchte mit flexiblem Arm und Klemme</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft Wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Kammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionswerkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G Nadeln</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf Tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Kassette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Verarbeitungsmaschine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinwachs</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Einbettform 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad zum Schneiden</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad zum Schneiden</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomklinge</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Th.Geyer GmbH & Co. KG</td><td>7.695.019</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

epitheliale korneaabnutzung mit okulärer burr als modell für die hornhaut wundheilung

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Die murine Hornhaut bietet ein hervorragendes Modell um die Wundheilung zu studieren. Die Hornhaut ist die äußerste Schicht des Auges, und somit ist die erste Verteidigungslinie zu Verletzungen. In der Tat ist die häufigste Art von Verletzungen am Auge gefunden in Klinik ein korneaabnutzung. Hier nutzen wir eine augenfällige Grat um einen Abrieb was Entfernung des Hornhaut-Epithel in Vivo an narkotisierten Mäusen zu induzieren. Diese Methode ermöglicht gezielte und reproduzierbare epithelialen Störung, wobei andere Bereiche intakt bleiben. Darüber hinaus wir beschreiben die Visualisierung der abgeriebenen Epithel mit Fluorescein beflecken und liefern konkrete Ratschläge wie man die abgeriebenen Hornhaut zu visualisieren. Dann folgen wir die Zeitleiste der Wundheilung 0, 18 und 72 h nach Abrieb, bis die Wunde wieder epithelialized ist. Die epithelialen Abrieb Modell der Verletzung der Hornhaut ist ideal für Studien zur epithelialen Zell-Proliferation, Migration und Re Epithelisierung der Hornhaut Schichten. Diese Methode ist jedoch nicht optimal Stromazellen Aktivierung bei der Wundheilung, zu studieren, weil der okuläre Grat nicht um die Stromale Zellschichten eindringt. Diese Methode ist auch geeignet für klinische Anwendungen, z. B. der präklinischen Prüfung der Wirksamkeit der Droge.

Dieses Protokoll beschreibt ein Modell, um eine Verletzung der Maus Hornhaut Abrieb zufügen und Lösungsvorschläge zu folgen und den Heilungsprozess nach Abrieb zu visualisieren. Vor kurzem haben wir diese Methode zur Untersuchung der Rolle von Hornhaut epithelialen Progenitorzellen bei Wundheilung6beschäftigt. Der Einsatz von etablierten Werkzeugen ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Abrieb-Experiment. Wir und andere haben den Algerbrush II okulären Grat (<str...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, einen Abrieb auf der Augenoberfläche der Maus zuzufügen und die Wundheilung danach zu folgen. Das Protokoll nutzt eine augenfällige Grat, teilweise das oberflächenepithel des Auges in narkotisierter Mäuse zu entfernen.

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den zellulären und molekularen Mechanismen der Hornhautwundheilung zu beantworten. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie die Situationen in der Notaufnahme im Falle eines Hornhauteinsatzes, d.h. eines Abschürfes oder Kratzers auf der Augenoberfläche, widerspiegelt. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich die Vorläuferzellen des Hornhautepithels und ihr Verhalten in einer Situation untersuchte, die die homöostatische Aufrechterhaltung der Hornhaut in Frage stellte.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Durchführung des Hornhautabriebs schwierig ist und Übung erfordert. Bereiten Sie zunächst eine 0,1%ige Florecin-Lösung vor, um den Abrieb unter kobaltblauem Licht sichtbar zu machen, indem Sie 10 Milligramm Florecinsalz mit einer feinen Skala messen. Geben Sie dann das Salz in 10 Milliliter Fosfate gepufferte Kochsalzlösung.Schützen Sie die Florecine-Lösung vor Licht und schütteln Sie sie fünf Minuten lang. Filtern Sie die Lösung steril in eine Pipettenflasche und schützen Sie sie vor Licht. Die Florecin-Lösung kann zwei bis drei Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden.Reinigen Sie die

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier wird die Etablierung eines klinisch relevanten ex vivo Schein-Kataraktchirurgie-Modells beschrieben, das zur Untersuchung von Mechanismen der Verletzungsreaktion von Epithelgeweben in ihrer nativen Mikroumgebung verwendet werden kann.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Dieser Artikel beschreibt ein neues Tiermodell, das entwickelt wurde, um die Anatomie und Histologie der Hornhaut und ihre Heilungsprozesse zu untersuchen. Dieses neue Tiermodell verwendet die mongolische Rennmaus, die eine Hornhaut mit vielen Ähnlichkeiten mit der menschlichen Hornhaut hat.

Mongolische Rennmäuse als Tiermodell der Wundheilung

Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.

Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.

Drei Strategien zur Induktion von neurotropher Keratitis und Nervenregeneration in der murinen Hornhaut

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Lernen Sie eine epitheliale Korneaabnutzung mit okulärem Burr bei Mäusen zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der Hornhautwundheilung. Diese Methode ermöglicht wertvolle Einblicke in die Regeneration des Auges.

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

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